FASDの動物モデルにおける治療的介入としてホイールランニングと環境の複雑さ

サマリー

複雑な環境における心血管運動と刺激的な経験は、げっ歯類の脳内の神経可塑性の複数のメジャーにプラスの利点を持っています。この記事では、車輪走行と環境の複雑さを組み合わせ、これらの介入の制限に対処します」superintervention」としてこれらの介入の実装について説明します。

要約

有酸素運動（広く動物実験で使用される例えば 、ホイール実行（WR））、そのような大人の神経新生、血管形成、およびげっ歯類における神経栄養因子の発現率などの脳内のneuroplasticポテンシャルの積極的な影響多くの対策、。この介入はまた、げっ歯類における催奇形（アルコールすなわち 、発達の暴露）及び年齢に関連する神経変性の負の影響の行動と神経解剖学的側面を軽減することが示されています。環境の複雑さ（EC）は、皮質および皮質下構造における多数neuroplastic利点を産生することが示されており、成人の海馬における新しい細胞の増殖および生存を増加させるために、車輪走行と結合することができます。これら二つの介入の組み合わせは、神経疾患の齧歯類モデルの範囲で実現することができる堅牢な「superintervention」（WR-EC）を提供します。私たちは、WR / ECおよびその構成要素の実装について説明しますヒトにおけるアルコールへの出生前暴露の動物モデルを用いて、ラットにおけるより強力な治療的介入として使用するためのterventions。また、介入のために絶対に必要であり、どれが実験者の質問や設備に応じて変更することができる手順の要素について説明します。

概要

異なる環境で飼育すると、長い神経健康の様々な測定の変化を引き起こすことが知られています。多くの研究は、ダイヤモンドとローゼンツヴァイク（ 例えば 、によって画期的な研究を開始する複雑な環境（EC）で飼育の有益な効果を見て ^1、2）、グリーノー （ 例えば ^{、3、4）。} ECは、脳^5、6、7におけるシナプスおよび細胞変化に紛れもないプラスの効果があることが実証されています。 ECは、同様に、海馬^8,9および視覚野^10、11、腹側線条体^12、13を含む脳の領域の多数に影響を与えることができます脳全体の神経免疫機能として^（14件）。特に注目は、それがECは、樹状可塑^9、13を介して歯状回の成人生まれの顆粒細胞の生存率を増加させることができることが実証された海馬の研究から開発してきました。この最後の点は、原因心血管運動の両方が健康で損傷した脳^{15、16、17、18}に大人の神経新生を促進することを示す文献の成長体に多くの関心を集めています。 （WR）を実行しているホイールは、神経障害または加齢¹⁷のげっ歯類モデルにおいて有益であることが示されている自発的心血管活動の形式^{、19、20を}実現することは容易です。 WRは、成長因子の発現に影響します両方の中枢および末梢神経系^{21、22、23インチ}

「superintervention」（WR-EC）に（その後）WRとECを組み合わせる（ すなわち 、ECで30日間続いWRの12日間）は、海馬成体の神経新生における堅牢な増加と新たに増殖した細胞⁸の生存の増加を提供し、 FASDの動物モデルにおいて、個々の成分によって達成されていない効果（下記参照）。 WR-ECの両方の成分が脳^13（22に総説^WR、24で検討EC）内の構造の多様な配列に影響を与えるので、この介入の実装が容易に神経学の両方の発達とその後の人生発症モデルのげっ歯類モデルに適用することができ障害（ 例えば 、新生児のアルコール暴露、老化、早期の生活上のストレス）。

NT ">思春期や青年期の期間（ すなわち 、生後日30から72）は中WR-ECの統合胎児アルコールスペクトラム障害のラットモデル（FASDs）の負の効果のいくつかを改善することができる⁸研究しているのコレクション。げっ歯類は、樹状の複雑さ^25、小脳発達^26、27および神経免疫応答²⁸だけでなく、学習障害やメモリ²⁹の症状^、30、31のような神経解剖学的措置で9表示著しい赤字を通じて生後日（PD）4からアルコールにさらされていることを実証しましたいくつかの構造はもはやSIGを見なかった。この時間ウィンドウ内のアルコール暴露のさえ減少量（ すなわち 、9を通じてPD 7）は、青年期と成体ラット³²における学習および記憶の欠損につながることができますnificant神経解剖学的障害^27。海馬依存タスクにおける行動障害に加えて- -これらの赤字の多くは、このWR-ECパラダイム^8、33または単独のWR ^25、31への曝露後に緩和されてきました。単独WRが広く用い介入してきたが、WR-ECの組み合わせはまだWR ⁸の比較的短期の利益を維持する能力にもかかわらず、文献で利用されていません。この記事では、青年期にWR-ECの介入の実装について説明します。このパラダイムは、出生後早期のアルコール暴露に関連して使用されるが、脳障害のモデルにおける神経可塑性のために、脳の可能性を評価するために、種々のげっ歯類モデルに導入することができます。

プロトコル

倫理声明：以下のプロトコルは、デラウェア大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1.発達暴露（またはどんちゃん騒ぎのようなエタノール曝露のモデル）

1. PD3に、各動物の性別を決定し、産子数（8匹）および性別分布（雄4：4人の女性）を保持するために、必要に応じて任意の動物をクロス育成各ごみ内で一貫し。
   注：実験的な交絡を避けるために、可能な限り一貫性の産子数や性別分布を維持することが重要です。このプロトコルはゴミあたり8仔（4人の男性と4人の女性）を使用していますが、代替のごみのサイズや性別分布は実験計画のニーズに合わせて調整することができます。
2. 皮下各ごみの中に動物を識別するために、足に黒墨の少量を注入します。
3. 擬似ランダム実験（含む50％アルコールに露出（AE）としてリットルと50％の偽挿管制御（SI）子犬を割り当てますS）または乳を飲むコントロール（SC）（PD 4から任意の挿管、テールクリッピング、または分離プロトコルを受けない動物 - 毎日）計量し、耳パンチを除く9。
   1. 一貫性のあるグループのサイズを保持するには、SCの同腹の2倍の実験リットルを割り当てます。
4. そのホームケージに戻した後、各動物を計量。計量動物は挿管期間（ - 9 PD 4）の間、毎日発生する必要があります。
   1. ダムからの全体のゴミを取り除きます。
   2. 加熱されたパッドの上に子犬を置きます。
   3. 各個々の子犬の重量を記録します。
5. PD4に、各動物を秤量した後、各動物あたり5.25グラム/ kg /日の合計に必要なアルコールの量を算出する（ステップ1.4からの子犬の重量に基づく^）8。
   1. 11.9％エタノール・イン・ミルク代替（体積/体積）などのアルコールを管理します。
6. 午前9時から開始し、一度に母親から1ごみの子犬を削除します。
7. 各AEの子犬にエタノール・イン・ミルクの管理 34アップ。
8. 各SI子犬^8を模造挿管。
9. 繰り返しは、1.5を繰り返します。 1.8を通して。各実験ごみ用。
10. 最初の投与後の二時間は、第二アルコールの用量について（1.8を通じて1.5ステップ）投与手順を繰り返します。
11. 第二アルコール量（ピーク毎日血中アルコール含有量が達成される時点）後の1時間半、収集し、AEとSI仔から遠心血液尾を経由して 、将来の血中アルコール含量分析³⁵のためにクリッピング。
    1. 血液の60μLを収集します。
    2. 1 mLのマイクロ遠心チューブに血液を置きます。 25分間の1.5×gで遠心血液。
    3. 慎重に遠心管からの上清血清を収集し、今後の血中アルコール含有量の分析のために保存します。
12. AEでの看護ができないことから、栄養障害を防止するために、エタノール中のミルクの代わりに牛乳を使用して投与手順（1.8乃至ステップ1.5）を繰り返します子犬。
    1. PD 4に2時間間隔で2補足ミルク用量の合計を実行します。
13. 9 - 繰り返しはPD 5に（ステップ1.11を除く）1.12を介して1.4を繰り返します。
14. PD9の最後の補足ミルク投与後、耳がECケージに識別のためのすべての子犬をパンチ。
    1. ごみ番号または識別子のいくつかの尺度でパンチ耳を座標（偶数番号リットルから動物は彼らの右耳が殴らだろうが、例えば 、コホート内の奇数リットルが自分の左耳パンチになるだろう）。これは、簡単に別の同腹仔からの複数の動物が同じpawmarkパターンを持っている必要があり、ECケージに動物を識別するために行います。

2.離乳

1. 3から2のケージでPD 23、家の上のすべての動物。
   1. 同じケージに収容されたすべての動物は同性であることを確認してください。
   2. 1つのSC、1 SI、およびケージ当たり1 AE動物可能性が含まれます。
   3. ケージの仲間番目の数を最小限に抑えますで同じゴミからです。
   4. すべての動物が食料や水にアクセスすることが可能であることを確認します。

3.ホイールランニング

1. PD30には、WRに動物とケージの半分を割り当てます。ハウス添付のステンレス鋼の走行輪への無料アクセスを持つケージでこれらの動物。
   1. 車輪が総回転数を評価するためのカウンタを持っていることを確認してください。
2. PD 30とPD 36上のすべての動物を計量します。
3. 毎日午前9時に各車輪の回転数を確認してください。
4. 12日間、それぞれの住宅条件の動物を残します。

4.環境の複雑さ

1. 実験動物用のPD 42に相当する日には午前9時前にECケージを準備します。
   1. 30 "×18"×36 "亜鉛メッキ鋼製のケージを取得します。
      注：ケージは、複数のレベルを有する複数のラットの重量を支持することが可能で、標準で満たされるべきです寝具、水のボトルや食品のディスペンサーを取り付けるための複数の場所にしています。
   2. 小説、ケージ内の可変サイズや形状のカラフルなオブジェクトを配置します。
      1. ECケージに6大きなおもちゃを置きます。各おもちゃは同時にと相互作用する3以上のラットのために十分な大きさであることを確認してください。
      2. ECケージに6媒質おもちゃを置きます。同時にと対話するための4匹のラット - 各玩具は3のために十分な大きさであることを確認してください。
      3. ECケージに小さいおもちゃの多く（少なくとも20）を配置します。
      4. （説明を参照してください）ノベルティは、この介入に極めて重要であるなど 、様々な色、形、大きさ、のおもちゃを使用します。
   3. ケージの両端に食品の2皿を置きます。
   4. ケージの両端に水のボトル2本を置きます。
2. PD 42上の午前9時、すべての動物を計量し、ECケージにWR動物を変えます。 12匹の動物 - 各ECケージは9を含める必要があります。
   1. 何の動物が同じpawmarkと耳しゃれの両方を持っていないことを確認しますchのパターン。
3. すべての食品や水の毎日を確認してください。
4. 2日毎に、ECケージからおもちゃを削除し、それらを交換する（ステップ4.1.2に従います。）。
5. 3日ごとに、ECケージを掃除。
   1. ECケージから動物を削除し、2の一時保持ケージに入れて - 3匹の動物。
   2. ケージの底から寝具のすべてを削除します。
   3. この日は、おもちゃの交換スケジュールと一致していない限り（ステップ4.4に従った。）ケージに同じおもちゃを返します。
   4. 食料や水のすべてを交換してください。
   5. ECケージにラットを交換してください。

5.組織を収集

注：組織コレクション（ 例えば 、パラホルムアルデヒドで灌流）とストレージ（ 例えば 、凍結、パラフィン包埋）は、様々な方法で行うことができます。以下に、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS中の4％パラホルムアルデヒド中で4％パラホルムアルデヒドで灌流する工程を説明します）液^8。

注意：パラホルムアルデヒドは発がん性であり、また、皮膚の炎症、アレルギー性皮膚反応、または目の損傷を引き起こす可能性があります。適切な眼/皮膚の保護を使用してください。

1. 軽く動物を麻酔するためにイソフルラン一度に一匹のラットを公開します。
2. 腹腔内ケタミン/キシラジン混合物（ケタミンを10mLと混合し1.5 mLのキシラジン）を2mL / kgのラットを注入します。
   注：ケタミンおよびキシラジンは、注射液のために組み合わせる前には100mg / mLのストック濃度で両方です。
3. （;てpH = 7.2 PBS）、PBS中の4％パラホルムアルデヒド液（pH = 7.2）に続いて、ラットに0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水で動物を灌流、もはや応答して一度。
4. 48時間4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒドで脳とストアを削除します。
5. 2日後、30％スクロース溶液に移し、4℃でPBS中の4％パラホルムアルデヒドを添加しました。

結果

興味のある施策について - WRとEC - スーパー介入の効果を評価するために、我々はその構成要素のそれぞれの効果を見なければなりません。 1〜3（下記） の図は、このパラダイム^8を利用^して 、以前の出版物に登場しました。 図4は、博士論文³⁶で登場しました。これらのデータは、歯状回における海馬成体の神経新生にWR-ECの影響を示しています。すべてのグラフは、平均値から単一の標準誤差を示すエラーバーで、グループの手段を説明します。 図1は、WRの成分は、通常、開発中の海馬のDGにおける細胞増殖を増加させるロバスト可能であることを示し、我々の介入のWR部以下の細胞増殖の増加を示して、早期寿命がストレス、アルコール曝露動物。 図2...

ディスカッション

上記のプロトコルでは、我々は、新生児のアルコール暴露後の神経解剖学的赤字を救うために好都合な介入を実証しました。この介入は、介入の各構成要素の堅牢性のために他の動物モデルにおいて治療薬として使用することができます。 WRの形態における自発的心血管活動は、いくつかの行動の結果^38、39の利益や^、（40に概説）海馬などの脳領域における機能プラスチックの変化を誘導することが示されています。これは、成長因子およびげっ歯類およびヒト²¹の両方で脳実質中の他の神経保護のメカニズムの発現^、41に部分的にあります。これらの効果を補う、ECは、有益な細胞の^{6、11、42、43}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
メスの妊娠期間のロングエバンスラットエン	ビゴ(旧:Harlan、Inc.)		平均同腹児数は8〜10匹の子犬です
ブラックインディアインク	ヒギンズ(Chartpak、Inc.)	44201
注射器と注射針	Becton, Dickinson and Company (BD)	各種	足跡インクの注射用、ミルクアルコール溶液の投与
Ear Punch	Kent Scientific Corporation	INS750076
Running Wheels	Wahmann Labs		Wahmann Running Wheel は販売終了です。ケージごとに1つ。
ECケージ	Martin's Cages, Inc.	R-695
小型EC玩具	アソート
中型EC玩具ア	ソート		1〜2匹のネズミを物体の中/上に収納できるもの
大型EC玩具	アソート		3匹以上のネズミを物体の中/上に収納できるもの