パーキンソン病（PD）では、黒質（SNC）ドーパミン作動性ニューロンは、運動機能障害につながる、退化します。ここでは、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーター配列によって駆動されるeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqのを使用して、それらのトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。
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方法論記事
RNA配列決定およびTH-プロモーター駆動EGFP発現を使用して中脳培養における生活ドーパミン作動性ニューロンの信頼性の高い同定
この記事について
サマリー
要約
パーキンソン病（PD）で動作緩慢、硬直、振戦につながるのSNcにおけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な変性と脳全体広まっ神経細胞の損失があります。蛍光マーカーを使用して、プライマリ腹側中脳（VM）の文化に住んでドーパミン作動性ニューロンの同定は、固定した細胞の免疫染色に頼ることなく、これらのニューロンの選択的脆弱性を研究するための代替方法を提供します。ここでは、単離、解離、および培養マウスVMニューロン3週間。私たちは、その後、（チロシンヒドロキシラーゼ（TH）プロモーターによって駆動される）eGFP蛍光を用いて、培養物中のドーパミン作動性ニューロンを識別します。個々のニューロンは、ガラスマイクロピペットを用いて、マイクロ遠心チューブに回収します。次に、我々は、採取した細胞を溶解し、単一細胞RNA-のSeqライブラリ1、2を生成するために、cDNA合成およびトランスポゾン媒介」tagmentation」を実施しますお尻= "外部参照"> 3、4、5。品質管理チェックを通過した後、単一細胞ライブラリーを配列決定され、その後の分析は、遺伝子発現を測定するために行われます。私たちは、個々のドーパミン作動性および中脳培養物から単離しGABA作動性ニューロンのためのトランスクリプトームの結果を報告します。私たちは、収穫し、配列決定したライブTH-EGFP細胞の100％がドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。これらの技術は、神経科学および分子生物学において広範な用途を持つことになります。
概要
パーキンソン病（PD）は、不治の、年齢関連神経変性疾患です。この比較的一般的な障害の原因はよくわかっていないままです。脳全体広まっニューロンの損失は緩慢、硬直及び振戦の診断臨床的特徴につながる、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの顕著な神経変性（SNC）と、があります。
SNCドーパミン作動性ニューロンを含む初代混合培養物は、パーキンソン病のために特に関連しています。腹側被蓋領域（VTA）ドーパミン作動性ニューロンは報酬と中毒に関与しています。腹側中脳（VM）の一次混合胚の培養は、SNCとVTAのドーパミン作動性（DA）ニューロン及びGABA作動性ニューロンの両方を含みます。 VM初代培養物は、神経保護アッセイに有用であることができ、ドーパミン作動性ニューロンの選択的脆弱性を明らかにすること。形態に基づいて、培養中のドーパミン作動性細胞を同定する信頼できる方法はありません。彼再我々は特定し、収穫単一ドーパミン作動性ニューロンを、および単一セル、高収量RNAシーケンシングライブラリーを構築するための技術を開発します。
我々は、単一のドーパミン作動性および中脳培養物から単離しGABA作動性ニューロンのための代表的なRNAトランスクリプトームデータを報告しています。このプロトコルは、DA / GABAのトランスクリプトームの様々な治療の効果を研究するため、神経保護、神経変性、および薬理学的アッセイのために使用することがで....
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プロトコル
注：全ての実験は、国立衛生研究所により提供される動物の管理と使用に関するガイドラインに従って行った、およびプロトコルはカリフォルニア工科大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。
マウス胎児の脳からの初代ドーパミン作動性細胞培養の1導出
- ソリューションおよび培養培地
- アスコルビン酸原液の調製
- アスコルビン酸の352ミリグラムを秤量。滅菌H 2 Oを20 mLの最終総容量に追加します。 37℃の水浴に入れて溶解します。 -20℃で500μLずつ0.2μmシリンジ先端とストアを介してフィルタリングします。
- パパインストック溶液の調製
- 1×Hanks'-バランス塩溶液（HBSS）で15単位/ mLにパパインを希釈します。完全に混合するまでピペットダウン5回。解剖の日に準備します。
- DNA分解酵素原液の調製
- DNアーゼ20mgを秤量。滅菌H 2 Oを20mLの総最終体積に追加します。 0.2μmシリンジフィルターチップと滅菌フィルター。 1mLのアリコートで-20℃で保存。
- 停止液の調製
- 45 mLの1×HBSS中の10％に5 mLのドナーウマウマ血清を希釈します。 0.2μmシリンジフィルターチップと滅菌フィルター....
- アスコルビン酸原液の調製
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結果
ここでは、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター配列によって駆動されたeGFPを発現するマウスから腹側中脳の神経細胞を培養する培養物から個々の蛍光ニューロンを収穫し、RNA-seqの（ 図1）を使用して、それらのRNAトランスクリプトームを測定するためのプロトコルを報告しています。データを収集し、配列決定したTH-EGFP陽性細胞の100％は、次の3つのDA関連遺伝子の転写物の存在、TH、ドーパデカルボキシラーゼ（DDC）、およびドーパミン輸送体DATに基づいて、ドーパミン作動性ニューロンであることが示されました（SLC6A3）。 RNA-のSeqによって評価されるように、TH-EGFP陽性細胞のすべては、これらの3つの遺伝子を発現しました。各単一細胞RNA-のSeqライブラリーでは6000 - 8000タンパク質をコードする遺伝子は、（ 図2）を検出しました。ドーパミン作動性ニューロンは、ロバストに、いくつかのニコチン性アセチルコリン受容体（nAChR）サブユニット（ <.......
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ディスカッション
ここでは、単一細胞RNA-seqの各セルを研究、蛍光タグを使用して、不均一な集団から単一細胞を単離。私たちは、私たちが収穫し、配列決定し、ライブTH-EGFP細胞の100％は、次の3つのDA関連遺伝子の転写産物、TH、DDCおよびSLC6A3の存在に基づいて、実際にドーパミン作動性ニューロンであったことを報告しています。 RNA-のSeqによって評価されるように、TH-EGFP陽性細胞のすべては、これらの3つの遺伝子を発現しました。これは、各TH-EGFP細胞はまた、ドーパミン作動性ニューロン8、9に関連付けられているイオンチャネルのレパートリーを表示することが示された電気生理学的研究と一致しました。このプロトコルでは、我々は、ライブドーパミン作動性ニューロンのための信頼できるマーカーとしてGENSATチロシンヒドロキシラーゼ-EGFPマウス系統10を利用しました 。 WT文化では現在、それらの形態に基づいて生きてドーパミン作.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
この作業は、米国国立衛生研究所（DA017279、AG033954、DA037743）、マイケル・J・フォックス財団、およびカリフォルニア工科大学のミラード・アンド・ミュリエル・ジェイコブス遺伝学・ゲノミクス研究所に資金提供したカリフォルニア工科大学イノベーションイニシアチブからの助成金によって支援されました。RNA-Seqライブラリプロトコルの最適化と支援を提供してくださったBrian Williamsに感謝します。計算トレーニングを提供してくれた Henry Amrhein に感謝します。バーバラ・J・ウォルド氏には、彼女の機器と実験室スペースを使用してくださったことに感謝します。図書館のシーケンシングと施設管理について、Igor Antoshechkinに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| パパイン | ・ワーシントン・バイオケミカル・コーポレーション | ||
| ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、1x | Gibco | 14175-095 | |
| ドナー馬血清 | サーモサイエンティフィック | SH30074.03 | |
| ウシ血清アルブミン(BSA) | Sigma | A7030-50G | |
| Medium: 神経基礎中 | Gibco | 21103-049 | |
| L-グルタミン、L-アラニル-L-グルタミンの安定化形態を含む培地: GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 0.5 mM 最終濃度。 |
| L-アスコルビン酸 | シグマ | A7506 | |
| B27 | ギブコ | 17504-044 | 50倍ストック溶液、1倍最終濃度。 |
| 35mmガラス底皿 | MatTek | P35GC-1.5-10-C | |
| ポリ-L-オルニチン | シグマ | P4957 | |
| ラミニン | シグマ | L2020 | -20 °Cで保管。20のCµLアリコート |
| デオキシリボヌクレアーゼI(DNase) | Sigma | DN25 | |
| ブルーピペットチップ P1000 | Sorenson Bioscience | Inc. 10130 | |
| 10 mm 浅シャーレ | シャーレ VWR | 25384-324 | |
| 37 >C ウォーターバス | |||
| 37 °C、湿度5%インキュベーター | |||
| 16%パラホルムアルデヒド(PFA) | 電子顕微鏡科学 | 15710 | |
| トリトン X-100 | シグマ | X100-500ML | |
| ドンキーセラム | エクイテック | SD-0100HI | 100%ストック溶液、1%最終濃度。 |
| 標準パターンの外科用ハサミ | ファインサイエンスツール | 14000-14 | |
| 鉗子 - 2x3 歯 | ファインサイエンスツール | 11022-14 | |
| 鉗子 - デュモン #55 | ファインサイエンスツール | 11295-51 | |
| 鉗子 - デュモン #5 | ファインサイエンスツール | 11252-23 | |
| 10x PBS、pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | |
| ダルベッコリン酸緩衝液 (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| 21 G ニードル | BD プレシジョングライド ニードル | 305167 | 100 ニードル |
| マイクロピペット プーラー | サッター インスツルメント | モデル P-87 | |
| マイクロマニピュレーター | サッターインストゥルメント | MP-285 | |
| シーケンシングキット: Illumina シーケンシング用 SMARTer 超低 RNA キット | Clontech | 634936 | 100 rnxs,incl Advantage2PCR Kit |
| オリゴヌクレオチド (12 & micro;M):SMARTer IIAオリゴヌクレオチド(12 & micro;M) | SMARTerキットより | ||
| 逆転写酵素(100単位) | SMARTcribe逆転写酵素 | SMARTerキットから | |
| プライマー1 | 3'CDSIIa入門 | SMARTerキットより | |
| Primer 2 | IS PCR Primer | SMARTerキットより | |
| 50x 2ポリメラーゼミックス | 50x Advantage 2ポリメラーゼミックス | SMARTerキットより | |
| 10x PCRバッファー 10x Advantage | 2 PCRバッファー | SMARTerキットより | |
| RNAスパイク | ThermoFisher | 4456740 | |
| PCRクーラーラック | IsoFreeze PCRクーラーラック | ||
| DNAサンプル調製キット | (イルミナ/ネクステラ) ネクスター | FC-121-1030 | 24サンプル |
| PCR マスターミックス | ネクステラ PCRマスターミックス (NPM) | ネクステラキットより | |
| PCRプライマーカクテル(PPC) | ネクステラPCRプライマーカクテル(PPC) | Nexteraキットから | |
| 蛍光光度計 | Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS DNA BioAnalyzer キット | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| 電気泳動システム | Agilent 2100バイオアナライザー。 | G2938C | |
| マグネットビーズ アジャンクール アンプル | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| RNAse wipes: RNAse Zap wipes | Ambion | AM9786 | Size 100 Sheets |
| Qubit ds HS Assay Kit | Molecular probes | Q32854 | 500アッセイゲル |
| 抽出キット:Qiaquickゲル抽出キット | Qiagen | 28704 | |
| ガラスキャピラリーチューブ | (Kimax-51、外径1.5 - 1.8 mm) | ||
| Microforge | Narishige(または同等品) | ||
| シーケンサー | Illumina HiSeq装置 | ||
| GENSAT チロシンヒドロキシラーゼ-eGFPマウス系統 | MMRRC品番:000292-UNC | ストックTg(Th-EGFP)DJ76Gsat/ミュータントマウス地域研究センター |
参考文献
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and ....
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再版と許可
