ミトコンドリアの構造と機能の研究にショウジョウバエ卵巣

サマリー

ミトコンドリアの機能制御メカニズムを完全に理解するためには、ミトコンドリアの構造と機能の関係の分析が必要です。この論文では、生きたショウジョウバエの卵巣と固定された卵巣のミトコンドリアの構造と機能を研究するための具体的な方法について説明し、実証しています。

要約

ミトコンドリアの機能制御メカニズムを完全に理解するためには、ミトコンドリアの構造と機能の関係の分析が必要です。蛍光顕微鏡法は、生細胞のミトコンドリアの構造と機能を直接評価し、主にミトコンドリア間の分裂と融合を支配する分子によって調節されるミトコンドリアの構造と機能の関係を研究するために不可欠なツールです。この論文では、モデル生物であるDrosophila melanogasterの生組織および固定組織におけるミトコンドリアの構造と機能を研究するための具体的な方法について説明し、実証します。ここで選択される組織はショウジョウバエの卵巣であり、これを分離してex vivoライブ共焦点顕微鏡法に適したものにすることができます。さらに、この論文では、ショウジョウバエの卵巣におけるミトコンドリア分裂タンパク質Drp1を遺伝的に操作する方法を説明し、Drp1によるミトコンドリア分裂がミトコンドリアの構造と機能の関係を調節する関与を研究しています。このような方法の広範な使用は、すでに発表されたデータだけでなく、新しいデータでも実証されています。記載された方法は、栄養素および/または成長因子が生体外でミトコンドリア特性に及ぼす直接的な影響の理解に向けてさらに拡張することができる。ミトコンドリアの調節不全がさまざまな疾患の病因の根底にあることを考えると、遺伝的に扱いやすいモデル生物であるショウジョウバエで開発された革新的な方法は、ミトコンドリアの構造と機能の関係のメカニズムの詳細の理解とミトコンドリア指向の治療戦略の開発に大きく貢献することが期待されます。

概要

彼らは分化した細胞でのエネルギー産生の主な席があるので、ミトコンドリアは、古典的に、携帯大国として記載されています。また、ミトコンドリア等は^1、代謝、発熱、脂質修飾、カルシウム及び酸化還元ホメオスタシスにおける細胞シグナル伝達プロセスのオーケストレーションに重要な役割を演じます。ミトコンドリアは、細胞死^2、ならびに細胞周期調節³での誘導に積極的な役割を果たしています。このような多機能性は、以下の基本的な問題を提起する：a）どのようにミトコンドリアが同時にこれらすべての機能を実行し、異なる機能のために特化されている特定のミトコンドリアプールやサブゾーンb）はありますか？この文脈では、多官能性ミトコンドリアが、個々の細胞内での形状、大きさ、および構造に動的であること、およびミトコンドリアの定常状態の形状は、細胞型間で変化し得ることに留意することが重要です。様々な実験室からの研究の十年オラトリオは、ミトコンドリアの形状、大きさ、構造、総称ミトコンドリアのダイナミクスの変化は、様々なミトコンドリアの機能^4,5,6を維持するために重要であることを示唆しています_。これらの知見は、ミトコンドリアがそれらの構造的ダイナミズムのおかげで、それらの多機能化を達成することができる可能性を提起します。

大規模な努力がミトコンドリアの構造と機能の関係を理解するために進行中です。ミトコンドリアの構造のダイナミズムは、主として、互いに分裂および融合事象を受ける能力によって維持されます。 2つの小さなミトコンドリアの融合が大きくミトコンドリア素子⁷にそれらをマージしながら、大規模なミトコンドリアの分裂は、より小さなミトコンドリアの要素に変換します。また、2ミトコンドリアの一過性の融合は、その内容の混合を可能にするために発生することがあります。内側と外側のミトコンドリア膜の分裂と融合イベントは慎重仕様によって支配されていますタンパク質のIFICセット。コア核分裂機械はDRP1機能もによって調節することができる一方で、特定の善意のミトコンドリアタンパク質（ 例えば、Fis1またはMff1）との相互作用によってミトコンドリアに細胞質ゾルから募集されたダイナミン関連タンパク質1（DRP1）、から構成されていますミトコンドリアの表面⁴上の他のタンパク質。 DRP1は、外膜で動作しますが、その核分裂能力は、同様に内膜に影響を与えます。外側と内側のミトコンドリア膜の分裂のオーケストレーションが十分に理解されていません。 mitofusinsは、外膜⁵の融合を支配しながら、一方で、内膜の融合は、OPA1の活動によりコアに支配されています。ミトコンドリアの対抗核分裂と核融合イベントのバランスは、細胞内の定常状態のミトコンドリア形状を決定します。例えば、ミトコンドリア分裂の抑制は、ミトコンドリアの過活動しながら、完全かつ無競争の融合をもたらすであろうリットルの核分裂はミトコンドリア³の断片化をもたらすであろう。

ミトコンドリアの構造と機能の関係の研究は、主に次の2つの相補的なアプローチを含む：a）は、ミトコンドリア分裂/融合タンパク質の遺伝子操作した後、細胞および生物表現型の分析およびb）ミトコンドリアの構造と機能の直接評価。表現型が原因で二次的な影響を生じる可能性があるとして、遺伝的分析はいつも、（この場合は、ミトコンドリアの分裂/融合タンパク質）手元にある分子の直接の機能を明らかにしない可能性があることに注目すべきです。したがって、直接ミトコンドリアの構造および機能を研究するためのツールを開発し、使用するために極めて重要です。ミトコンドリアの構造のいずれかの評価は、様々な顕微鏡ツールを必要とします。ミトコンドリアの活力を定性的およびquantitatモニターすることができるので、生細胞の蛍光顕微鏡法の使用は、ミトコンドリアの動力学の研究を大幅に進んでいますively適切な蛍光顕微鏡のツールとテクニック^8を使用して。蛍光顕微鏡ベースのツールは、 インビボ ⁹ ミトコンドリアダイナミズムの意義を解明する、ライブ固定キイロショウジョウバエ組織においてミトコンドリアの構造および機能を研究するために開発されてきました。これらおよび関連する方法は、 ショウジョウバエ卵巣でミトコンドリアの構造と機能を研究することを目的に、ここで説明します。

ショウジョウバエの卵巣は、胚腺^10,11内に存在し、それぞれの成体幹細胞から生じる生殖系列および体細胞系統、で構成されています。十六合胞体胚細胞（のGC）は、胚腺（ 図1）から出てくる個々の卵室を形成するために体包細胞（FCS）によってカプセル化されます。 16のGCの一つは、卵母細胞になることを約束します、そして残りの15 GCは卵母細胞チャンバの成長を支援ナース細胞に発展しますそれが載置される前に、卵の成熟を促進します。これらは末端前方包細胞（AFCS）、後方包細胞（PFC類）、及び本体細胞からなるパターン化された上皮細胞層に分化する分裂細胞周期を出る前に、FCの大半は、有糸分裂の9ラウンドを受ける（MBCS） 。連続卵室が早期開発中のFCに由来する細胞を分化さ茎細胞によって接続されています。ミトコンドリア分裂タンパク質DRP1によって規制ミトコンドリアの形状は、積極的にショウジョウバエ卵巣FC層^9,12の正常な発達の間、分化の過程に関与しています。 ショウジョウバエ卵胞細胞層の発達にDRP1の関与を同定するために、これらの研究で使用した方法は、ここに記載されています。

プロトコル

ショウジョウバエの調製（図2Aに示されている必要なツール）

1. 記載された実験のいずれかの場合は、 ショウジョウバエを収集羽化の5日以内（室温、または25ºCに維持）と5を充填したバイアルの中に置いて-これ以上25以下で、7 mLのショウジョウバエの食品（ 材料表を参照してください）各バイアルに飛びます。女性を維持する：1：2の男性の比率を。
2. ショウジョウバエの卵の産生を刺激する顆粒化酵母の少量を振りかけます。 4日 - 2内の実験的操作を実行します。

ショウジョウバエ卵巣の2解剖（図2Aに示されている必要なツール）

1. 室温、25°Cにメディアを解剖ウォーム昆虫（ 材料表を参照してください）。各ウェル中の培地200μLで、皿を解剖8ウェルガラスの3つのウェルを埋めます。
2. COとショウジョウバエの麻酔_{の2バイアルのプラグの下ブローガンの針を置くことによって。フライパッド上に置きます。 5人の女性整理、解剖顕微鏡を使用し、解剖皿の第一のウェルに配置します。ライブ顕微鏡を実行するときに一度に一つのショウジョウバエを扱います。}
3. 解剖顕微鏡の接眼レンズを覗きながら、鉗子の2ペアを使用して腹部から胸部を断ちます。鉗子を使用して、慎重に皿の第2のウェルに腹部を転送します。
4. 後端で腹部を保持し、ゆっくりと鉗子の他のペアで（他の腹部のコンテンツと一緒に）卵巣を押し出すために鉗子のペアを1つ使用します。この試みは失敗、慎重に卵巣を解放するために前方端部に鉗子を挿入することにより、腹部の外骨格を削除する必要があります。
5. 鉗子を使用して、不透明な後端することによって、個々の卵巣を保持する（ すなわち、卵黄に満ちた、後期段階の卵）と皿の第3のウェルに慎重にそれを移動ライブ顕微鏡（ステップ3）のためにそれを処理するためからかうためまたは免疫（ステップ7）を実行するように固定します。
6. 慎重にピンセットで後端によって、それを保持しながら、各卵巣の前端に後方から軽くからかい針を掃引することによって卵巣周囲から保護シースをいじめます。
   注：、からかい時の被害を最小限に抑える針の先端を曲げ、顕微鏡（ 図2A）の倍率を増加させることにより、各卵巣にズームインするには。いじめは、シースを破壊するのに十分効果的であるが、また、慎重ovariolesの整合性を維持するために行われるべきです。

ライブ・組織の顕微鏡3.準備

注：必要なツールは、 図2Aに示されています。

1. ショウジョウバエの解剖前に、ポリI-リジンコーティングされたチャンバーを準備します。この目的のために、coverglにポリIリジン（0.1 mg / mlで）の2つの20μLの液滴を配置しますお尻ドロップのマージを防止するために、互いから合理的な距離でガラス底ペトリ皿（35ミリメートル）の（14ミリメートル、0号）。 37ºCで1時間、プレートを空気乾燥させ、消去可能なマーカーでプレートの下に白いポリI-リジンフィルムのエッジをマーク。
   注：ポリIリジンでコーティングされたチャンバー週間4℃で保存することができます。既にコーティングされてチャンバーを用いた場合は、 ショウジョウバエの解剖を開始する前に、室温までそれを持って来ます。
2. サンプルは以下のように、解剖および取り付けが完了した直後に画像化することができることを確認するために、共焦点顕微鏡上の走査パラメータを設定します。
3. 解剖1を配置し、マークされたポリI-リジンでコーティングされた領域上の卵巣（手順2次および染色し、必要に応じて、次のステップ5）をからかったとovariolesを分離するためにからかい針で卵巣を広げます。トンをカバーするために確認して、卵巣の上に昆虫解剖培地の10-μLのドロップを置きます彼は、領域全体をポリI-リジンでコーティングしました。ペトリ皿をカバーしています。
4. すぐに室温に装着されたサンプルの共焦点顕微鏡検査を行います。
   注：唯一のショウジョウバエは 、解剖処理され、一度に画像化されるべきです。また、顕微鏡は、 ショウジョウバエの組織のための熱ショック環境を模倣します、37℃で実施されるべきではありません。

光退色（FLIP）アッセイ4.蛍光損失はミトコンドリアマトリックスの連続性を評価するために、

注：融合ミトコンドリア構造におけるミトコンドリアのマトリックスの連続性は、中間段階を経て進行を次のミトコンドリア内膜と外膜の完全な融合後に確立されています。ミトコンドリアの分裂は、同じ手順に従いますが、逆の方向に（ 図3A）があります。 FLIPは、ミトコンドリアマトリックスの連続性を評価するために使用することができるタイムラプス顕微鏡ベースの半定量的な方法でありますライブショウジョウバエ卵巣⁹でex vivoでミトコンドリアの最終的な溶融状態（ 図3Aに3と4ステップ）。 FLIPアッセイは、一定の間隔（ 図3AにおけるFLIPのROI）に光退色さミトコンドリアマトリックス中の蛍光分子を発現するミトコンドリアの関心領域（ROI）の小領域として実行されます。その結果、FLIPのROI（ 図3Aの実験ROI）と連続している任意の周囲のミトコンドリアの領域が原因で、連続ミトコンドリアマトリックス中の分子の交換に信号を失うことになります。ここで実証FLIP実験は自由に拡散形でミトコンドリアマトリックスに標的化するためにYFPのタグが付いたヒトチトクロームオキシダーゼVIIIサブユニットのミトコンドリア標的配列を含むmitoYFPを発現するトランスジェニックショウジョウバエで実行されます。以前に報告されたように同様の実験はまた、水戸pUASP-水戸-GFP導入遺伝子を用いて行うことができます ^{9。同様のFLIPプロトコルは、ミトコンドリア内膜（ 図3Aのステップ2）の外側ではなく、融合に起因する連続性を検出することができるように、ミトコンドリアの膜間空間に標的プローブを使用することができます。}

1. 共焦点顕微鏡の画像取得ソフトウェアを開き、「取得」タブ（ 表1）に適切なスキャンパラメータを設定します。個々のタブを開くには、「時系列」「漂白」と「地域」チェックボックスをオンにします。各タブ（ 表1）に適切な取得パラメータの値を入れてください。
   注：この実験は、個々の細胞中の全ミトコンドリア集団から全体の信号を監視するように設計されているように、ピンホールは、開いたままにしておく必要があり。
2. すぐに取り付けられて生きている組織に興味のある分野を特定するために接眼レンズを使用してください。
   注：よくガラスbottomeに広がっているovariolesを選択共焦点顕微鏡は、フローティングovariolesで実行することができないので、D皿、。
3. 関心の選択したフィールドのライブ画像を取得する「ライブ」をクリックします。ライブスキャンを停止するには、「停止」をクリックしてください。
4. 必要に応じて、検出した蛍光シグナルがオフセット値を調整することによって設定のように定義背景に、飽和レベル（「レンジインジケーター」オプションがチェックしたとき赤色の画素が存在しないことによって示される）未満であることを、このような収集パラメータを調整します。
5. ライブスキャンにより取得された画像上の光退色ゾーンを区別するために「地域」タブからベジェ描画ツールを使用して、小さなROIを描画します。
   注： -セル内の全蛍光ミトコンドリアシグナルの50％ROIの大きさは約20であるべきです。
6. クリックして画像取得を行う「実験を開始します。」
7. 材料を参照してください（プロプライエタリまたはオープンソースソフトウェアを使用して蛍光強度を定量化表）。反復的な漂白を対象としているROI（FLIP）から平均信号を記録します。漂白は、同じセル内で行われていないのROI（実験）。実験期間（漂白）の間に、全体的な漂白を評価するためのビューの同じフィールドで別の無漂白のセルからROI;背景領域（背景）にROI。他関心領域における平均信号から得られた平均バックグラウンドシグナルを差し引きます。それぞれの細胞のための最初のプレ漂白剤信号に蛍光シグナルを正規化します。
8. 任意の標準的な作図ソフトウェアを使用して正規化されたデータをプロットします。

蛍光ミトコンドリア色素5.ライブ染色

注：定常状態のミトコンドリアの構造および潜在的には特異的に生細胞および組織中のミトコンドリアに組み込む色素を使用して評価することができます。ライブショウジョウバエ卵巣が蛍光ミトコンドリアでex vivoで染色することができます、ミトコンドリアを視覚化するミトコンドリアの活性酸素種（ミト-ROS）の産生を評価するために、単位質量あたりのミトコンドリアのポテンシャルを評価するために汚れ。これは、ミトコンドリアの電位差色素テトラメチルローダミンエチルエステル（TMRE）とミトコンドリアの質量を表す互換生ミトコンドリア染色（特異的色素の材料表を参照）で共染色することによって達成することができます。

1. 最終的な作業濃度に培地を解剖暖かい昆虫における汚れのストック希釈：ミトコンドリア染色、250 nMのを。 TMRE、50 nMの。水戸-ROS染色、5μM。
2. 解剖後、ステップ2次の卵巣をからかって、解剖皿のウェル中のいずれかの特定の染色溶液の200μLに卵巣を配置します。光から保護するためにアルミニウムホイルで包まれた適切なボックスで覆われた皿で10分間、それらをインキュベートします。 containin 3回連続ウェルにピンセットで慎重にそれらを移動することによって染色された卵巣を洗います汚れのないグラム媒体。
3. TMREと互換性の全体的なミトコンドリアの染色との共染色のために、（その間の任意の洗浄工程なし）、全体的なミトコンドリア染色ですぐに最初のTMREで、次いで染色する上記のプロトコールに従ってください。
4. ステップ3次のポリI-リジンコーティングされたガラス底皿に卵巣をマウントし、適切な走査パラメータ（ 表1）との共焦点顕微鏡の準備、手順4.2から4.4以下。
   注：メディアをマウントで染色したサンプルをマウントしようとしたときに組み込まれた染料からの信号は続きませんでした。
5. タブを開くには、Z-切片チェックボックスをオンにします。それはライブ走査されている間、サンプルの底部に向かってフォーカスホイールを回して、一番下のZ-セクションを定義するために「最初の設定」をクリックしてください。一番上のセクションを定義するために、他方向にフォーカスホイールを移動させながら、同じ操作を行います。
6. クリックして画像取得を行う「実験を開始します。」
7. （ステップ4.7のように）バックグラウンド信号のためのROIと、個々の細胞からのバックグラウンド補正された蛍光強度を定量化し、任意の描画ソフトウェアを使用して、データをプロットします。

DRP1ヌルモザイクの6世代

注：ここで使用されるクローン戦略はDRP1ヌル変異⁹のための遺伝子型がヘテロ接合性であるGFP陽性、表現型の野生型バックグラウンドの背景に緑色蛍光タンパク質（GFP）陰性DRP1ヌルクローンを紹介します。熱ショック誘導性のフリッパーゼ-フリッパーゼ認識対象（FLP-FRT）媒介部位特異的な有糸分裂組換えは、機能的にヌルdrpKG03815対立遺伝子のホモ接合のクローンを作成します。熱ショック誘導性のFLP（hsFLP）とUbiGFPクローンマーカーを有する遺伝子型がhsflpであるのに対し、DRP1の変異を運ぶショウジョウバエの遺伝子型は、drpKG03815 FRT40A / CYOです。ユビキチンNLS-GFP（UbiGFP）FRT 40A / CYO。それ自体の遺伝子型上記の遺伝子型との間の相互の択子孫はhsFLP / +です。 drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A。

1. 2〜3日ごとに新鮮な食品の新しいバイアルにそれらを移動することによって、処女収集のためにショウジョウバエを同期します。新興処女雌を収集するために、毎日pupariatingバイアルを監視します。
2. 夕方に一度午前中に一回、毎日DRP1変異体遺伝子型から、赤目、カーリー翼処女雌を収集し、別のバイアルに入れます。並行して、羽化の5日以内にhsflpとUbiGFPを運ぶ濃い赤い目、ストレート翼で男性のショウジョウバエを収集します。
3. 1：2の男性比：女性で処女雌に男性を追加することで、クロスを設定します。
4. 卵の産生を刺激する顆粒化酵母の少量を振りかけます。
   注：慎重子孫量を増加させるために2〜3日毎に培地の新鮮なバイアルにショウジョウバエを移動し 、バイアル集中を低減します。
5. アンesthetize、ソート、収集ストレート翼、羽化の5日以内に赤の目の女性の子孫。
6. ヒートショックのため、粒状化酵母の少量と小さなと空のバイアルに収集したショウジョウバエを配置し 、ソフト（ヒートショック中に水分を吸収するために）ワイプ。主に卵胞細胞クローンを生成するために、1時間38ºCの水浴中にショウジョウバエでバイアルを置き、二回1時間37ºC日で2日間連続（2ヒートショックの間に少なくとも5時間を可能にします） 、生殖細胞及び濾胞細胞クローンの両方を生成します。
   注：バイアルを完全にプラグのレベルまで水に沈めていることを確認します。
7. 熱ショックは、 ショウジョウバエの不動を行うことができます。彼らは再びモバイルになったときに熱ショックを与えショウジョウバエを室温で1時間回復することができます。
8. クロスと同じ比率でバック男女を追加し、mediuで新鮮なバイアルに移動しますmは、造粒酵母の少量振りかけ。少なくとも5日間、 ショウジョウバエを維持します 。
9. ライブまたは固定された実験のために必要に応じて卵巣を解剖。
   注：UbiGFP熱ショックによりGFP陰性クローンの効率的な誘発を確認するために、陰性対照として使用されるべき発現親ショウジョウバエから単離された卵巣。

7.サイクリンEとミトコンドリアのための共同免疫染色

注： ショウジョウバエサイクリンE（dCyclinE）を検出するために、我々は（ 材料表を参照）dCyclinE ⁹に対して特異的に上昇し、商業的に得られた抗体を使用しています。ミトコンドリアマーカーとして、我々は、ATP-B（ミトコンドリアATP合成酵素複合体のサブユニット^）9に対する抗体を使用します。

1. 室温、25℃にウォーム4％パラホルムアルデヒド（PFA）。 あぶない！パラホルムアルデヒドは有毒です。
   注：開封後アンプル、PFAは、4℃で保存し、7日以内に使用すべきです。 PFAの記憶が劇的定着時ミトコンドリア膜を変化させるメタノールへの酸化を可能にすることができるので、これはあっても、微量で存在します。
2. すぐに解剖した後、（からかいなし）ガラス解剖皿のウェル内に新鮮なPFAの200μLでそれらを置くことによって解剖卵巣を修正。 15分間ヒュームフード中で料理をしてください。 3回連続井戸、1×リン酸緩衝生理食塩水をそれぞれ含有200μL（PBS）にピンセットで慎重にそれらを移動することによって、固定卵巣を洗ってください。
   注：この実験は、ここで停止することができ、試料を1日4ºCで放置することができます。
3. 慎重抗体による抗原へのアクセスを妨げる可能性が保護線維鞘を除去するために、（同様の2.6ステップする）PBS中でより徹底的に卵巣をいじめます。
4. たて0の500μLとマイクロチューブでそれらを置くことによってからかわ卵巣を透過性。5％PBS-トリトンX100（PBS-TX）、25 rpmで揺れながら、30分間それをインキュベートします。
   注：揺動時には、チューブが揺動運動に平行に配置します。このように組織損失で、その結果、組織がチューブのキャップに固執することを可能にする垂直に配置すること。
5. PBS-TXを削除するには、組織は、チューブの底に落ち着くことができるようにラック内マイクロチューブを配置します。視覚的に点検し、必要に応じて、チューブをタップし、底部に任意の浮動組織をダウンさせます。チューブの底の組織は邪魔されずに残っていることを確認して、上部から慎重にソリューションを吸引します。
6. 0.5％PBS-TXに溶解した2％ウシ血清アルブミン（BSA）の200μLを加えることによって卵巣をブロックし、1時間室温でロッカー上でインキュベートします。ステップ7.5に従うことによってブロッキング剤を除去します。
7. 新鮮なブロッキング剤の200μLに一次抗体を追加します：抗ウサギdCyclinE抗体（1：100）および抗マウスATP-のB抗体（1：100）。室温で2時間ロッカー上で組織をインキュベートします。
8. ステップ7.5以下、15分ごとに、PBS-TXで3回卵巣を洗ってください。
9. 新鮮なPBS-TXで、適切な二次抗体の200μLを追加：抗マウスCY3（1：1,000）および抗ウサギ-CY5（1：500）。室温で1時間ロッカー上でインキュベートします。
10. ステップ7.5以下、15分ごとに、PBS-TXで3回卵巣を洗ってください。
11. 最終的なPBS-TXの洗浄に：（千希釈1）DNAを染色するには、ヘキストを追加します。
12. 最後に、1×PBS500μLの組織を残します。
13. 1-mLのマイクロピペットを用いて、200μlのPBSを含むガラス解剖皿の新鮮なウェルにマイクロチューブから免疫染色卵巣を除去します。
14. スライドガラスにグリセロールベースの封入剤の一滴を追加し、封入剤に免疫染色卵巣を一つずつ追加してください。
    注：卵巣が実際に取り付け媒体に転写されていることを確認します。秒を怠りますO組織喪失につながります。
15. 解剖顕微鏡を覗きながら、静かにピンセットで卵巣の不透明な部分を保持しながら、からかい針を使用して、不透明な成熟卵室から透明ovarioles（若い段階）を摘み取ります。マウンティング培地から成熟卵室を削除してください。
16. 封入剤が均一に下に広がっていることを確実にするために軽くスライドとプレスにカバーガラス（22ミリメートル、1号）を配置します。
    注：また、カバーガラス上に押すと、カバーガラスに沿って組織の適切な位置合わせを保証します。最適にそうしないと、小さいステージがそれらの組織の最適な顕微鏡を防止し、マウンティング培地中に浮遊することを可能にします。
17. 15分間のサンプルを空気乾燥し、マニキュアで慎重にカバーガラスの端をシールします。
18. 実験の必要性た （ 表1）あたりの共焦点顕微鏡を実行します。

結果

記載の方法は、生きて固定ショウジョウバエ卵巣（ 図2B）にミトコンドリアの構造および機能を研究するために使用することができます。記載された方法を用いて得られた期待結果のいくつかの例が提供されます。

ショウジョウバエ卵巣の解剖 ：さらに解剖すると、全体のショウジョウバエ （ 図3A）から切断腹部（ 図3B）は、各個々のショウジョウバエから2卵巣を含め、腹部内容物を放出する必要があります。無傷の卵巣は、理想的には、卵管茎を介して相互に接続されたままべき楕円形、白構造（ 図3C及びD中の矢印）として表示されます。各卵巣内ovariolesは、Bを除去して線維鞘（ 図3Cの...

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ

光退色：蛍光サンプルの過度の光退色を防止することは、効率的な共焦点顕微鏡を実行することに絶対に必要です。したがって、接眼レンズを介してサンプルを検索したり、ライブ走査モードを介して画像取得パラメータを設定するために使用される時間は、光退色を最小にするために最小化されるべきです。

組織の損傷 ：ミトコンドリアは、細胞の健康のセンサであると考えられているので、それは記載された方法を用いて得られたデータは、生理学的に関連しており、 ショウジョウバエ卵巣の手続き切開によって引き起こされる過度の損傷を反映していないことを確実にするために極めて重要です。解剖は、組織の損傷を最小限にできる限り迅速に行われ、だけでなく、極端な予防措置とされるべきです。 5 ショウジョウバエ卵巣の解剖やからかいのための平均時間は、私たちの手に（7分に5です秒）。努力は分析から除外される損傷組織を示す卵室を識別するために注意しなければなりません。...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Grace's Media (昆虫解剖媒体)	Fisher Scientific	30611031-2
41 パラホルムアルデヒドAQ	電子顕微鏡科学	50-259-99
Mitotracker Green (全体的にミトコンドリア染色)	Life Technologies	m7514	再構成およびアリコート
テトラメチルローダミン エチルエステル過塩素酸塩	Sigma Aldrich	87917-25MG
MitoSox(Mito-Ros染色)	Life Technologies	m36008
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (ショウジョウバエ食品)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E 抗体 (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB 抗体 [3D5] - ミトコンドリアマーカー	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select 顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック	22-026-252
顕微鏡カバーガラス	フィッシャーサイエンティフィック	12-542-B
マットテックコーポレーション ガラス底 Mircrowell ディッシュ	フィッシャーサイエンティフィック	P35G-0-14-C
活性乾燥酵母	フィッシャーサイエンティフィック ICN10140001
共焦点顕微鏡	カールツァイス	LSM 700
デュモン #5 鉗子	ファインサイエンステクノロジーズ	11251-20
モリアニッケルメッキピンホルダー	ファインサイエンステクノロジー	ズ 26016-12
Minutien	ファインサイエンステクノロジー	ズ26002-15
MYFP(w [*];P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	ブルーミントンストックセンター	7194
フライパッド	フライスタッフ	59-118
ブローガン	スタッフ	54-104
ブローガンニードル	フライスタッフ	54-119
解剖顕微鏡	カールツァイス	ステミ 2000
分析ソフトウェア	カールツァイス	ゼン
解析ソフトウェア	オープンソース	画像 J
Research マクロズーム顕微鏡	オリンパス	MVX10
QICAM Fast 1394 冷却デジタルカメラ、12ビット、モノ	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging