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方法論記事

生物発光イメージングを使用した多剤耐性アシネトバクターバウマニバーン感染症のための抗菌ブルーライトセラピーのインビボでの調査に

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DOI:

10.3791/54997

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2017年4月28日

この記事について

サマリー

>jove_content<多剤耐性(MDR)細菌株によって引き起こされる感染症は、公衆衛生に対する深刻な脅威として浮上しており、代替治療薬の開発が必要となっています。マウスの火傷におけるMDR Acinetobacter baumannii感染症に対する抗菌ブルーライト(aBL)療法の有効性を評価するためのプロトコルを、生物発光イメージングを使用して提示します。

要約

感染症は、罹患率と死亡率の重要な原因であり続けて焼きます。多剤耐性(MDR)細菌の増加出現は、従来の抗生物質治療の頻繁な故障につながっています。代替治療薬が緊急MDR細菌に取り組むために必要とされています。

革新的な非抗生物質のアプローチは、抗菌青色光(ABL)は、MDR感染に対する有望な効果を示しました。 ABLの作用のメカニズムはまだよく理解されていません。一般的に( 例えば 、鉄を含まポルフィリン、フラビンなど ) が順番に光化学プロセスを経て、細胞傷害性活性酸素種(ROS)を生成ABLによって励起されて自然に細菌における内因性光増感発色団を発生すると仮定されています。

別の光系抗菌アプローチとは異なり、抗菌光線力学療法(APDT)は、ABLの治療は、外因性photosensitizの関与を必要としませんえー。それを有効にする必要があるすべては、青色光の照射です。そのため、それが簡単で安価です。 ABL受容体は、細菌における内因性細胞増感ではなく、DNAです。したがって、ABLは、直接宿主細胞におけるDNA損傷を引き起こす紫外線C(UVC)照射、より宿主細胞にはるかに少ない遺伝毒性であると考えられています。

本稿では、火傷のマウスモデルにおけるMDR アシネトバクターバウマニ感染症のためのABL療法の有効性を評価するためのプロトコルを提示します。設計生物発光菌株を使用することにより、我々は、非侵襲的に生きている動物で、リアルタイムでの感染の程度をモニターすることができました。この技術はまた、動物における感染の空間分布を監視するための有効なツールです。

概要

頻繁にあるため、皮膚熱傷の報告されたバーン感染は、罹患率と死亡率1の重要な原因であり続けます。火傷感染症の管理はさらにによる抗生物質の大規模な使用に多剤耐性(MDR)菌株2の増加出現によって侵害されています。一つの重要なMDRグラム陰性菌の最近の戦いの傷と関連することが知られており、ほぼすべての利用可能な抗生物質に耐性3ですアシネトバクターバウマニ 、です。負傷病巣におけるバイオフィルムの存在は5,4が報告されており、持続感染8,9を引き起こし、抗生物質および宿主防御6,7に対する耐性を悪化させると考えられています。したがって、pressinがありますグラム代替治療の開発のために必要。 抗生物質耐性菌と闘うための最近発表された国家戦略では、抗生物質に代わる治療法の開発は、米国10の政府によるアクションとして注目されています。

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プロトコル

細菌培養物の調製

  1. ブレインハートインフュージョン(BHI)50mLの遠心管に培地7.5 mLを加え。シードのA.バウマンニの BHI培地中の細胞、その後は18時間オービタルインキュベーター(37℃)でのA.バウマンニ培養物をインキュベートします。
  2. 遠心機で5分間3,500×gでの細胞の培養、上清を除去し、そしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中でペレットを洗浄します。
  3. 新鮮なPBS中の細菌ペレットを再懸濁し、完全に懸濁液をピペット。
  4. 細菌懸濁液100μLを収集し、新鮮なPBSを使用して1:10希釈を作ります。
  5. 1.5mLのセミミクロキュベットに希釈を移し、600nmで(OD 600 nm)の波長での光学密度(OD)を測定します。
  6. 希釈の測定OD 600nmの値と希釈係数(10)に従ってPBSで元の(未希釈)懸濁液のOD 600-NMを算出します。
  7. 目の調整600 nmでの ODまでPBSで電子オリジナルサスペンション= 0.6(10 8 CFU / mlの細胞密度に相当します)。

生物発光Aによって引き起こさバーン感染の2マウスモデル。 バウマニ

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結果

以前に12、17報告したように、我々は使用のA.バウマニ株は、MDR臨床分離株です。細菌株はluxCDABEオペラ 11のトランスフェクションによって生物発光を作りました。 図1Aは、代表的なマウスからの連続した細菌のルミネセンス画像が5×10 6 のA.バウマンニで感染燃焼および細菌接種後24時間で単ABL露光にさらさ示します。代表的なマウス皮膚火傷標本の組織学的切片のグラム染色は、(24時間接種後に採取)感染熱傷( 図1B)の表面上のA.バウマンニバイオフィルムの存在を実証しました。 図1Aに示されるように、細菌の発光はほとんどABLは、(送達照射の60分にあった360 J / cm 2の露.......

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ディスカッション

ABLは、感染症を治療するための新規な方法です。その作用機序は、化学療法とは全く異なっているので、それは理学療法の詳細です。抗菌効果を媒介する薬剤は、青色光照射(400から470 nm)です。青色LEDの開発により、我々は、MDR感染症のための効果的かつシンプルな光系抗菌アプローチへのアクセスを得ました。

このプロトコルでは、我々は、MDR、 のA.バウマニの生物発光歪みによる火傷感染症のマウスモデルの開発を記載しています。生物発光バクテリアを使用することで、感染の程度は、非侵襲的生物発光イメージングを経由して生きている動物でリアルタイムに監視することができます。細菌の遺伝子操作生物発光株と低光イメージング技術の使用は、抗菌治療中にリアルタイムで感染症を監視するための効率的な技術を作成します。この方法は、感染症の調査に使用することができます他の微生物種によって引き起こされると、他の部位に位置。抗菌アプローチの有効性評価に加えて、この方法はまた、感染の進行を追跡するために使用することができます。

このマウスモ.......

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、米国陸軍医学研究取得活動協力協定(CIMIT No. 14-1894 to TD)および国立衛生研究所(1R21AI109172 to TD)の下で、Center for Integration of Medicine and Innovative Technology(CIMIT)によって部分的に支援されました。YWは、ASLMS学生研究助成金(BS.私たちは、YWの共同メンターシップについて、ウェルマンセンターのTayyaba Hasan博士に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
IVIS PerkinElmer Inc, Waltham, MAIVIS Lumina Series III前臨床 in vivo イメージング
発光ダイオード LEDVieLight Inc, トロント, カナダ 415 nm照明用光源
電力/エネルギー計Thorlabs, Inc., Newton, NJPM100D光放射照度検出器
マウス チャールズリバーラボラトリーズ、マサチューセッツ州ウィルミントンBALB / c7-8週齢、17-19 g体重
Acinetobacter baumannii Brooke Army Medical Center, Fort Sam Houston, TXClinical isolateEngineered luminescent strain
Insulin SyringesFisher Scientific14-826-79BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes for injection
塩化ナトリウムFisher Scientific7210160.9% 塩化ナトリウム
リン酸緩衝生理食塩水、1x 溶液Fisher ScientificBP24384 多くの生体分子処置で使用される標準的なリン酸緩衝液
ブレインハートインフュージョンフィッシャーサイエンティフィB11059細菌培養培地
ファルコン15mLコニカル遠心チューブフィッシャーサイエンティフィック14-959-70C細菌懸濁遠心分離機用
ベンチトップインキュベーションオービタルシェーカーラボラトリーサプライネットワーク株式会社、アトキンソン、ニューハンプシャー州 インキュシェーカーミニバクテリアの培養用
接種ループフィッシャーサイエンティフィ22-363-605  マウスの火傷面に細菌のイノクラムを塗りつける
Fisher Scientific Redi-Tip ピペットチップ、1-200 µLフィッシャーサイエンティフィック02-707-502ピペットチップ
サーモサイエンティフィック Sorvall Legend X1 CentrifugeFisher Scientific75-004-220細菌懸濁液分離用
Brass BlockSmall Parts, Inc., Miami, FL10 mm x 10 mm マウスの火傷の作製に
エクストリームドラゴンPBI /ケブラー高熱手袋スーペリアグローブワークスリミテッド、チークトワーガ、ニューヨークPBI83514 耐熱手袋
グライナー皿シグマアルドリッチ株式会社LLCP5112-740EA35ミリメートル×10 mm
Corning デジタル ホット プレートCole-Parmer Instrument Company, LLCUX-84301-6510" x 10", 220 VAC, 沸騰水用 
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参考文献

  1. Gibran, N. S. Summary of the 2012 ABA Burn Quality Consensus conference. J Burn Care Res. 34 (4), 361-385 (2013).
  2. Sommer, R., Joachim, I., Wagner, S., Titz, A. New approaches to control infections: anti-biofilm strategies against gram-negative bacteria.....

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再版と許可

タグ

マウスモデル多剤耐性菌活性酸素種光化学プロセス宿主細胞の安全性