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方法論記事

TGF-βを含むプロトコルを使用したナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 +誘導された調節性T細胞（iTregs）のインビトロ分化における

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DOI：

10.3791/55015

⸱

2016年12月30日

 ,  ,  , 
1Unit of Computational Medicine, Center for Molecular Medicine, Department of Medicine Solna, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, & Science for Life Laboratory

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、in vitroでのナイーブCD4 + T細胞から人為的な制御性T細胞（iTregs）の再現性の生成と表現型を説明しています。 Foxp3誘発のための異なるプロトコルは、それぞれのプロトコルを用いて得られた特定のiTregの表現型の研究を可能にします。

要約

制御性T細胞(Treg)は、自己構造に対する免疫反応を抑制し、自己免疫疾患を予防する末梢耐性の不可欠な部分です。Tregsを養子として移植する、または癌のTregを枯渇させるための臨床的アプローチが進行中であり、有望な初期結果が得られています。

自然に発生するTreg（nTreg）の数は非常に限られているため、in vitro誘導Treg））iTreg）を使用して特定のTregの特徴を研究することは有利です。今日まで、制御性T細胞を描写するための最良の特異的タンパク質マーカーは、絶対的に特異的ではないものの、転写因子FOXP3です。末梢誘導性Tregの非冗長な役割を含むTregsの重要性にもかかわらず、iTregを生成するためのプロトコルは、特にヒト細胞について現在議論の余地があります。したがって、このプロトコルでは、さまざまなTreg誘導因子(TGF-βとIL-2のみ、またはレチノイン酸、ラパマイシン、または酪酸との組み合わせ)を並行して使用して、ヒトナイーブT細胞からのヒトCD4+FOXP3+ iTregsのin vitro分化について説明します。また、フローサイトメトリーとqRT-PCRによるこれらの細胞の表現型についても説明します。

これらのプロトコルは、FOXP3およびその他のTregシグネチャー遺伝子の再現性のある発現をもたらし、一般的なFOXP3制御メカニズムの研究だけでなく、特定の因子の影響を描写するためのプロトコル固有の効果の研究を可能にします。iTregは、Treg誘導の分子メカニズムだけでなく、さまざまな表現型の側面を研究するために利用することができます。詳細な分子研究は、比較的大きな細胞数を得ることができることによって促進されます。 >jove_content<これらのプロトコルによって生成されたiTregは、TGF-βとレチノイン酸およびラパマイシンによって誘導されたiTregが優れた抑制活性を示す抑制機能の研究などの機能アッセイにも使用できます。ただし、iTregの抑制能力はnTregとは異なる場合があり、適切な制御の使用が重要です。

概要

CD4 + CD25 + FOXP3 +調節性T細胞（Tregは）他の免疫細胞を抑制し、末梢寛容の重要なメディエーターであり、自己免疫及び過度の炎症1を防止します 。 Tregの重要性は、重度の全身性の自己免疫疾患につながるTregの損失による `master'のTreg転写因子フォークヘッドボックスP3における変異にヒトの疾患immunodysregulationの多発性内分泌腺の腸のX連鎖症候群（IPEX）、（FOXP3）が例示されます早い年齢で致死。しかし、Tregは、彼らはまた、特定の設定2での抗腫瘍免疫を妨げることができますように免疫系における両刃の剣として作用します。 Treg細胞の数および機能の治療的操作は、したがって、多数の臨床研究の対象です。癌では、Tregの枯渇が望ましい可能性があると臨床的アプローチのいくつかの成功は、さらなる研究3を奨励しています。自己免疫および炎症性疾患において、セベにおけるTregの治療効果に加えてRALマウス疾患モデル、-host病（GVHD）4 対移植片を防ぐために、養子のTreg転送の最近の最初の人の試験- 7と1型糖尿病8は非常に有望な結果を示した治療の安全性を評価すること。

11 -当然のTreg（nTregs）を発生することは健康に9を維持する上で非冗長本質的な機能で、胸腺由来tTregsおよび末梢誘導さpTregsを備えます。しかし、nTreg番号は、ナイーブT細胞前駆体12からのin vitroで誘導したTreg（iTregs）の補完的なアプローチを奨励し、限られています。まだiTregsの安定性は、おそらくFOXP3遺伝子座13におけるいわゆるTreg細胞に特異的脱メチル化領域（TSDR）における脱メチル化の欠如のため、懸念のままであり、いくつかの研究は、 生体内でのTregを誘導することを示している14以上の安定しています。

現在までに、FOXP3は、最良のタンパク質メートルのままTregのためのarker人間従来のCD4 + CD25-T細胞は一過性の活性化15,16時FOXP3の中間レベルで発現するので、それは絶対に固有のものではありません。重要な進歩は、FOXP3発現の調節を明らかにしたが、多くは、特にヒト細胞におけるFOXP3の誘導、安定性及び機能に関する発見されていません。 nTregsの違いにもかかわらず、in vitroでの FOXP3誘導さ+ CD4 + T細胞はFoxp3誘発の分子機構を研究するためのモデル系として使用することができ、 中に、より類似しているiTregsの生成を可能にする将来のプロトコルを開発するための出発点として将来的に養子移入戦略の適用可能性が生成されたTregを、 生体内 。

そこに人間iTregsを誘導する全く`金standard'プロトコルはなく、現在のプロトコルは、 生体内でのTreg誘導条件を模倣することに基づいて開発されている：2（IL-2、インターロイキン）およびトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）シグナル伝達は、 インビボ 17 における Foxp3誘発のために重要であり、全トランスレチノイン酸（ATRA） -腸管関連樹状細胞によってインビボで産生される-頻繁Foxp3誘発を増強するために使用されます21 - 試験管 18インチ我々は、酪酸22、最近マウスのTreg誘導23,24を増強することが示された腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸を使用して、追加のヒトTregの誘導プロトコールを開発しました。我々はまた、最近、それが促進することが知られている阻害剤、後者はラパマイシン（mTORの）の臨床的に承認された哺乳類の対象となる、TGF-β、ATRAの組み合わせを使用し、22ラパマイシン することにより、in vitroでの優れた抑制機能付きiTregsの世代のための新しいプロトコルを確立しました人間のTreg拡張25,26の間にFOXP3のメンテナンス。

この方法は、再現性の中での説明しますFOXP3の発現のプロトコル固有のパターンや、その他のTreg署名分子を明らかにするために、フローサイトメトリーおよび定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（QRT-PCR）により、異なる条件のセット、およびその後続の表現型を用いて、ヒトCD4 + FOXP3 + iTregsのインビトロでの生成CD25、CTLA-4、EOS、ならびにIFN-γおよびSATB1 式 22の抑制など。生成された細胞集団は、一般的なFOXP3レギュレータに関するあるいは酪酸またはラパマイシンなどの特定の化合物に特有の効果を研究するか、抑制活性に関する機能アッセイまたは分子的研究のために使用することができます。 Treg細胞の分化を駆動する分子メカニズムのさらなる理解は、具体的Treg細胞の発生と機能に関与する分子を標的とする自己免疫または癌における今後の治療的アプローチのために非常に関連性があります。

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プロトコル

ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を新たにカロリンスカ大学病院（スウェーデン）から購入した匿名の健常ドナーのバフィーコートから単離しました。実験のための倫理的許可は、ストックホルムの地域倫理審査委員会（RegionalaetikprövningsnämndenIストックホルム）から入手した、スウェーデン（承認番号：2013/1458から31/1）。

末梢血から1 T細胞の単離

  1. PBMCの単離
    1. 15ミリリットル密度遠心分離培地50mlチューブ（軟膜あたり5チューブ）中（例えばフィコールなど）ソリューションを事前横たわっていました。予め室温に暖かいです。
    2. 180ミリリットルのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（室温）でバフィーコートを埋めます。新鮮な血液を使用する場合は、等量のPBSで血液を希釈します。
    3. 側への傾斜チューブとチューブ当たりの血液を希釈〜35ミリリットルでゆっくりオーバーレイ密度遠心分離媒体。 medの密度遠心分離のいずれかの混合することなく、非常に慎重に血液を追加します。イウム相と血液層。
    4. ブレーキなしの室温で1150×gで遠心分離20分。層の混合を防止するための媒体加速度に低いとブレーキなしに、可能であれば遠心機を操作してください。
    5. 密度遠心分離媒体及びプラズマ相との間のPBMCを含む白色リングを取り出します。 （2ミリリットルプラスチックパスツールピペットで1時間で5ミリリットルピペットと2回）新しい50mlチューブに移します。可能なプラズマと密度遠心分離媒体限り少なくしてください。赤い赤血球ペレットに触れないでください。
    6. ウォッシュのPBMC。 50mlチューブ（軟膜あたり4管）へのPBMCを分割します。 PBSで50mlにそれぞれを埋めます。
    7. 室温で10分間遠心分離450×gで。
    8. 削除し、上清を捨て、10で1チューブに細胞をプールミリリットルRPMI / 10％ウシ胎児血清（FCS）培地、よく懸濁します。細胞塊は、40μmのセルストレーナーを介して、株細胞に存在している場合。
    9. 広告のT175細胞培養フラスコ中の細胞を移しますエラン細胞。培地40mlでチューブを洗浄し、細胞（50ミリリットルの合計）と結合します。必要に応じて、（ステップ1.4を参照）、フローサイトメトリー分析のためにアリコートを削除します。通常、CD4 + T細胞は、リンパ球ゲート内の細胞の約30〜40％を含み、ナイーブT細胞は、ドナーに依存して、CD4 + T細胞の約30〜60％を含みます。
    10. 37℃/ 5％CO 2で45〜90分間、フラスコを敷設中で細胞をインキュベートします。このステップは、プラスチック接着によって単球を枯渇されます。これは必須ではありませんが、次の手順でPBMCの量あたりの割合T細胞の収量を増加します。
    11. 細胞を再懸濁し（50ミリリットルでは、媒体のフラスコに含まれている）とよくフラスコの底に細胞層をすすぎます。等しく（50ml×2回）のチューブに細胞を分配する（前のチューブは、同じドナーのために再使用することができます）。 50ミリリットルの新鮮なRPMI / 10％FCS培地でフラスコをすすぎ、そして同じ2チューブに均等に移します。
      注：PBMCをチューブに敷設して4℃で一晩保存してもよいです側は、または理想的には、直接T細胞の単離のために使用されます。
  2. 磁気活性化細胞選別によってnTregの分離
    1. ヒト血清アルブミン、PBS中2mMのEDTA（w / v）の0.5％：分離バッファを準備します。常に4℃でバッファを保持します。あるいは、ヒトアルブミンに、ウシアルブミンを使用します。
    2. 再懸濁し、トリパンブルーの存在下で、自動または手動の細胞カウンターでのPBMCを数える（小さな血小板をカウントされません）。細胞塊は、40μmのセルストレーナーを介して、株細胞を観察している場合。
    3. 室温で10分間、450×gで遠心分離したPBMC。
    4. 再懸濁細胞を10 7のPBMCあたり90μlの単離緩衝液（1 mlのピペットを用いて）、単一細胞懸濁液を得ました。元の50mlチューブ（軟膜あたり2チューブ）で細胞を保管してください。
    5. 、10 7個の細胞当たり2μlのCD25ビーズを加え混合し、4℃で15分間インキュベートします。
    6. 30ミリリットルにPBSで記入してください。 4で10分間、450×gで遠心分離6; C。
    7. LSカラム（軟膜あたり2）を準備します。3ミリリットルの分離緩衝液で平衡化し、フロースルー捨てます。チューブをさらにカラムをリンスするために再使用することができます。
    8. チューブあたり3ミリリットル単離緩衝液中で細胞を再懸濁し（1ミリリットルピペットで）。転送LSカラムに細胞、新鮮な15ミリリットルチューブに流れる集めます。
    9. 2ミリリットルの単離と50ミリリットルチューブをすすぎ、それぞれをバッファリング。列にバッファをすすぐ転送します。
    10. 3ミリリットルの分離と洗浄カラムの2倍は、それぞれをバッファリング。カラムは、新しい液体を追加する前に、滴下停止されるまで、必ず待ってください。ストアは、後の工程のために4℃で流れます。
    11. 磁石から列を削除します。 15ミリリットルチューブに列ごとに3ミリリットル単離緩衝液で溶出2回。
      注：ドナーあたり2カラムからの溶出液を組み合わせることができます。液体中に列を浸漬しないでください。
    12. 新しいLSカラム（軟膜あたり1列）を準備し、平衡化します。列に1.2.11からの溶出液を転送します。廃棄可能流れます。溶出液は盛りを過ぎを持っていた後、カラムを通るdは、チューブを洗浄し、3ミリリットル単離緩衝液でカラムを3回洗います。
      注：第二列は決定的純度を高めるために必要とされます。
    13. 磁石から列を削除します。 3ミリリットルの単離緩衝液を用いて溶出CD25 ++ "nTregs" 2倍。
    14. 4℃で10分間、450×gで遠心分離します。完全に上清を取り除きます。
    15. 15mlのT細胞培養培地を用いて4℃で10分間、450×gで遠心分離し、細胞を洗浄します。完全に上清を取り除きます。
    16. 100 IU / mlのIL-2を、それぞれを補充0.5 mlのT細胞培養培地中で細胞を再懸濁し、。 24ウェルプレートに移す細胞。培地0.5ミリリットル（+ 100 IU / mlのIL-2）でチューブを洗浄し、24ウェルプレートに結合します。
    17. （ステップ1.2.2のように）nTregsをカウントします。収量は通常、軟膜あたり約1-4×10 6のTregです。 T細胞培養培地+ 100 IU / mlのIL-2で1~2×10 6細胞/ mlにTregの密度を調整します。
    18. 使用するまでCO 2、37℃/ 5％のTregをインキュベートします。
  3. 磁気活性化細胞選別によってナイーブCD4 + T細胞の単離
    注：細胞の単離を進めるために、ステップ1.2.8-1.2.10から流れるください。何nTregsが単離されなかった場合あるいは、PBMCから直接進みます。
    1. 50ミリリットルチューブ内のTreg枯渇PBMCのドナーあたり2チューブを兼ね備えています。室温で50 mlにPBSで記入してください。
    2. 室温で5〜10分間、200×gで遠心分離したPBMC。削除し、上清を捨てます。 50ミリリットルのPBSで細胞を再懸濁し。
    3. 二回ステップ1.3.2を繰り返します。
      注：PBS洗浄には、以下の負の単離キットを用いて除去されることはありませんこれは、血小板の除去のために重要です。血小板は、この低速遠心分離で上清中に残ります。血小板枯渇は顕微鏡スライド上の個々のステップで監視することができます。手順は、室温でPBSと遠心分離を用いて実施されなければなりません。
    4. 50ミリリットルのPBSで再懸濁したPBMC。ステップ1.2.2のように細胞をカウントします。
    5. 4℃で10分間、450×gで遠心分離したPBMC。 10 7個の細胞あたり40μlの単離緩衝液（4℃）で上清と再懸濁細胞を捨てます。
    6. 10 7細胞あたりのナイーブCD4 + T細胞ビオチン抗体カクテルIIの10μLを加えます。
    7. 混合し、4℃で10分間インキュベートします。
    8. 4℃で40ミリリットルのPBS（4°C）を添加すること、および10分間、450×gで遠心分離して細胞を洗浄します。 10 7個の細胞あたり80μlの単離緩衝液中で上清と再懸濁細胞を除去します。
    9. 10 7個の細胞当たり抗ビオチンマイクロビーズの20μlを添加します。よく混合し、4℃で15分間インキュベートします。
    10. 冷PBSで50mlに記入し、そして4℃で10分間の遠心分離器450 XG。
    11. 準備LSカラム（3 mlの単離緩衝液で平衡化）。 PBMCを、多くの赤血球が含まれている場合、列の過負荷を回避するために、最大で250×10 6 PBMCを、以下のために1列を使用します。
    12. 上清および再懸濁Cを削除します3ミリリットル単離緩衝液でells。 LSカラムに細胞を移します。 15 mlチューブに、ナイーブCD4 + T細胞を含む、フロースルーを収集します。
    13. 2ミリリットルの分離緩衝液でチューブを洗浄します。カラムに移します。
    14. 3ミリリットル単離緩衝液でカラム3回洗浄します。カラムは、新しい液体を追加する前に、滴下を停止するまで、必ず待ってください。
    15. （ナイーブCD4 + T細胞）と4℃で10分間遠心450 XGを通る流れを取ります。列は廃棄することができます。
    16. 完全に上清を取り除きます。室温で15ミリリットル媒体、遠心分離機450×gで10分間で細胞を洗浄し、完全に上清を除去します。
      注：分離バッファはカルシウムイオンをキレートするEDTAを含有するので、T細胞活性化を阻害します。任意の刺激アッセイの前に、完全に分離緩衝液を除去し、15 mlの培地で細胞を2回洗浄します。
    17. 1mlあたり2~3×10 6細胞にT細胞培養培地中で細胞を再懸濁。適切なフラスコOで細胞を休まRよくインキュベーターで一晩。細胞を刺激アッセイのために直接使用される場合、それらを培地で一回洗浄します。
  4. 純度コントロール染色
    1. 20μlに、それぞれ〜50,000細胞（PBMC; nTregTnaïve）を取ります。
      注：TnaïveとnTregパネルの両方を染色する場合、2つのサンプルそれぞれを取ります。
    2. 例えば、楽器に合わせて2倍に濃縮抗体プレミックスを（PBS中）準備：Tnaïveパネル：CD4-PerCPを1：5; CD45RA-FITC 1時10分、CD45RO-PE 1：5、CD8-eFlour450 1：8。 Tregのパネルについては、CD25-PE、1：10でCD45RO-PEを交換してください。
      注：CD25-マイクロビーズとは異なるエピトープを認識するのみ、特定のCD25抗体は、CD25マイクロビーズを用いて単離しnTregsを染色するために使用することができます。
    3. 20μlの細胞に20μlの抗体プレミックスを追加します。また設フローサイトメトリーのために、各蛍光色素（ 例えば 、陽性細胞を含有したPBMCの試料を使用）、未染色試料のための単一の染色を準備GSと補償。
    4. 暗所で室温で15分間インキュベートします。
    5. 200μlのPBSで各サンプルを入力し、5〜10分間の遠心分離450×gで。
    6. 蛍光活性化セルソーティング（FACS）バッファー（=分離バッファEDTAなし）で細胞を取り、フローサイトメトリーによって分析します。ナイーブCD4 + T細胞の純度は通常> 95％である（ 図2参照）。

2. Tregの誘導文化

  1. 刺激メディアとプレートの調製
    1. 準備し、前加温T細胞培養培地：2mMのL-アラニル-L-グルタミンを補充した無血清造血媒体。
    2. サイトカイン、刺激抗体および化合物ストック濃度を準備します。
      1. IL-2ストック溶液を準備します。40万IU / mlで滅菌濾過し（耐酸性フィルター付き）を100mM酢酸に（167μgの/ mlで使用される多くの活動が1μgのあたり2,400 IUである場合には、プロバイダに確認）。 0.5ミリリットルチューブを結合滅菌低タンパクに一定分量は、パラフィルムで密封し、長期保存のために-80℃でドライアイスや店舗にフリーズまたは-20までの3ヶ月間℃です。
      2. （10μgのバイアル、無担体のために）TGF-β1のストック溶液を準備します、遠心分離TGF-β1粉末（千XG 3分）4 mMのHClを100μlのを追加ストック溶液を調製し（耐酸性フィルターで濾過滅菌） 100μg/ mlので、完全に溶解することができます。渦。 0.5ミリリットルチューブを結合滅菌低タンパクに各アリコート5μlを、パラフィルムで密封までの6ヶ月間-80℃でドライアイスや店舗で凍結します。
      3. ATRAストック溶液を準備しますDMSO中の20mg / mlの（66.6ミリモル）で粉末を溶かします。最大1年間-80℃で、光から保護DMSOと店舗アリコートでさらに希釈により10mMのストック溶液を準備します。 ATRAは、光、熱、空気に敏感です。
      4. ラパマイシンストック溶液を準備しますアリコート中1mg / mlの（1.11 mM）のDMSO中で、店舗を-80℃で1年まで。
      5. 滅菌超純H 2 Oおよび滅菌フィルターで0.908 M（0.1 mg / mlで）ストック：酪酸ナトリウムストック溶液を準備します。 -20℃で小分けし、店舗。
    3. 表1のように T細胞培養培地中で4倍に濃縮プレミックス（ウェルあたり50μl）を準備します。
    4. 前の日に、抗CD3抗体でコートプレート。コートは、65μlの/ウェル、PBS中5μg/ mlの抗CD3抗体で96 Uウェルプレートからのウェルの数を希望します。ホイルでプレートをラップし、4℃で一晩インキュベートします。
      注：96ウェルプレートのマージン井戸を使用しないでください。大きなウェルを使用することができるが、U字形のウェルは、実験を横切る面積当たり同じ細胞数の使用を容易にします。より多くの細胞が必要な場合は、培養後、ウェルの必要量をプールします。通常、膨張の4~6日後に、2ウェルの各サンプルは、フローサイトメトリー分析及びRNA分析のために十分です。
      1. メッキの日に、すぐにメッキする前に、抗削除ウェルから-CD3ソリューション。 200μL/ウェルのPBSでウェルを埋めます。 PBSを削除してください。 200μL/ウェルのPBSで洗浄を繰り返します。完全にPBSを削除し、直ちにプレートを使用しています。
    5. プレートを準備します（マージン井戸を使用しないでください）：
      1. 各ウェル、4倍の抗CD28 / IL-2プレミックスの50μlを添加するために（すべてのiTregs用）、50μlの4倍のTGF-β1のプレミックスまたは50μlのT細胞培養物（「刺激されていない」細胞を除いて、T細胞培養培地を追加） 「刺激のみ」モック制御、50μlの4倍ATRA、ATRA /ラパマイシンまたは酪酸プレミックス（適用）または媒体のための媒体
      2. 200μlのPBSで、マージンウェルを含め、すべての空のウェルを埋めます。 37℃/ 5％CO 2でのプレ暖かいプレート。
  2. めっきのためのナイーブT細胞を準備します
    1. 休止細胞た後、15ミリリットルチューブに移す、チューブに予め温めたT細胞培養培地とプールでフラスコ/井戸を洗い流します。 T細胞培養培地で15ミリリットルにチューブを埋めます。
    2. 室温で10分間、450×gで遠心分離細胞。
    3. 培地を除去し、2.2から2.6×10 6 / mlの密度に新鮮な、予め温めておいたT細胞培養培地中の細胞を取ります。ステップ1.2.2のように細胞を計数し、必要に応じて濃度を調整。
    4. （2.1参照）、50μlの細胞/ウェル（110,000-130,000細胞/ウェル）を調製し、刺激プレートに細胞を加えます。各ウェルは現在、全量200μlを含める必要があります。
    5. 光からATRAを保護するためにアルミホイルでプレートを包み、所望の期間、37℃/ 5％CO 2でインキュベートします。
  3. Tregの誘導文化を監視
    1. 光学顕微鏡（40倍の倍率）によりTreg細胞培養を監視します。約2日目から3に、増殖細胞の小さなクラスターは、後の時点で大きなクラスターにマージする、見えるようになるはずです。ラパマイシンで増殖した培養物は、一般的にあまり成長します。また、 図3を参照してください。
    2. 所望の時点で、RNA Eのサンプルを取りますxtractionまたは表現型フローサイトメトリー（下記参照）。細胞増殖と後の時点では、1各ウェルそうでないRNAのための1×10 5 -1×10 6個の細胞それぞれおよびフローサイトメトリーのために3×10 5 -1×10 6個の細胞を取り、十分です。
  4. FOXP3の安定性を評価します
    1. 2.1および2.2に記載したように、以前22,27記載のようにiTreg表現型の安定性を評価するために、抗CD3および抗CD28再刺激なしで、またはのいずれかでT細胞培養培地中でさらにT細胞培養培地で2回iTregsを洗い、そして培養iTregs 。 FOXP3の安定性に及ぼす影響を研究するために、このような50 IU / mlのIL-2のように、サイトカインを追加します。
    2. 所望の時点で、22,28に記載されているように（下記参照）表現型フローサイトメトリー、及びTSDRのメチル化分析、RNA抽出のためのサンプルを取ります。

定量RT-PCRによるiTregsの3表現型分析

  1. の準備サンプル
    1. 所望の時点で、サンプルあたり1×10 5×10 1〜6の細胞を、RNA抽出のために取ります。 RNaseフリー1.5mlチューブに移し、細胞を、そして5分間、500×gで遠心。
    2. 必要に応じて、上清の一部を除去し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）または類似の分析のために凍結します。細胞から完全に残りの上清を取り除きます。 RNA抽出に直接進むか、2週間まで-80℃-20℃のドライアイスや店舗に細胞ペレットを凍結します。
    3. 標準的なプロトコルに従ってRNAを抽出し、FOXP3と（例えばRPL13Aなど）ハウスキーピング遺伝子のための定量RT-PCRを行います。また、他のTregシグネチャー遺伝子の発現（例えば`のTreg up'遺伝子IL2RA、CTLA4、IKZF4、および`のTreg down'遺伝子IFNG、SATB1）を測定。

フローサイトメトリーによる4表現型分析

注：このプロトコルは、染色のために最適化されています3×10 5 -1×10 6個の細胞で96Uウェルプレートフォーマットでる。ウェル当たり少ないセルがある場合は、以下に説明するように、いくつかの井戸やプールで始まります。

  1. セル再刺激（オプション）
    1. 細胞内サイトカイン染色が望まれる場合、ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）のパルス細胞/タンパク質輸送の阻害剤の存在下でイオノマイシン。
      注：この手順は、前述したiTreg培養でFoxp3発現には影響しませんが、他のマーカーが変更されることがあります - 例えば、CD4をダウンレギュレートされます。
    2. 100、イオノマイシン（株式を5μg/μl）を1：1ブレフェルジン原液：T細胞培養培地中に10倍ブレフェルジンA / PMA /イオノマイシンのプレミックス（ウェルあたり20μl）を準備し1300、PMA（株12.35μgの/μlで、前-dilute 1：1235）1：予め希釈株式の100。
    3. 染色の前に4時間、1の最終濃度を得るために、ウェルあたり20μlのブレフェルジンA / PMA /イオノマイシン10倍ミックスを追加：1,000ブレフェルジンA、0.5μM（375 ngの/ ml）のイオノマイシン、10ng / mLのPMA。
    4. 37℃/ 5％CO 2で4時間インキュベート
  2. 表面染色
    注：ここで提案パネルが提案です。他のパネルは、目的と機器設定の抗原に応じて使用することができます。
    1. 氷上でPBSを冷却します。 （0.5％ヒト血清アルブミン、HSAを含むPBS）FACS緩衝液を用意し、氷上で冷却します。 BSAまたはFBSはHSAの代わりに使用することができます。
    2. プレート-再染色プレート内の細胞：細胞を再懸濁しピペットでと（後染色手順における波及を防ぐために）各ウェルの周りにも無料のものを残して、新しい96Uウェルプレートに細胞を移します。所望の細胞数よりも少ないが、元のウェル中に存在している場合は、よく染色に複数の井戸を再懸濁する前に、上清の一部を削除し、プール。
    3. 遠心機のプレートを室温で10分間、400×gで。
    4. 上清を取り除きます。 、廃棄ボックスに上清を注ぐ逆さまプレートを残しますダウンし、すぐに（プレートを後戻りせずに）吸収紙に一度のプレートをタップします。その後、すぐにプレートを元に戻します。渦プレートは、液体の残りの中に細胞を再懸濁します。
    5. 再懸濁：25μlの表面染色プレミックス（FACS緩衝液で5 CD25-PE 1：20、CD4-PerCPを1）を追加します。
      注：また、それぞれの抗原陽性の細胞を含むサンプルで使用される蛍光色素のそれぞれのための単一の染色を含みます。および染色されていないサンプルが含まれます。これらは、機器の補償のセットアップのために必要とされるであろう。また、補償ビーズを使用しています。
    6. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。
    7. 4℃で10分間、200μlのPBS、遠心プレート400 XGを追加し、ステップ4.2.4で説明したように、上清を除去します。渦プレート。
    8. 二回ステップ4.2.7を繰り返します。
  3. 生存率染色
    注：固定/透過処理した後に死んだ細胞が十分で除外することはできないので、生存率染色は、不可欠ですFSC / SSCおよび非特異的シグナルを生じさせる可能性があります。固定可能な生存色素を使用しなければなりません。
    1. 再懸濁細胞130μlの生存能力染色プレミックス（固定可能な生存性色素eFlour780 PBS中1：1400）で、すぐには、マルチチャンネルピペットを用いて細胞を懸濁します。
      注：また、数日間培養例えば、非刺激T細胞、死細胞を含む生存性色素のための単一の染色を含めたり、製造者の指示などによって熱を加えることによって細胞を死滅させます。これらは、補償のために必要とされるであろう。
    2. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。
    3. 4℃で10分間、400×gで遠心分離プレート。ステップ4.2.4のように上清を取り除きます。渦プレート。
    4. 200μlのFACS緩衝液で満たします。手順を繰り返し4.3.3。
    5. 200μlのPBSで記入してください。手順を繰り返し4.3.3。
  4. FOXP3染色緩衝液セットと細胞内染色
    1. 各ウェルについては、準備：150μlの修正/パーマバッファ（修/パーマ濃塩酸を希釈entrate 1：希釈剤で4）。 850μlの1×透過化バッファー（超純H 2 Oで10倍の透過化バッファ1:10に希釈します）。
    2. 150μlの修正/パーマバッファに、再懸濁細胞をボルテックスした後、すぐにピペットで再懸濁します。すぐに細胞塊の固定を避けるために再懸濁することが重要です。
      注意：固定バッファは、パラホルムアルデヒドが含まれており、取り扱い、適切に廃棄されるべきです。
    3. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。
    4. 100μlの冷PBSを追加します。 4℃で10分間、850×gで遠心分離します。
      注：このステップで以降の遠心分離速度は細胞の喪失を回避するために増加されます。固定後、細胞が見えなくなると、ステップ4.2.4に記載したように、遠心分離、細胞の損失を最小限にするために終了した直後に注意が、上清を除去するために取られるべきです。
    5. ステップ4.2.4で説明したように上清を取り除きます。渦プレート。
      注：染色はこの段階で一時停止することができます。にこの場合は、200μlのPBSで2回細胞を洗浄します。その後、250μlのPBS中に取り、光から保護し、4℃で保存してください。細胞は透過化を進め、その後、数日間保存することができます。直接透過化を続けしかし、最適な結果が達成されます。
    6. ボルテックスした後、200μlの透過化バッファを追加します。 4℃で10分間、850×gで遠心分離します。ステップ4.2.4で説明したように上清を取り除きます。渦プレート。
    7. 再懸濁する200μlの透過化バッファーを追加します。
      注：ここでは、サンプルは細胞内染色し、アイソタイプコントロールサンプルに分割することができます（各サンプルの半分を奪います）。細胞数が制限されている場合、プールされたアイソタイプサンプルは（離れサンプルプールの10〜20μLを取る）を調製することができます。また、試料は、蛍光マイナスワン（FMO）を制御するために取ることができます。
    8. 4℃で10分間、850×gで遠心分離します。ステップ4.2.4で説明したように上清を取り除きます。渦プレート。
    9. 再懸濁ペレット（予混合）44μlの透過化緩衝液+ 1μlの正常マウス血清は、非特異的結合をブロックします。
      注：次のステップで使用される抗体は、マウスアイソタイプである場合、これが適用されます。例えば、ラット由来するような他の抗体は、使用される場合、（ 例えば、ラット血清）をブロックするための適切な血清を含みます。
    10. 暗所で15分間、4℃でインキュベートします。
    11. 抗体を追加します。
      注：特定のロットのための抗体濃度をお問い合わせください。それぞれの蛍光色素を用いた表面抗原に対する抗体（ 例えば 、CD4）とステップ4.2で行われていない場合、また、補償のための陽性細胞を含むサンプルで使用される蛍光色素のそれぞれのための単一の染色が含まれます。
      1. （単一染色、染色されていないサンプルを、アイソタイプコントロールサンプルとFMOのコントロールを除いて）サンプルに15μlの抗体プレミックスを追加します：サンプルあたりのプレミックス：0.7μL（0.35μgの）抗インターフェロンγ（IFN-γ）-FITCを（再刺激後に該当する場合）、2.3μL（0.115μgの）CTLA-4ブリリアントバイオレット421、2μL（0.05μgの）抗FOXP3-APC、10μlのPBS。
      2. 、コントロールサンプルをアイソタイプ4.4.11.1に用いられる抗体のためのような抗体の同じ量を用いて、15μlのアイソタイプ抗体プレミックスを追加するには、次のサンプルあたりのプレミックス：0.7μL（0.35μgの）マウスのIgG1 KアイソタイプコントロールをFITC（該当する場合）、0.58 μL（0.115μgの）マウスIgG2a-BV421アイソタイプ、0.5μL（0.05μgの）マウスのIgG1 KアイソタイプコントロールAPC、13.2μlのPBS。
      3. FMOのコントロールのために、PBSで各1抗体を置き換え、4.4.11.1のように抗体を追加します。
    12. 暗所で4℃で30分間インキュベートします。
    13. 200μlの透過化バッファーを追加します。遠心分離機は、ステップ4.4.8のように上清と渦を削除します。一回繰り返します。
    14. （ボリューム使用される機器に応じて）およびフローサイトメーター上で、理想的にはすぐに、取得の冷FACS緩衝液中で細胞を再懸濁し。

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結果

図1は、実験のスキームを示します。 図2は、磁気的に分離されたナイーブCD4 + T細胞およびnTregsのための代表的な純度制御染色を示します。

Fのigure 3Aはゲート戦略フローサイトメトリーを示し、 図3Bは 、代表FOXP3及びCD25が示さiTregまたは制御条件下での培養6日目に染色フローサイトメトリーを示しています。 in vitroでの刺激を受けると、ほとんどの細胞は、ラパマイシンの存在下で還元されたCD25をアップレギュレートします。唯一のiTreg誘導因子の添加下で、FOXP3 +細胞の明確な集団はまた、iTregの条件の下でCD25 +細胞内に濃縮されている、明らかになります。 図3Cは、暗いク...

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ディスカッション

記載されているプロトコルは、人間のナイーブCD4 + T細胞からのヒトCD4 + FOXP3 + iTregsの堅牢な誘導を可能にします。それは我々が優れたin vitroでの抑制機能22とiTregsの誘導のために、TGF-β、ATRA及びラパマイシンの組み合わせを使用して、最近記載新しいプロトコルが含まれています。他の公表されたプロトコルに比べ、他の利点は、単独で、IL-2の存在下で活性化されたコントロール細胞と一緒に、特定のiTreg誘導因子の効果の直接比較を可能にする、異なるプロトコルによって並列に異なるiTreg集団の誘導であります。記載されているプロトコルは、低ドナー変動とFOXP3の再現可能な誘導を可能にします。このプロトコルでのナイーブCD4 + T細胞を、磁気活性化細胞選別により単離したが、蛍光活性化細胞選別も可能であるしています。このプロトコルにナイーブCD4 + T細胞の予想収量は、典型的には5〜10％の間でありますしかし、強くドナー（年齢）に依存し、赤血球の高い画分が存在する場合にも、下に表示され...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

Nina Nagelは、ビデオ撮影と実験準備中の技術支援に感謝しています。細胞内FOXP3染色プロトコルの支援を提供してくださったEva-Maria Weiss氏と、nTreg分離プロトコルを確立してくださったElisabeth Suri-Payer氏とNina Oberle氏に感謝します。Matilda ErikssonとPeri Nooriは、ラボラトリーマネジメントで認められています。

Funding: A.S.は第7回欧州共同体フレームワークプログラム内のMarie Curie Intra European Fellowship、Dr. Åke Olsson Foundation、KI研究財団の支援を受けました。A.S.とJ.T.はCERIC(Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease)助成金の支援を受け、J.T.はVetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264)の支援を受けました。 Torsten Söderberg Foundation、FP7 STATegra、AFA Insurance、Stockholm County Council。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
オールトランスレチノイン酸シグマ アルドリッチR2625-50MG  
抗ヒト Foxp3-APC クローン 236A/E7eBioscience17-4777-42
抗ヒト CD25 マイクロビーズMiltenyi Biotec130-092-983
抗ヒト CD25-PEMiltenyi Biotec130-091-024
抗ヒト CD28 抗体、LEAF 精製 バイオレジェンド302914
抗ヒトCD3抗体 LEAF Purified Biolegend317315
anti-human CD45RA, FITCMiltenyi Biotec130-092-247
anti-human CD45RO PE clone UCHL1BD Biosciences555493
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1BD Biosciences345770
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2aeBioscience48-0086-42 
抗ヒトCTLA-4(CD152)、クローンBNI3、mIgG2ak、ブリリアントバイオレット421BD Biosciences562743
抗ヒトIFN-g FITCクローン4S。B3 です。mIgG1keBioscience11-7319-81 
ブレフェルジンA含有溶液:GolgiPlugBD Biosciences555029
cDNA合成キット:SuperScript VILO(逆転写酵素)cDNA合成キットInvitrogen11754-250
密度遠心分離媒体:Ficoll-PaqueGE healthcare17-1440-03
DMSO 99.7%Sigma AldrichD2650-5X5ML
FBS、熱不活化Invitrogen10082-147
固定生存率色素、eFluor 780  eBioscience65-0865-14または65-0865-18 
Foxp3染色バッファーセットeBioscience00-5523-00注意:パラホルムアルデヒドが含まれています。抗体と組み合わせたキットでも購入できます。77-5774-40 抗ヒト Foxp3 染色セット APC クローン: 236A/E7 セット
GlutaMAX (200 mM L-アラニル-L-グルタミン)Invitrogen35050-061
ヒトナイーブ CD4 T 細胞単離キット IIMiltenyi Biotec130-094-131
ヒト血清アルブミン 50 g/LBaxter1501057
Streptomyces conglobatus 由来イオノマイシン >98%Sigma AldrichI9657-1MG
MACS LSカラムMiltenyi Biotec130-042-401
マウス IgG1 K アイソタイプコントロール APC クローン: P3.6.2.8.1eBioscience17-4714-42
マウス IgG1 K アイソタイプコントロール FITC 50 μgeBioscience11-4714-81 
マウスIgG2aアイソタイプコントロール、ブリリアントバイオレット421、クローンMOPC-173BD Biosciences563464
パスツールピペットプラスチック、個別包装Sarstedt86.1172.001  
PMA ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテートSigma AldrichP1585-1MG 
ラパマイシンEMD(メルク)553210-100UG
組換えヒトIL-2、CFR&D202-IL-050/CF
組換えヒト TGF-β 1, CFRnD240-B-010/CF
RNA 単離キット: RNAqueous-Micro KitAmbionAM1931  
RPMI 1640 ミディアム インビトロジェン72400-054 
酪酸ナトリウムシグマアルドリッチB5887-250MG 
T細胞培養液:X-Vivo 15培地、ゲンタマイシン+フェノールLonza04-418Q
TaqMan Gene Expression Assay、FOXP3(ベストカバレッジ) Applied Biosystems4331182; アッセイID: Hs01085834_m1注意: パラホルムアルデヒド
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage)Applied Biosystems4351370; アッセイID: Hs04194366_g1  注意:パラホルムアルデヒドが含まれています
TaqMan Gene Expression Master mixApplied Biosystems4369514
された

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