の生産、結晶化と構造決意 C。ディフィシル PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

Summary

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) は、ヒトの病原体であるClostridium difficileから分泌されるメタロプロテアーゼであり、有望な薬物標的です。ここでは、このタンパク質の産生と構造決定に必要なすべての方法について説明します。

Abstract

新しい治療法は、人間の健康に対する主要な脅威であるクロストリジウム・ディフィシル感染症を治療するために必要とされています。C.ディフィシルメタロプロテアーゼPPEP-1は、病原体の病原性を低下させる阻害剤の将来の開発の標的です。生物物理学的および構造的特性評価、および阻害剤のスクリーニングを行うには、高純度で活性なタンパク質が大量に必要になります。私たちは、大腸菌を発現宿主として用いることにより、結晶化と構造決定に十分な量と純度のタンパク質を産出するPPEP-1の効率的な生産と精製のためのプロトコールを開発しました。さらに、マイクロシーディングを使用して、PPEP-1の高度に相互成長した結晶をX線回折分析に適した整然とした結晶に成長させることができます。また、この方法は、他の組換えタンパク質を作製したり、相互成長結晶を産生する他のタンパク質の構造を研究したりするためにも使用できます。

Introduction

クロストリジウム・ディフィシルは、院内抗生物質関連下痢症の感染¹の主要な原因の1つです。このグラム陽性嫌気性細菌は、糞口経路を介して、その胞子の形を介して送信されます。過去十年間で、新しい''流行''または''の超''株（ 例えば BI / NAP1 / 027）北米、欧州²の新規感染と死亡率の大幅な増加を引き起こしました。 C.ディフィシル -関連疾患（CDAD）は、高い致死率³との生活を脅かす大腸の炎症です。症状は、下痢⁴から偽膜性大腸炎^5、しばしば致命的な中毒性巨大結腸⁶の範囲です。

毒性株が多剤耐性であり、再発率が⁷高いほどCDADの治療は困難です。抗生物質メトロニダゾール、fidaxomicinまたはバンコマイシンが含まれる、またはrepetitiのモーメント療法でvely再発例の糞便細菌叢移植。新しい治療戦略が緊急に^8を必要とされています。いくつかの進展がC.ディフィシル毒素B ^9をターゲット^に 、治療用モノクローナル抗体Bezlotoxumabとして記録され、最近成功した第III相臨床試験を通過し、FDAやEM....

Protocol

1.クローニングとデザインを構築

1. 私はんでを使用してのpET28aベクターにシグナルペプチドを含まないクロストリジウム・ディフィシル PPEP-1の（ 大腸菌用）のコドン最適化配列のクローンを作成し、[以下、組換えPPEP-1（rPPEP-1）という名前のアミノ酸27から^220、11]およびXho I制限部位、3 '末端（得られたベクターをpET28a-NHIS-rPPEP-1）の停止コドンを持つ（ 図1）。これは、精製の間にタグを削除できるようにトロンビン切断部位（ 図1）とN末端6xHisタグタンパク質（NHIS-rPPEP-1）を生成します。プラスミドは、選択のためのカナマイシン耐性カセットを含みます。クローニングに用いたプライマーは、他の場所¹⁴に記載されています。

図1：expreの構築をpET28a-NHIS-rPPEP-1およびSDS-PAGE分析の概略図

Results

rPPEP-1を大腸菌 BL21（DE3）スター（ 図1C）で最も高い収率で、いくつかの大腸菌株で過剰発現されます。最初のNiNTAアフィニティークロマトグラフィー工程後の6xHisタグが正常タンパク質の大部分から切断することができ、第二のNiNTAステップで未消化のタンパク質を完全にトロンビン消化されたタンパク質（ 図1D）から分離することができます。 S200 16/600カラムタグなしrPPEP-1に時折有するモノマーとして移動するには、おそらく二量体種（ 図2A）に対応する面し。タンパク質は、（ 図2B）純粋であり、収率は大腸菌培養物1 Lから約50mgのタンパク質です。 rPPEP-1は、多くの場合、リン酸を含む、様々な条件（ 図3）に結晶化します。結晶は、非常にすべての条件に相互成長しているので、結晶の最適化を実行しなければなりませんでし.......

Discussion

X線結晶学は、依然としてタンパク質²⁸の3次元近接原子分解能構造を決定するための最速かつ最も正確な方法です。しかし、十分に秩序単結晶の成長を必要とします。これらは、多くの場合、取得するのが困難であり、結晶状態は、人工的です。しかしながら、他の方法によって決定されたもので、X線結晶学によって決定されるタンパク質構造の比較は、特にNMR、一般的に非常に良い一致を示しています。 PPEP-1の場合には、最近²⁹公開されたNMR構造は、S-ループの移動度を含む当社の結晶構造¹⁴との優れた一致を示しています。

このプロトコルは、構造研究およびタグなしrPPEP-1の結晶化および構造決意のためのN末端HisタグrPPEP-1タンパク質の産生および精製を記載します。単結晶は、この場合、成長させることが困難であり、特殊microseeding手順を必要としました。トンで彼は我々がPPEP-1の結果を議論し、プロトコルが任意の他のタンパク質の生産および結晶化のために適合させることができる方法を示しますセクション以下。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genes / Vectors / cell strains
pET28a ベクター	Merck-Millipore	69864	Thrombin cleavable N-terminal His-tag
E. coli strain BL21 (DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003	RNase H 欠損
コドン最適化遺伝子 (for E. coli)	Geneart(サーモフィッシャーサイエンティフィック)	カスタム	アミノ酸27-220
名前	会社	カタログ番号	コメント
Chemicals
酵母抽出	物任意の
トリプトン
消泡剤 B	Sigma-Aldrich	A5757	水性シリコーンエマルジョン
寒天	任意の
Kanamycin	任意の
IPTG	AppliChem	A1008
Tris-HCl	AppliChem	A1087	バッファーグレード
NaCl	任意の		バッファーグレード
DNaseI	AppliChem	A3778
イミダゾール	AppliChem	A1073	バッファーグレード
トロンビン	Sigma-Aldrich	T4648
リン酸アンモニウム 二塩基性	Sigma-Aldrich	215996
グリセロール 100%	any		純度の高いグレードの
ショ糖	Sigma-Aldrich	84097
液体			結晶の貯蔵および凍結冷却のための
任意名前	会社	strongカタログ番号	コメント
機器(一般)
振とうインキュベータ	ー20		°C-37 >C
ガラス製品	、任意の		バッフル、三角フラスコ(50ml-2.8L)、
大容量培養液の遠心分離	12Lの処理容量のための遠心
処理機、Vibra-Cell VCX500	Sonics	SO-VCX500	、またはその他の超音波処理機/細胞破壊器
超遠心分離機	最大150,000 x g
NiNTA スーパーフロー樹脂	Qiagen
Empty Glass Econo-Column	Bio-Rad	7371007	またはその他の空のガラスまたはプラスチックカラム
サイズ排除クロマトグラフィーカラム HiLoad Superdex 200 16/600	GE Healthcare	28989335
クロマトグラフィーシステム Äkta 清浄機	GE ヘルスケア	28406264	またはその他のクロマトグラフィーシステム
透析チューブ Spectra/Por 3	Spectrum Labs	132724
透析チューブ クロージャー	Spectrum Labs	132738
限外ろ過ユニット(濃縮器) 10,000 NWCO	任意の
UV-Vis分光光度計
名前	会社	カタログ番号	コメント
機器(結晶学)
少量ピペット0.1-10 & マイクロ;
容積式ピペット Microman M10	Gilson	F148501
晶析ロボット	96
ウェル結晶化プレート TTP IQ 3つのタンパク質ウェル付き	TTP	4150-05810	またはその他の96ウェル結晶化プレート
24ウェルCombiCloverジュニアプレート	イエナバイオサイエンス	EB-CJR
クリスタルクリアシーリングテープハ	ンプトンリサーチ	HR3-511
ガラスカバースライドハ	ンプトンリサーチ	HR3-225
商業結晶化スクリーン:SaltRx、インデックス、PEG /イオン、クリスタルハ	ンプトンリサーチ
商業結晶化スクリーン:ウィザード、PACT++、JCSG++イ	エナバイオサイエンス	多様な
JBSビーズフォーシードイ	エナバイオサイエンス	CO-501
CrystalCap SPINE HT(ナイロンループ)	ハンプトンリサーチ	多様な	ループサイズ0.025 mm - 0.5 mm
CrystalCapバイアル	ハンプトンリサーチ	HR4-904
低温フォームデュワー800ミリリットル	ンプトンリサーチ	HR4-673
極低温フォームデュワー 2 L	ハンプトン研究	HR4-675
バイアルクランプ、ストレートハ	ンプトン研究	HR4-670
クリスタルワンド磁気、ストレート	ハンプトン研究	HR4-729
クライオケーン 6 バイアルホルダー	ハンプトン研究	HR4-711
クライオスリーブ	ハンプトン研究	HR4-708
クライオケーンカラーコーダー - ホワイト	ハンプトンリサーチ	HR4-713
	任意の
ストレートマイクロ鉗子	シール		。 etc.
鍼灸針	any		例えば薬局から
ステレオ顕微鏡			any結晶化プレートの検査や結晶実装、最大160倍の倍率