の生産、結晶化と構造決意 C。ディフィシル PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

Summary

Proline-proline endopeptidase-1 (PPEP-1) は、ヒトの病原体であるClostridium difficileから分泌されるメタロプロテアーゼであり、有望な薬物標的です。ここでは、このタンパク質の産生と構造決定に必要なすべての方法について説明します。

Abstract

新しい治療法は、人間の健康に対する主要な脅威であるクロストリジウム・ディフィシル感染症を治療するために必要とされています。C.ディフィシルメタロプロテアーゼPPEP-1は、病原体の病原性を低下させる阻害剤の将来の開発の標的です。生物物理学的および構造的特性評価、および阻害剤のスクリーニングを行うには、高純度で活性なタンパク質が大量に必要になります。私たちは、大腸菌を発現宿主として用いることにより、結晶化と構造決定に十分な量と純度のタンパク質を産出するPPEP-1の効率的な生産と精製のためのプロトコールを開発しました。さらに、マイクロシーディングを使用して、PPEP-1の高度に相互成長した結晶をX線回折分析に適した整然とした結晶に成長させることができます。また、この方法は、他の組換えタンパク質を作製したり、相互成長結晶を産生する他のタンパク質の構造を研究したりするためにも使用できます。

Introduction

クロストリジウム・ディフィシルは、院内抗生物質関連下痢症の感染¹の主要な原因の1つです。このグラム陽性嫌気性細菌は、糞口経路を介して、その胞子の形を介して送信されます。過去十年間で、新しい''流行''または''の超''株（ 例えば BI / NAP1 / 027）北米、欧州²の新規感染と死亡率の大幅な増加を引き起こしました。 C.ディフィシル -関連疾患（CDAD）は、高い致死率³との生活を脅かす大腸の炎症です。症状は、下痢⁴から偽膜性大腸炎^5、しばしば致命的な中毒性巨大結腸⁶の範囲です。

毒性株が多剤耐性であり、再発率が⁷高いほどCDADの治療は困難です。抗生物質メトロニダゾール、fidaxomicinまたはバンコマイシンが含まれる、またはrepetitiのモーメント療法でvely再発例の糞便細菌叢移植。新しい治療戦略が緊急に^8を必要とされています。いくつかの進展がC.ディフィシル毒素B ^9をターゲット^に 、治療用モノクローナル抗体Bezlotoxumabとして記録され、最近成功した第III相臨床試験を通過し、FDAやEMAと承認のために提出されました。さらに、新たな抗生物質は臨床試験¹⁰の異なる段階で、現時点ではテストされています。

効果的な治療法を開発するために新たな治療標的を識別しなければなりません。ノックアウト株におけるPPEP-1の欠如がCの病原性を減少させるように、そのような有望な標的である最近C.ディフィシルプロテアーゼプロリン-プロリンエンドペプチダーゼ-1（;; CD2830 / Zmp1 EC 3.4.24.89 PPEP-1）が発見されました生体内 ^11インチ ディフィシル 。 PPEP-1は、それらのC末端で2 C.ディフィシルアドヘシンを切断分泌型メタロプロテアーゼ^12,13で¹³こうして付着bacterを解放人間の腸上皮からIA。したがって、 クロストリジウム・ディフィシルの固着性と運動性の表現型の間のバランスを維持することに関与しています。 PPEP-1に対する選択的阻害剤を開発するために、それはその3次元構造の詳細な知識が不可欠であるその基質を認識する方法を理解します。私たちは、基質ペプチド¹⁴でPPEP-1単独および複合体中の第1の結晶構造を解決しました。 PPEP-1は、2プロリン残基¹⁵との間に選択的に切断ペプチド結合最初の既知のプロテアーゼです。それは二重ねじれた方法で基板を結合し、プロテアーゼ活性部位^14をカバー^する S-ループに位置する残基の延長脂肪族-芳香族、ネットワークを介して、それを安定化させます。この基質結合モードはPPEP-1に固有のものであり、現在までに人間のプロテアーゼには見られません。これは有望な薬物標的になり、および阻害剤のオフターゲット効果は非常に低いです。

選択PPEP-1 INHを開発し、画面に将来的にibitors純粋な単分散PPEP-1タンパク質を多量に必要とされます。また、第一の阻害剤の結合様式を決定するために、PPEP-1との共結晶構造が決定されなければなりません。私たちの手でPPEP-1は常に相互成長結晶を生成します。したがって、私たちはPPEP-1の単一回折品質の結晶を生成するために最適化手順を開発しました。このプロトコルでは、我々は詳細にPPEP-1 ¹⁴の生産、精製、結晶化および構造ソリューションについて説明します。我々は、亜鉛単一波長異常分散を介して最適化画面と構造決意に¹⁶ microseeding続く精製タグの除去と分泌シグナル配列、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを欠くPPEP-1変異体の大腸菌における細胞内発現を使用します（亜鉛^-SAD）17。このプロトコルは、他のタンパク質（ 例えば 、の産生および構造決意に適合させることができます</ em>のメタロプロテアーゼ）と相互成長結晶の製造タンパク質について、特にインチリクエストに応じて、構築物（をpET28a-NHIS-rPPEP-1）のプラスミドDNAおよび回折データは、教育目的のために提供することができます。

Protocol

1.クローニングとデザインを構築

1. 私はんでを使用してのpET28aベクターにシグナルペプチドを含まないクロストリジウム・ディフィシル PPEP-1の（ 大腸菌用）のコドン最適化配列のクローンを作成し、[以下、組換えPPEP-1（rPPEP-1）という名前のアミノ酸27から^220、11]およびXho I制限部位、3 '末端（得られたベクターをpET28a-NHIS-rPPEP-1）の停止コドンを持つ（ 図1）。これは、精製の間にタグを削除できるようにトロンビン切断部位（ 図1）とN末端6xHisタグタンパク質（NHIS-rPPEP-1）を生成します。プラスミドは、選択のためのカナマイシン耐性カセットを含みます。クローニングに用いたプライマーは、他の場所¹⁴に記載されています。

図1：expreの構築をpET28a-NHIS-rPPEP-1およびSDS-PAGE分析の概略図ssionとすべての精製工程。 NHIS-rPPEP-1の（A）ベクトルマップは、私がPlasMapperで作成したんで / のXhoを使用してのpET28aベクターにクローニングしました。 （B）NHIS-rPPEP-1構築物（上パネル）の模式図およびN末端（下パネル）で生じる追加GSHM-配列との6xHisタグのトロンビン切断後の最終構築物。すべての精製工程（：分子量マーカーM）から4時間、サンプルの（D）37℃でBL21（DE3）スターでの発現のSDS-PAGE分析（C）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

rPPEP-1の2発現および精製

1. NHIS-rPPEP-1の発現
   1. 構成し、オートクレーブLB（LB培地）培地（を10g / Lトリプトン、を5g / Lの酵母抽出物、10g / LのNaCl、adjuNaOHでpHを7.5にST）。使用直前に硫酸カナマイシン（50μg/ ml）で補足（LB /菅培地）。
   2. LB /菅培地中で新鮮に形質転換した大腸菌から200ミリリットルに一晩培養物を接種します。 220 rpmで振盪しながら37℃で一晩増殖。
   3. 翌朝、一晩培養物のOD _600（600 nmの波長での光学密度）を確認します。 2 2.8 Lを接種OD 0.1の₆₀₀に一晩培養して各1 L LB /菅培地を含むフラスコを困惑。過剰な泡の形成を防止するために、水性シリコーンエマルジョンの3滴で補います。 OD _600が 0.6に達するまで、180rpmで振とうし、37℃で細胞を増殖させます。
   4. SDS-PAGE分析（OD ₆₀₀ = 1での培養物から1ミリリットルに相当）のための誘導前のサンプルを取ります。 NHIS-rPPEP-1の発現を誘導するために0.5mMの最終濃度までIPTGを追加します。 4時間37℃/ 180rpmで成長を続けます。
   5. 10倍ディでOD _600を決定_します収穫サンプル（OD ₆₀₀ = 1での培養物から1ミリリットルの同等品）リューションとなります。
   6. 7,000×gで4℃で20分間の遠心分離によって細胞を収集します。 50 mlの遠心チューブに移す：40ミリリットルTBS緩衝液（20mMのTris-HCl、pHが7.5、200mMのNaClトリス緩衝食塩水）での培養の1 Lから残留LB培地に再懸濁細胞ペレットを削除します。使用するまで-80℃で万×gで10分間、4℃、店舗の遠心分離により細胞を収集します。 SDS-PAGE ^18を介して（総溶解物および可溶性画分）の発現を分析します。
2. タグなしrPPEP-1の精製
   1. SDS-PAGE分析のために、各精製工程の50μlのサンプルを取ります。 10μg/ mlのDNaseIで補足したTBS緩衝液中で培養物1 Lから細胞ペレットを再懸濁します。細胞のグラム当りTBS / DNアーゼIの5ミリリットルを使用してください。
      1. 溶解15分（2秒休止と2秒のパルス）のための30％の振幅を用いて、氷/水に超音波処理により細胞。 CENTRにより破片を除去万XGと4℃で10分間ifugationおよび超遠心分離チューブに上清を移します。 165,000×gで、4℃で30分間超遠心分離で透明溶菌物。
   2. 4-6℃で動作します。蠕動ポンプまたはクロマトグラフィーシステムを使用して、10mMのイミダゾール（pH7.5）で補充したTBS緩衝液でガラスカラムに、ニッケル - ニトリロ三酢酸（のNiNTA）樹脂を2mlを平衡化。また、重力流を使用しています。
      1. 10mMの最終濃度まで1 MイミダゾールpHは7.5で清澄化ライセートを調整します。カラムに溶解物を適用し、280 nmでのUV吸収がベースラインに達するまで、それぞれ、10mMの30 mMイミダゾールを補充したTBS緩衝液で段階的に洗浄します。
      2. TBS緩衝液+ 250mMイミダゾールでタンパク質を溶出。再平衡化TBSの列は、10 mMイミダゾールや店舗一夜を補いました。
   3. 吸光coeffiを使用して、いずれかの280nmでのタンパク質濃度を決定します25,900 M ^-1 cm ^-1で、または任意の他の方法（ 例えば、Bradford法^19）でのcient。タンパク質1mgあたりのトロンビンの2台を追加し、TBSの50倍の体積（のNiNTA溶出量の50倍）に対して4℃で一晩タンパク質溶液を透析。
      注：イミダゾールは280 nmで強く吸収し、タンパク質濃度の決意の正しい空白を取ります。
   4. 切断されていないタンパク質を除去するために平衡化したNiNTA樹脂の上にタンパク質溶液を渡します。次に、すべての切断されたタンパク質を回収するためにカラムにTBSの同じ体積を10mMのイミダゾールを補充し適用します。列をきれいにするには、250 mMイミダゾールを持つすべての残りのタンパク質を溶出。 SDS-PAGE（ 図1）を介してサンプルを分析します。
   5. 遠心限外濾過ユニットを用いて4,000×gで、4℃で10分間隔で4 mlまでタンパク質溶液を濃縮します。沈殿および凝集を防止するために、各間隔の後に集中するタンパク質を混ぜます。時折このステップでLYいくつかの沈殿は、混合手順にもかかわらず、rPPEP-1について観察されます。
      1. 4-6℃で（TBS緩衝液中で）予め平衡化したサイズ排除クロマトグラフィーカラムに濃縮されたタンパク質を適用します。 TBS緩衝液でカラムを溶出、SDS-PAGE分析に1mlの画分と秒毎分数の対象5μLを集めます。 rPPEP-1は、単量体（ 図2）に対応する単一のピークで溶出します。時折、より大きな分子量でマイナーなピークは、タンパク質の二量体に対応する、（フロンティングピーク）が観察されます。収量は、培養物のL当たりの純粋なタンパク質の約50 mgであるべきです。 SDS-PAGE ^18（ 図2）を介してすべてのサンプルを分析します。

図2：rPPEP-1の代表的なサイズ排除クロマトグラフィーおよびSDS-PAGE分析。サイズ排除クロマトグラム（A280; 6℃のトリス-HCl、pH7.5で、200mMのNaClで（16/600）カラムを用いて精製されたタグなしrPPEP-1の280 nmの吸光度）。 22 kDaのタンパク質について予想されるように、それは主に単量体であることを示唆し、溶出量、rPPEP-1泳動に基づきます。二量体に対応するピークが現れるに面しまれにマイナー。 （挿入図）サイズ排除クロマトグラフィーからの画分のSDS-PAGE分析（M;分子量マーカー）。毎秒画分が適用されます。メインrPPEP-1バンドの下のかすかなバンドは時折少量の不純物を発生に対応します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Microseedingを使用した3結晶と結晶の最適化

注：rPPEP-1は、常にX線回折分析に適していない高度に相互成長結晶（ 図3）を生成する条件から結晶化。したがって、最適化戦略（ 図4）は 、高品質の結晶（ 図5）を得るために開発されました。

1. 商業画面を使用してrPPEP-1の最初のスクリーニング
   注：標準的な市販のスクリーンや結晶化ロボットを使用して、シッティングドロップ形式で結晶化試験を実施します。
   1. ミリリットル4,000×gで、4℃で5分間隔で遠心限外ろ過装置を使用して、/ 12 mgの精製タンパク質を濃縮します。沈殿および凝集を防止するために、各間隔の後に集中するタンパク質を混ぜます。 25,900 M ^-1 cm ^-1での吸光係数を使用して、または任意の他の方法（ 例えば、Bradford法）により280nmでのタンパク質濃度のいずれかを決定します。 20℃にタンパク質を平衡化します。 16,000×gで10分間、20℃での遠心分離によって離れ全ての粒子やほこりをクリアします。
   2. どちらか既に予め充填された結晶化プレート自体を使用ALEDと4℃で保存するか、あるいはすべての結晶化条件の70μlのプレートの溜め井戸を埋めます。 20℃にすべての結晶化プレートを平衡化。小さなボリュームがすぐに乾くよう、迅速に作業。可能な場合、ロボットのドックの周り湿度室を使用してください。
      注：SaltRx、インデックス、PEG /イオン、クリスタル、ウィザード、PACT ++、JCSG ++：標準的な手順として、次の画面を使用してください。
   3. subwells 2-4にタンパク質や貯水池をピペッティングすることにより、画面を設定します。ある200：100（subwell 2）、150：150（subwell 3）と100：（NL中）200（subwell 4）：ドロップ量は300 NL及び比（貯水池タンパク質）です。すぐに20℃のチャンバー内プレートと場所を密封します。
   4. すぐにセットアップした後、トレーを点検し、その後、毎週の検査に続いて最初の週の間、毎日点検してください。
2. リガンドとrPPEP-1の共結晶化
   1. 基質ペプチドrPPEP-1複合体の共結晶化のためにrPPEP-1を混ぜます12の最終濃度を与える1比TBS緩衝液中に可溶化（v / v）のペプチド溶液の7倍モル過剰（AC-EVNPPVPD-NH _2）凍結乾燥粉末）、1 mlの24ミリグラム/時mg / mlでR-PPEP-1タンパク質とPPEP-1を超えるペプチドの7倍モル過剰。 20℃で30分間インキュベートし、16,000×gで、20℃で10分間遠心分離することによって全ての粒子やほこりを一掃。結合していないR-PPEP-1タンパク質について記載したようにmicroseeding手順を用いて結晶化を続行します。

図3：初期画面からの代表的な結晶。 12時rPPEP-1から中間成長結晶は、mg / mlでの条件で成長させました。 （A）クリスタル画面I / 38（1.4 Mクエン酸ナトリウム0.1 M HEPESナトリウムpHが7.5、脱水三塩基性; 200 nlの：100 NL）。 （B）SaltRx画面/ 52（2.4 Mリン酸アンモニウムDIBASIC、0.1 MトリスpHは8.5。 100 NL：200 NL）および（C）（200 NL：100 NL）。 （D）SaltRx画面/ 96（60％（v / v）のTacsimateのpHは7.0、0.1 M BIS-TRISプロパンのpH 7.0; 200 nlの：100 NL）。スケールバー= 0.2ミリメートル。貯水池：体積比は常にタンパク質です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：rPPEP-1の結晶化のための最適化の手順。複数の格子（相互成長）低回折品質の12 mg / mlででととrPPEP-1からの初期結晶は、24-条件の最適化画面に再現されました。ここでも、唯一の相互成長結晶は、2.55 Mリン酸アンモニウム二塩基を含む条件で観察されました。シードストックは、単一の相互成長結晶から調製し、1希釈した：1000同じコンディットへイオン（microseeding）。希釈されたシードストックの0.5マイクロリットルの容量は残りの明確な低下し、単結晶中に添加したほぼ全ての条件で成長しました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

3. microseedingを用いた結晶の最適化
   注：rPPEP-1の高相互成長結晶は2.4 Mリン酸アンモニウム、二塩基、0.1 Mトリス塩酸、pHが8.5（SaltRx画面、条件E4、3つのすべてのsubwells）（ 図3）を含む状態で2日後に表示されます。 microseedingと組み合わせ初期状態の周りの格子スクリーンを使用して最適化手順は、（ 図4）に適用しました。
   1. appropriから（0.5のpH単位のステップで）（0.15 Mの段階で）2.55 Mリン酸アンモニウム二塩基および0.1 Mトリス塩酸pHが7.5から9.0 - 1.8で24の条件を備えたグリッド画面（ 図4）を準備ストック溶液（4 Mリン酸アンモニウムと1 Mトリス緩衝液）を食べました。
      注：10最適化の画面を実行することができ、すべての条件の2ミリリットルを得るために、ボリュームとピペッティングスキームを計算するために、メイクのトレイアプレット（http://hamptonresearch.com/make_tray.aspx）を使用します。 4 Mリン酸アンモニウムのストック溶液を調製することは困難です。完全に水に粉末を溶解するために攪拌しながら、溶液を加熱します。
   2. ピペットで24ウェルプレートのウェルに、すべてのグリッド画面溶液200μlと20℃で平衡化します。
   3. 手動で結晶化プレートを設定します。 （μlの）2：1、1.5：1.5と1（：リザーバタンパク質）2である液滴体積が3μLとの比です。ここでは、気泡の形成を回避するために正の変位ピペットを使用。すぐに20℃のチャンバー内プレートと場所を密封します。気泡の形成を避けます。
      注：1〜4日後に高度に相互成長した結晶を2.55 Mアンモニウムフォーを含む4つの条件で表示されますsphate二塩基および0.1 Mトリス塩酸pHが7.5から9.0（ 図4）。全く結晶をmicroseeding手順は、これらの条件にrPPEP-1の単結晶を得るために使用される2.55 M.下リン酸アンモニウム濃度が残りの20の条件で形成されていません。
   4. 2.55 Mリン酸アンモニウム二塩基および0.1 Mトリス塩酸pHが8.0または8.5で2つの条件のいずれかから単相互成長結晶を採取することによりmicroseedストックを準備します。結晶は、プラスチック表面に付着している可能性があります。鍼と周囲のプラスチックを慎重に変形が結晶を切り離すのに役立ちます。
      1. 転送小さな高度に研磨されたガラスビーズを含む1.5 mlチューブにそれぞれの母液の50μlの（ビーズ用-の種子）。取り付けられたナイロンループを使用すると、ガラスカバースライド上に配置された母液1μlのに水晶を移します。
      2. 30秒間高速でチューブと渦の中に結晶を含有する液体を転送します。 1を作成します。5秒間完全に同じ調製したばかりの状態と渦を含む新しい1.5mlチューブにシードストックの千希釈。
         注：種子ストックは、後の使用のために-80℃で保存することができます。
   5. ウェルに：明確に低下し、ピペット種ストック（千希釈1）の0.5μlの20の条件をカバープレートのシールを削除します。 20℃のチャンバー内プレートと場所を密封します。高い回折品質の単結晶は、2-7日（ 図5）に表示されます。

図5：最適化の画面からの代表的な結晶。以下の条件で成長させた1000希釈シードストック：1と12 mg / mlで播種した時rPPEP-1から単結晶（A）2.1 Mリン酸アンモニウム、二塩基、0.1 MトリスpHは7.5。 1.5μlの1.5μlの。 （B）2.1 Mリン酸アンモニウム、二塩基、0.1 MトリスpHは7.5。 2μlの：1μlの。 （C）2.25 Mリン酸アンモニウム、二塩基、0.1 MトリスpHを8と2μlの：1μlの。 （D）2.1 Mリン酸アンモニウム、二塩基、0.1 MトリスpHを8と1μlの：2μlの。 （E）2.1 Mリン酸アンモニウム二塩基に成長し、0.1から0.2ミクロンのナイロンループで結晶をマウント、0.1 MトリスpHが8（2μL：1μl）をし、凍結保護、0.1MトリスpH8の2.1 Mリン酸アンモニウム二塩基性で、 20％グリセロール。スケールバー=（AD）で0.2ミリメートル。ボリューム比は常にタンパク質です：貯水池。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

4.クリスタルマウントとデータ収集

注：回折データの結晶の最高の品質を得るためには、その品質と大きさのピークに設置する必要があります。彼らはアーカンソーまで結晶を液体窒素中に保存することができしたがって、100 KでX線回折分析を行っeは、それらが由来する元の状態が凍結条件に調整されなければなりません。 rPPEP-1結晶を凍結保護し、20％グリセロールまたは30％スクロース（凍結保護によって状態の水の交換）のいずれかの添加によって行うことができます。

1. クリスタル取り付け
   注：すべての結晶操作手順は、実体顕微鏡下で行われるべきです。
   1. 選択された結晶の最大長は、ナイロンループの最適なサイズを選択します。 rPPEP-1結晶の典型的な最長軸は、約100から200ミクロン（ 図5）です。カバースライドし、適切な凍結状態を準備する（ 例えば 、2.1 Mリン酸アンモニウム、二塩基、0.1Mトリス、pH8.0の、20％グリセロール）。
      1. 液体窒素を充填した800ミリリットルの発泡デュワーでそれを液体窒素で泡デュアーを記入し、バイアルとバイアルクランプをロードし、事前に冷却します。適切な識別子でマークされたクライオスリーブとクライオ杖ホルダーを配置します液体窒素で満たされた2リットルの発泡デュワーインチ取り付けられたナイロンループを有する磁気ワンドをロードします。
         注：液体窒素で作業する際、防護服（アイシールド/メガネ、手袋）を着用してください。暖かいオブジェクトは、流出を生成することができる液体窒素に急落しました。
   2. 鋭いメスでシールテープを開き、ピンセットでそれを削除カットします。ピペット1カバースライド上に低温状態のμlの（あるいは同じプレート上にも空で）、マウントナイロンループ（ 図5）でそれを釣りして、ドロップからの結晶を除去します。添付の結晶が容易に鍼と周囲のプラスチックを変形させることにより地面から取り外すことができます。
      1. 迅速に凍結状態の低下に結晶を転送し、それが1秒間平衡化しましょう。液体窒素中で可能な限り迅速かつプランジ凍結等の結晶を釣ります。
      2. 取り付けられたループの周りの液体窒素が沸騰を停止すると、バイアルにループを配置します。クライオ杖ホルダーにバイアルを置き、6バイアルを装填したときにホルダーの周りにクライオスリーブを配置します。使用するまで液体窒素で満たされたタンク内の結晶を保管してください。
2. データ収集
   注：データ収集が可能な場合、またはシンクロトロンビームラインにおいて、ホーム回折計で行うことができます。 rPPEP-1のためのデータは、ハイブリッド光子計数検出器を使用して、スイスの光源、ポールシェラー研究所、Villigen、スイスのビームラインX06DAで収集しました。元のデータと構造の決意で使用されているすべてのファイルは、要求に応じて提供することができます。
   1. 要素亜鉛の特性X線吸収端エネルギー（ピーク）である1.282Å（9667 keVの）、にビームの波長を設定します。 rPPEP-1は、活性部位における分子当たり単一の亜鉛が含まれていメタロプロテアーゼです。
   2. 各DIRECTIOで270度の合計10度のウェッジで逆ビームモードで100 Kでデータを収集しますn個。露光時間は、画像ごとに0.1°回転0.1秒です。 14％（0.14）への送信を設定します。
   3. 同じ結晶化条件から生じる二結晶からネイティブ高解像度のデータセットを収集するには1.00オングストローム（12398 keVの）に光の波長を設定します。露光時間は画像あたり0.1°の回転で0.1秒である100 Kでデータを収集します。 70％（0.7）への送信を設定します。

亜鉛SADを経由5.構造決意

注：いくつかの基本的な結晶学的な知識が必要とされる亜鉛SADだけでなく、ソフトウェアパッケージXDS ^20、フェニックス²¹およびプログラムオオバン^22を介してrPPEP-1の構造を決定するために。構造の可視化のためのプログラムPyMOL ²³またはキメラ^24が必要とされています。元素亜鉛の吸収端のピークに対応する波長で収集したデータは、単一波長異常DISPのために使用することができます^{ERSION（SAD）25は、}全て^のタンパク質原子のために拡張することができる位相情報を取得します。

1. 情報処理
   1. フリーデルの仲間（異常データ）を分離する空間群にP2 ₁ 2 ₁ 2 _1（空間群19）をソフトウェアXDS（あるいはiMosflmまたはHKL3000）を使用して（通常の逆）は、2つのピークのデータセットを処理します。単位格子パラメータは、B、C（A）の周りでなければならない= 43.17は、71.68、117.70およびα=β=γ（°）= 90これは2 HKL-ファイル（反射ファイル）を与えます。
   2. ファイルCORRECT.LPを点検します。 CC _1/2が少なくとも50％である解像度までのデータを使用してください。一緒XSCALEを使用して、両方のデータセット/反射ファイル（HKL-ファイル）スケール。ファイルXSCALE.LPを点検します。異常信号が延びてどこまで確認してください（SigAno）及び1.67オングストロームに収集し、ここで使用されるデータの場合には2オングストロームで約30％、の異常な相関（Anomalコアー）と解像度の点に注意してください。これはフェニックスAutoSolで使用される異常信号用の解像度カットオフ。
   3. XDSCONVは5％のR _自由サブセットを作成し、異常なデータを（FRIEDEL'S_LAW = FALSE）に保つ使用して（peak_anom.mtz、たとえば、名前付き）CCP4形式の反射ファイルに（スケーリング）HKL-ファイルを変換します。単位格子パラメータ、空間群およびR _無料のサブセット（ラベルFreeRflag）の存在と異常データ（ラベルDANO / SIGDANO）を検査プログラムmtzdmpとの整合性のためのMTZ-ファイルを確認してください。 （FRIEDEL'S_LAW = TRUE;例えば、peak_native.mtzという名前の）異常なデータを抽出することなく、またXDSCONVと追加MTZ-ファイルを準備し洗練するために後の段階で。
2. 基礎構造ソリューション（位相決意）
   1. 反射ファイルpeak_anom.mtzを使用して、フェニックスAutoSolを実行します。データ型としてSAD / MADピークを選択し、（非対称単位あたり2つの分子が存在するように）2亜鉛サイトを選択します。より正確なexperiのいずれかを選択します。F F '/ F' '（ビームラインでの蛍光スキャンで決定された）パラメータまたはtheotetical値' = -8.245およびf '' = 3.887のための精神的な値。また、結晶化タンパク質のアミノ酸配列を含むFASTAファイルをロードします。
   2. この場合には、（5.1.2で決定された）約30％の異常な相関（Anomalコアー）との解像度に2Åの分解能の限界を設定し、「自動ビルドモデル」オプションを選択します。電子密度への全タンパク質のための相が推定することができるフェニックスHySS（フェニックスAutoSolパイプラインの一部）で見つかった2つのジンクサイトおよび（フェニックスのRESOLVEにより）構築されたモデルの位相を使用。最良のモデルは「overall_best.pdb」と呼ばれています。
3. モデル構築、改良と検証
   1. 自動的rPPEP-1モデルのほとんどを構築するためのオプション「自動ビルドモデル "を選択します。 PROGRAを使用して1.0σ等高線レベルでの電子密度を点検メートルオオバン（ 図6）。これは、結合モデルの原子を取り囲んでなければなりません。理想的には、いくつかの水分子は（2.5Åよりも優れた分解能での）モデルに組み込まれるべきです。バルク水（分子間の空間は）何の密度が含まれているべきではありません。
   2. モデル全体が（電子密度に組み込まれたすべてのアミノ酸）が完了したかどうかを確認してください。ない場合は、手動でオオバンが提供するツールを使用して構築します。 5洗練されたフェニックス絞り込みの反復ラウンドを実行することにより、組織を微細化すると、それぞれがoverall_best.pdbモデルファイル、peak_native.mtz反射ファイルおよびFASTAシーケンスファイルを使用して丸めます。そして、オオバンの手動モデル構築。
   3. オオバンにおけるそれぞれのツールと構造モデルの品質を検証します。

図6：後rPPEP-1の実験的電子密度マップとモデルフェニックスAutosolが実行されます。プログラムオオバンに表示される1.0σの輪郭レベルで青の電子密度。この最初のマップでは電子密度がうまく解決され、モデルは電子密度に組み込みます。ズームでは、残基His142とGlu189、ならびに水の分子を示しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

分子置換を介した高解像度6.構造決意

注：rPPEP-1についての高分解能の構造情報を得るために、ネイティブデータセットが収集されます。次に（フェニックス・ソフトウェア・パッケージ内の）ソフトウェアフェイザー^26,27を用い^た分子置換手順は、モデルとして亜鉛SADを介して決定された構造を使用して採用されています。小分子と複合体を形成rPPEP-1の構造を解く場合、この手順は、後で使用することができます。

1. （1.4Åに、この場合の最大）高解像度の結晶構造を得るためには空間群P2 ₁ 2 ₁ 2 _1（空間群19）にソフトウェアXDS（あるいはiMosflmまたはHKL3000）を使用して、ネイティブデータセットを処理します。単位格子パラメータは、B、C（A）の周りでなければならない= 43.17は、71.77、117.80およびα=β=γ（°）= 90これは、1 HKL-ファイル（反射ファイル）を与えます。
2. ファイルCORRECT.LPを点検します。 CC _1/2が少なくとも50％である解像度までのデータを使用してください。 5％のR _自由サブセットを作成XDSCONVを使用して（たとえばという名前の、native.mtz）CCP4形式の反射ファイルにHKL-ファイルを変換します。単位格子パラメータ、空間群およびR _無料のサブセット（ラベルFreeRflag）の存在を検査するプログラムmtzdmpとの整合性のためのMTZ-ファイルを確認してください。
3. 以前の決定overall_best.pdbからモデルを含むPDBファイルを準備し、すべての水の分子と全てのリガンドを除去する（ すなわち、。亜鉛原子）。また、結晶化タンパク質のアミノ酸配列を含むFASTAファイルをロードします。反射ファイルnative.mtzを使用して、フェニックスにフェイザーを実行します。非対称単位あたり2分子を検索します。
4. モデル（名前付きnative_phaser.1.pdb）とオオバンにおける電子密度マップを検査し、成功した構造の溶液（ここでは10.2 8より大きいTFZスコア）の後。ビルドし、5洗練されたフェニックス絞り込みの反復ラウンドを実行することにより、組織を微細それぞれがnative_phaser.1.pdbモデルファイル、native.mtz反射ファイルおよびFASTAシーケンスファイルを使用して丸めます。そして、オオバンの手動モデル構築。
5. オオバンにおけるそれぞれのツールと構造モデルの品質を検証します。

Results

rPPEP-1を大腸菌 BL21（DE3）スター（ 図1C）で最も高い収率で、いくつかの大腸菌株で過剰発現されます。最初のNiNTAアフィニティークロマトグラフィー工程後の6xHisタグが正常タンパク質の大部分から切断することができ、第二のNiNTAステップで未消化のタンパク質を完全にトロンビン消化されたタンパク質（ 図1D）から分離することができます。 S200 16/600カラムタグなしrPPEP-1に時折有するモノマーとして移動するには、おそらく二量体種（ 図2A）に対応する面し。タンパク質は、（ 図2B）純粋であり、収率は大腸菌培養物1 Lから約50mgのタンパク質です。 rPPEP-1は、多くの場合、リン酸を含む、様々な条件（ 図3）に結晶化します。結晶は、非常にすべての条件に相互成長しているので、結晶の最適化を実行しなければなりませんでし...

Discussion

X線結晶学は、依然としてタンパク質²⁸の3次元近接原子分解能構造を決定するための最速かつ最も正確な方法です。しかし、十分に秩序単結晶の成長を必要とします。これらは、多くの場合、取得するのが困難であり、結晶状態は、人工的です。しかしながら、他の方法によって決定されたもので、X線結晶学によって決定されるタンパク質構造の比較は、特にNMR、一般的に非常に良い一致を示しています。 PPEP-1の場合には、最近²⁹公開されたNMR構造は、S-ループの移動度を含む当社の結晶構造¹⁴との優れた一致を示しています。

このプロトコルは、構造研究およびタグなしrPPEP-1の結晶化および構造決意のためのN末端HisタグrPPEP-1タンパク質の産生および精製を記載します。単結晶は、この場合、成長させることが困難であり、特殊microseeding手順を必要としました。トンで彼は我々がPPEP-1の結果を議論し、プロトコルが任意の他のタンパク質の生産および結晶化のために適合させることができる方法を示しますセクション以下。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Genes / Vectors / cell strains
pET28a ベクター	Merck-Millipore	69864	Thrombin cleavable N-terminal His-tag
E. coli strain BL21 (DE3) Star	ThermoFisher Scientific	C601003	RNase H 欠損
コドン最適化遺伝子 (for E. coli)	Geneart(サーモフィッシャーサイエンティフィック)	カスタム	アミノ酸27-220
名前	会社	カタログ番号	コメント
Chemicals
酵母抽出	物任意の
トリプトン
消泡剤 B	Sigma-Aldrich	A5757	水性シリコーンエマルジョン
寒天	任意の
Kanamycin	任意の
IPTG	AppliChem	A1008
Tris-HCl	AppliChem	A1087	バッファーグレード
NaCl	任意の		バッファーグレード
DNaseI	AppliChem	A3778
イミダゾール	AppliChem	A1073	バッファーグレード
トロンビン	Sigma-Aldrich	T4648
リン酸アンモニウム 二塩基性	Sigma-Aldrich	215996
グリセロール 100%	any		純度の高いグレードの
ショ糖	Sigma-Aldrich	84097
液体			結晶の貯蔵および凍結冷却のための
任意名前	会社	strongカタログ番号	コメント
機器(一般)
振とうインキュベータ	ー20		°C-37 >C
ガラス製品	、任意の		バッフル、三角フラスコ(50ml-2.8L)、
大容量培養液の遠心分離	12Lの処理容量のための遠心
処理機、Vibra-Cell VCX500	Sonics	SO-VCX500	、またはその他の超音波処理機/細胞破壊器
超遠心分離機	最大150,000 x g
NiNTA スーパーフロー樹脂	Qiagen
Empty Glass Econo-Column	Bio-Rad	7371007	またはその他の空のガラスまたはプラスチックカラム
サイズ排除クロマトグラフィーカラム HiLoad Superdex 200 16/600	GE Healthcare	28989335
クロマトグラフィーシステム Äkta 清浄機	GE ヘルスケア	28406264	またはその他のクロマトグラフィーシステム
透析チューブ Spectra/Por 3	Spectrum Labs	132724
透析チューブ クロージャー	Spectrum Labs	132738
限外ろ過ユニット(濃縮器) 10,000 NWCO	任意の
UV-Vis分光光度計
名前	会社	カタログ番号	コメント
機器(結晶学)
少量ピペット0.1-10 & マイクロ;
容積式ピペット Microman M10	Gilson	F148501
晶析ロボット	96
ウェル結晶化プレート TTP IQ 3つのタンパク質ウェル付き	TTP	4150-05810	またはその他の96ウェル結晶化プレート
24ウェルCombiCloverジュニアプレート	イエナバイオサイエンス	EB-CJR
クリスタルクリアシーリングテープハ	ンプトンリサーチ	HR3-511
ガラスカバースライドハ	ンプトンリサーチ	HR3-225
商業結晶化スクリーン:SaltRx、インデックス、PEG /イオン、クリスタルハ	ンプトンリサーチ
商業結晶化スクリーン:ウィザード、PACT++、JCSG++イ	エナバイオサイエンス	多様な
JBSビーズフォーシードイ	エナバイオサイエンス	CO-501
CrystalCap SPINE HT(ナイロンループ)	ハンプトンリサーチ	多様な	ループサイズ0.025 mm - 0.5 mm
CrystalCapバイアル	ハンプトンリサーチ	HR4-904
低温フォームデュワー800ミリリットル	ンプトンリサーチ	HR4-673
極低温フォームデュワー 2 L	ハンプトン研究	HR4-675
バイアルクランプ、ストレートハ	ンプトン研究	HR4-670
クリスタルワンド磁気、ストレート	ハンプトン研究	HR4-729
クライオケーン 6 バイアルホルダー	ハンプトン研究	HR4-711
クライオスリーブ	ハンプトン研究	HR4-708
クライオケーンカラーコーダー - ホワイト	ハンプトンリサーチ	HR4-713
	任意の
ストレートマイクロ鉗子	シール		。 etc.
鍼灸針	any		例えば薬局から
ステレオ顕微鏡			any結晶化プレートの検査や結晶実装、最大160倍の倍率