血清やフィーダーフリーのマウス胚のコレクションは、無細胞アプローチのための細胞馴化培地を幹

サマリー

このプロトコルは、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集するための方法を提供するメディア-conditioned（MESC-CM）血清（ウシ胎児血清、FBS）に由来する - とフィーダー細胞のための（マウス胚線維芽細胞、MEFの）フリー条件フリーアプローチ。これは、老化や老化関連疾患の治療のために適用することができます。

要約

胚性幹細胞(ESC)と人工多能性幹細胞(iPSC)が様々な細胞タイプを生成する能力は、再生医療の分野に新たな道を開きました。しかし、その利点にもかかわらず、ESCおよびiPS細胞の腫瘍形成の可能性は、長い間臨床応用の障壁となってきました。興味深いことに、ESCは組織の再生を促進し、細胞の老化を遅らせることができるいくつかの可溶性因子を生成することが示されており、ESCとiPS細胞も無細胞介入法として利用できることが示唆されています。そのため、血清成分(ウシ胎児血清、FBS)やフィーダー細胞(マウス胚性線維芽細胞、MEFs)の汚染を最小限に抑えたマウス胚性幹細胞(mESC)馴染培地(mESC-CM)を回収する方法が強く求められていました。本研究では、無血清および無給餌条件下でのmESC-CMの収集と、老化に伴う複数の読み出しを用いたmESC-CMの特性評価に最適化された方法を紹介します。このプロトコルは、血清やフィーダーの汚染なしに純粋なmESC特異的分泌因子を収集する方法を提供します。

概要

このプロトコルの目的は、血清および無フィーダー培養条件から培地（MESC-CM）を-conditionedし、その生物学的機能を特徴づけるために、マウス胚性幹細胞（MESC）を収集することです。

一般的には、胚性幹細胞（ESCは）による自己再生^1-3のための彼らの多能性と能力に再生医療や細胞治療のための大きな可能性を持っています。しかし、幹細胞の直接移植は、免疫拒絶および腫瘍形成^4,5のようないくつかの制限を有します。従って、無細胞アプローチは、再生医療や老化介入^6,7の代替治療戦略を提供することができます。

老化は、増殖停止、改変された細胞生理学、および行動の永続的な状態によって特徴付けられる組織や臓器の老化に対する細胞相手と見られています。老化、癌、心臓血管疾患、Tなどの流行病のための主要な危険因子であります2型糖尿病、および神経変性^8を YPE。老化の明らかな特徴の一つは、幹細胞の老化や枯渇⁹によって引き起こされる組織の再生能力の低下、です。多くの重要な研究は、このような一貫して老化を遅らせ、寿命を延長する能力を持っているラパマイシン^9、レスベラトロール^10、およびメトホルミン^11、および血液媒介全身の要因、すなわちGDF11 ^12、薬理学的分子を、示しています。

本研究では、MESC-CMは、血清因子とのMEFからの分泌因子の混入を排除するために、血清（ウシ胎児血清、FBS）およびフィーダー（マウス胚線維芽細胞、MEFの）層なしで収穫されています。これらの条件は、結果的にMESC固有の分泌因子の正確な同定を可能に血清および無フィーダーCMを可能にしました。

この提案されたプロトコルは、非常に効率的で比較的費用対効果、および容易動作します。この技術は、老化関連疾患及びその他の再生のための介入に向かって安全かつ潜在的に有利な無細胞治療アプローチの開発のために使用することができる抗老化効果を媒介することができるMESC由来の可溶性因子の特性への洞察を提供しますトリートメント。

プロトコル

注：血清及び無フィーダーCM収集プロトコルの概略図を図1に示されています。

1.材料（MEFを、ミディアム、プレート、および溶液の調製）

1. 文化のMEFに培地の500ミリリットルを準備します。 10％FBS（ESC品質）、50単位/ mlペニシリン、および50mg / mlストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補足。
2. 確立されたルーチンプロトコル¹³次胚からのMEFを単離し、MEF培地中で維持します。
3. 文化へたmESCを培地500mlを準備します。 DMEM、15％FBSおよび2mMのL-グルタミン、100μMの非必須アミノ酸（NEAA）、100μMのβメルカプトエタノール、100ユニット/ mlの白血病抑制因子（LIF）、50単位/ mlペニシリン、および50が補充されますミリグラム/ mlのストレプトマイシン。
4. 0.1％ゼラチン溶液の5mlを10cmの細胞培養皿をコーティングすることによりゼラチン化プレート（5ゼラチン化プレート/ 1 MESCプレート）を準備します。少なくとも10分間インキュベート室温で。
5. たmESCの無血清条件に減少血清培地の500ミリリットルを準備します。サプリメントは、炭酸水素ナトリウム（pHは7.0）の1.2グラムと血清培地を削減しました。 0.2μmのボトルトップフィルターに通してフィルタリングします。
6. 老化関連βガラクトシダーゼ（SAβ-GAL）老化細胞の検出のための染色溶液調製：1mg / mlのX-GALを、40mMのクエン酸/リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）（ジメチルホルムアミド、DMFに溶解） 、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウム、150mMのNaCl、及び2mMのMgCl ₂ ^14。
   注意：（危険）DMFは、有毒で腐食性のソリューションです。ソリューションを取り扱う場合の個人防護服（ 例えば、ニトリルまたはラテックス手袋、白衣、およびゴーグル）を着用してください。ヒュームフードを使用してください。
7. 文化ヒト皮膚線維芽細胞（HDFを、NHDF-ADデア・線維芽細胞）への培地500mlを準備します。 10％FBSおよび100単位/ mlのペニシリンおよび100mg / mlストレプトマイシンを含むDMEMを補います。

マウス胚性幹細胞のjove_title "> 2。文化（図1Aおよび2A）

注：細胞培養生物学的安全フード内のすべてのステップを実行します。

1. 15cmの細胞培養皿にマイトマイシンCを10μg/ mlを含むMEF培地20mlでのMEFを扱います。 37℃で2時間、5％CO ₂インキュベートします。
2. MEFからの培地を吸引除去します。 PBSで細胞を3回洗浄します。トリプシンEDTA（TE、1×）の3 mlを加え、37℃で3分間、5％CO ₂インキュベートします。 3分後、300×gで3分間MEF培地と遠心分離機の6ミリリットルでTEを中和します。
3. MEF培地5mlで再懸濁。トリパンブルー染色し、血球計数器を用いて得られた細胞懸濁液中の細胞数を決定します。 MEF培地中の10-cmの細胞培養皿あたり2×10 ⁶細胞の密度でプレートに不活性化したMEF（フィーダー）。 37℃で24時間、5％CO ₂インキュベートします。
4. 上（フィーダをメッキした後、MESC媒体24時間とMEF培地を交換してください翌日）。
5. MESC培地でフィーダー上で2×10 ⁶細胞の密度でプレートたmESC（G4 F1ハイブリッドES細胞）。 37℃で48時間、5％CO ₂インキュベートします。
   注：MESC-CMのアンチエイジング効果が低い継代数のたmESCは^15-17を使用しているときに可能性が強いです。私たちは、ルーネンフェルト・タネンバウム研究所、マウントサイナイ病院、25のオードストリート、トロント、ON、M5T 3H7、カナダで博士アンドラーシュナジからG4 MESCラインを取得しました。
6. 70から80までパーセントサブコンフルエントな状態で比較的高い密度と継代で細胞を保管してください。毎日新鮮なMESC培地で培地を交換してください。

3.血清の収集とフィーダー馴化培地（図1Bおよび図2B）

注：細胞培養生物学的安全フード内のすべてのステップを実行します。

1. 5mlのPBSでMESCプレートをすすぎます。 TE（2.5倍）の1ミリリットルを加え、37℃で3分間、5％CO ₂インキュベートします。 3分後、MESC mediu 2mlのTEを中和メートルと300×gで3分間遠心操作します。
2. MESC媒体の各ゼラチンコート培養皿（5ゼラチン化プレート/ 1 MESCプレート）にMESC媒体とプレートの5ミリリットル1ミリリットル中に再懸濁。 37℃で培養し、5％CO ₂ 80〜85までの％の密集度に達します。
3. 合計3回の洗浄のために、1回の洗浄あたり10分間細胞（10cmプレートあたり8ミリリットル）をカバーするのに十分なPBSでたmESCを洗ってください。 37℃で24時間、5％CO ₂のための低血清培地中でインキュベートします。
   注：洗浄工程は、FBSの汚染を防止することが重要です。インキュベーション時間^18,19に従うこと^が重要です。
4. 2500×gで20分間、50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にMESC-CMを収集します。遠心分離後の上澄み液（CM）を収集します。 0.2μmのボトルトップフィルターに通してフィルタリングします。

マウス胚の4効果幹細胞馴化培地（MESC-CM）

注：MESC-CMの効果は、次のようないくつかの方法によって検証されましたSAβ-galアッセイ、細胞周期分析、定量RT-PCR。

1. SAのβ-galアッセイ（図3A）
   1. HDF培地で6ウェルプレート中のウェル当たり2×10 ⁴細胞の密度でシードのHDF。 37℃で一晩インキュベートし、5％CO _2。
   2. 一晩のインキュベーション後、廃棄HDF媒体の半分とはMESC-CMと制御媒体を追加します。 37℃で72時間、5％CO ₂インキュベートします。制御媒体がたmESCの非存在下におけるゼラチンコートディッシュで（血清メディア縮小）無血清培地に由来します。
   3. 2回の洗浄の合計のために、1回の洗浄につき30秒間細胞（6ウェルプレート当たり2ミリリットル）をカバーするのに十分なPBSで細胞を洗浄。固定のために3.7％パラホルムアルデヒド（PFA）を追加します。室温で5分間インキュベートします。
      注意：（危険）パラホルムアルデヒドは有毒で腐食性のソリューションです。ソリューションを取り扱う場合の個人防護服（ 例えば、ニトリルまたはラテックス手袋、白衣、およびゴーグル）を着用してください。ヒュームフードを使用してください。
   4. 固定液を吸引します。ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回固定した細胞を洗浄。
   5. SAβ-gal染色液（1-2 1mlあたり6ウェルプレート中）を追加します。 37℃で17.5時間インキュベートします。
      注：これは、CO _{2インキュベーター}中でインキュベートされるべきではありません。
   6. SAβ-gal染色溶液を吸引し、ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回細胞を洗浄します。
   7. カウンター染色用エオシンソリューションを追加します。室温で5分間インキュベートします。ステップ4.1.3で説明したように、PBSで2回細胞を洗浄。
   8. その後の分析のために取り付けられたデジタルカメラを使用して、光学顕微鏡、キャプチャ画像を用いて100倍の倍率で画像セル。
      注：細胞の総数は、ブラインド方法でカウントすることができ、SAのβ-gal陽性の青色細胞の割合を算出することができます。
2. 細胞周期分析（図3B）
   1. の密度で種子のHDFHDF培地6cmの細胞培養皿中でウェルあたり8×10 ⁴個^の細胞。 37℃で一晩インキュベートし、5％CO _2。
   2. 一晩のインキュベーション後、廃棄HDF媒体の半分とはMESC-CMと制御媒体を追加します。 37℃で24時間、5％CO ₂インキュベートします。
   3. 3.1で説明したステップとして、細胞をトリプシン処理し、300×gで5分間遠心操作します。冷PBS溶液で細胞を洗浄2500×gで3分間、2回遠心分離（PBS 0.5 mMのCaCl ₂を、2％FBS、1.5ミリリットルチューブあたり1ミリリットルで）。冷PBS溶液100μlで再懸濁。
   4. ボルテックスしながら冷エタノールを200μlをドロップすることによって細胞を固定。少なくとも1時間、4℃で保管してください。
   5. ステップ4.2.3で説明したように、二回の冷PBS溶液で細胞を洗浄。
   6. 50μg/ mlのRNアーゼを含有するクエン酸ナトリウム緩衝液250μL（1.12％pH値8.5）に細胞を再懸濁。 37℃で30分間インキュベートします。
   7. クエン酸ナトリウム250μlのを追加します。50μg/ mlのヨウ化プロピジウムを含むバッファー。室温で20分間インキュベートします。
   8. ²⁰フローサイトメトリーを用いて、各試料中の10,000細胞を測定します。
3. 定量RT-PCR（図3C）
   1. 種子のHDFとステップ4.1.1と4.1.2で説明したように、MESC-CMを追加します。
   2. 製造業者のプロトコルに従ってRNA抽出キットを使用してのHDFからトータルRNAを単離します。分光光度計^21を用いて抽出した全RNAを定量化します。
   3. 製造業者のプロトコール²⁰に従って、オリゴ（dT）プライマーおよびM-MLV逆転写酵素を含む反応混合物の20μlに1μgの全RNAを添加することにより、cDNAを合成。
   4. グリーンPCRマスターミックスと特定の遺伝子プライマー（ 補足 表1）を用いて、リアルタイムPCR装置を用いてcDNAの増幅を測定します。 GAPDH発現を用いてデータを正規化します。以下のPCRプロトコルを使用します。最初のデ95℃で10分間naturation。 95℃で15秒間の45サイクル、55℃で20秒間、および72℃で35秒間。 95°C、60°Cで1分間、95℃で30秒間、および^60℃15で5秒で15秒間融解曲線ステージ。

結果

もともと、たmESCは、FBSおよび他のサプリメント（ 図1Aおよび2A）とのMESC培地中のMEFフィーダー上で維持されています。 CMは、フィーダー層、FBSまたは他のサプリメント（ 図1Bおよび2B）なし低血清培地におけるたmESCから収集しました。この培養条件は、潜在的なフィーダからの要因による汚染、FBS、または他のサプリメントなしMESC-特定の条件培地を収集することを可能にします。制御媒体たmESCことなく、同一の培養条件下で回収しました。

ⅰ）通常のMESC培養条件（ 図2A）およびii）血清および無フィーダー培養条件（ 図2B）：たmESCは、2つの培養媒体間の異なる形態を示します。 MESCコロニーは、MEF層上に成長し、通常のM...

ディスカッション

血清および無フィーダーMESC-CMの成功収集のために、以下の提案を考慮に入れなければなりません。最も重要な要因は、MESC-CMを収集するための初期継代たmESCを使用しています。以前は、初期継代MESC-CMは、後期継代たmESCと比較して、より良好なアンチエイジング効果を有することが示されています。たmESCの継代数は、それらの発生能¹⁶及び多能^17に影響^を与えることが報告されています。

さらなる研究は、抗老化作用を誘導するMESCのsecretome、特定の要因を分析するために必要とされているが、我々は、現在MESC-CMは、細胞レベルで老化を減少させるのに十分であると結論付けることができます。

若い細胞に戻って老化細胞を元に戻すMESC固有の分泌因子の同定は今後の研究のために重要となります。高品質は、このような抗体アレイ¹⁵のような分泌分子、上の分析についてD secretome分析、メディア収集プロセス（ステップ3）の間に洗浄工...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	Invitrogen	#11960-044
FBS	Invitrogen	#30044333	20%, ES細胞質
ペニシリンおよびストレプトマイシン	Invitrogen	#15140	50単位/mlのペニシリンおよび50 mg/ml ストレプトマイシン
L-グルタミン	Invitrogen	#25030	2 mM
非必須アミノ酸 (NEAA)	Invitrogen	#11140	100 &マイクロ;M
β-メルカプトエタノール	シグマ	#M3148	100 &マイクロ;M
白血病抑制因子	ミリポア	#ESG1107	100 units/ml
OPTI-MEM	Invitrogen	#22600
X-gal	Sigma	#B4252	1 mg/ml
パラホルムアルデヒド (PFA)	Sigma	P6148	3.70%
ジメチルホルムアミド (DMF)	Sigma	#D4551
フェリシアン化カリウム	Aldrich	#455946	5 mM
フェロシアン化カリウム	Aldrich	#455989	5 mM
NaCl	Sigma	#S7653	150 mM
MgCl<サブ>2	グマ	>#M2393	2 mM
マイトマイシン C	シグマ	#M4287	10 &マイクロ;g/ml
ヨウ化プロピジウム	シグマ	#P4170	50 &マイクロ;g/ml
TRIzol	Ambion	#15596018
M-MLV 逆転写産物 Promega		#M170B
Power SYBR Green PCR master mix	Applied Biosystems	#4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast	LONZA	#CC-2511
ボトルトップフィルター	Corning	#430513	0.2 μメートル