方法論記事

その場で検出および核マイクロ プローブ分析法を用いた金属酸化物ナノ粒子の単一細胞定量

DOI：

10.3791/55041

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2018年2月3日

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1Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), Université de Bordeaux, 2Centre d'Etudes Nucléaires Bordeaux Gradignan (CENBG), CNRS, 3Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), CNRS, 4Institut de Chimie de la Matière Condens é e de Bordeaux (ICMCB), Université de Bordeaux

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々 は元素存在原体外数量化と同様に、人間の細胞を検出するための手順について説明します。メソッドは、任意のセル型に適してし、単一細胞の in vitro金属酸化物ナノ粒子曝露における定量的化学分析に特に役立ちます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

化学元素イメージングに基づく微量分析の手法では、ローカリゼーションと細胞レベルで化学組成の定量を有効にします。彼らは生きているシステムの特性評価のための新しい可能性を提供、検出、ローカライズおよび金属酸化物ナノ粒子の生物的標本と環境の両方の存在を定量化に特に適して。確かに、これらの技術すべては (1 から 10 µg.g-1乾燥質量の最大) 感度 (i)、(ii) マイクロ メートルの範囲の空間分解能は、および (iii) 複数要素の抽出で関連する要件を満たします。これらの特徴を考えると、マイクロビーム化学元素イメージング力強く補完できるルーチンのイメージング技術など光と蛍光顕微鏡。このプロトコルでは、二酸化チタンのナノ粒子にさらされる培養細胞 (U2OS) の核マイクロ プローブ分析を実行する方法について説明します。細胞に成長する必要があり、光学顕微鏡で使用される特別に設計されたサンプル ホルダーに直接および核マイクロ プローブ分析段階で公開されます。思い切って凍結サンプルの低温固定細胞組織と元素分布の両方を保持します。同時核マイクロ プローブ分析 (走査型イオン顕微鏡、ラザフォード後方散乱分光法と粒子励起 x 線放射) サンプルに対して細胞密度のローカルの配布に関する情報を提供しますナノ粒子の細胞の内容と同様、化学要素。生物学、特に乗り越えるとをナノ粒子と生体試料間の相互作用の私達の理解を深める必要がありますナノメディシンの新興のコンテキスト内でこのような分析ツールの成長の必要性があります。特に、核マイクロ プローブ分析ナノ粒子ラベルを必要としない、ナノ粒子組成、表面の状態とは関係なく、細胞集団の個々 のセル レベルまで定量。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体のホメオスタシス、取り込みコントロール、同化、および別の微量元素 (外因性の無機化合物、金属イオン) の細胞内局在性によって決まります。これらのコンポーネントは、トレースの形では多くの場合がそれにもかかわらずシステム生理学に大きな影響を持つ可能性があります。したがって、正常と病理/強調した状況での細胞生化学的研究は、細胞の代謝機構の全体的な理解を目指してキー手順です。そのため、細胞内の化学的組成、構造とその関連代謝機能の調査を有効にするイメージング ・分析技術の開発が必要になります。非常にいくつかの方法がある特定のサンプルの全体的な化学的性質に関する情報の場で定量的な作品を提供することができます。別にバルク試料の分析の方法、その場で解析検討生体試料の整合性の質量や構造については、その成分の化学物質 (微量元素とイオン) は保持を失うことがなく、蛋白質。さらに、ナノサイエンスが発展するのにつれ、改良されたイメージングと細胞のスケールの環境モニタリングのための分析方法必要があります観察し、ナノ オブジェクトの動作との相互作用を定量化します。1

ナノ粒子 (NPs) は、範囲 1 から 100 nm の少なくとも 1 つの顔ディメンションを示すオブジェクトとして定義されています。2特定の物理化学的性質のため業界では広く NPs が使用します。NPs は、ナノメディシン、バイオ アプリケーションでを使用しています。3,4 NPs の多数の物理化学的特性、にもかかわらずに、彼らは人間の健康や環境に及ぼす悪影響のいくつかのリスクを生成可能性があります。これらのリスクを様々 な濃度で長期反復的な露出によって誘起すること、これがまだ確立されていない明確に。5,6,7,8特に、細胞と関連付けられている細胞の応答内の NPs の運命は、日付、完全には説明されています。これは検出を許可するメソッドの希少性と単一のセルに内面化された NPs の定量化のための一部です。9

ナノ粒子の細胞投与量が質量分析法 (MS) 系を推定する古典的な分析道具誘導結合プラズマ MS (ICP-MS)10,11と液体クロマトグラフィー MS (LC-MS)、しかし、彼らのみを提供マクロ スケールでの有用な情報。それらのどれもは、細胞内の NPs コンテンツも分別方法使用せず NPs 分布の正確な評価を提供できます。用量反応の体系的な評価は、こうして核マイクロ プローブ分析12,13, 放射光蛍光 x 線顕微鏡14 など原子の分光に基づく方法ではなく、これらのメソッドでは不可能です。と二次イオン質量分析 (SIMS)。15,16彼らは蛍光顕微鏡を用いて観察を補完するために、NPs 蛍光分子と分類することはできません、したがって、自然な状態で研究されている場合は特に、これらのメソッド、特に興味深いものです。ある程度としても、fluorophores が付いている NPs に接木される (i) 定量化は難しい NP あたりタグのレベルは知られている、(ii) NP 表面の化学修飾はその細胞の分布を変更可能性がありますので。

この記事では、形態と元素組成のメジャー、マイナー、生体試料のイメージングを目指して核プローブ技術の組み合わせに基づく方法に焦点を当てるし、濃度をトレースします。

核マイクロ プローブ分析特に生体内微量元素の測定に適していることを証明します。梁の横方向分解能 (1 に 0.3 μ m) と元素の検出感度 (10 µg.g 1 から-1乾燥質量) 細胞レベルでの研究に適しています。核プローブ技術は、放出後、サンプルで現在の原子と相互作用 (MeV エネルギー通常実行して) イオンビーム粒子検出 (光子、電子、イオン) に基づいています。細胞に生じる相互作用は、主に: 1) その基本的な状態に戻ってから原子光子の放出が続く原子の励起・ イオン化・ 2) 彼らのエネルギーおよび方向の変更につながる受信粒子の拡散。相互作用に関与する原子の放出粒子エネルギー簡便同定の測定。要素のマッピングを実行するには、イオン マイクロビーム繰り返しスキャンのサンプル表面上頻度が約 100 μ m2を含むいくつかの細胞で 100 部以上。生成された粒子が検出され、各ビームの位置に彼らのエネルギーが記録されます。粒子ビーム位置に従って並べ替え、データ処理の目的は、そのような粒子の排出を担当の構造を識別する方法します。ここで、正確に蛍光顕微鏡と検出し、生活と NP の相互作用の結果を調査するために細胞と細胞内のスケールで外因性の NPs を定量化する核マイクロ プローブ分析に基づくを説明します。システム。我々 は、細胞レベルで酸化チタン (TiO2 NPs) ナノ粒子集合体の場で数量の面でこのメソッドによって提供される機会に特に集中しなければなりません。

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プロトコル

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1. 試料ホルダー

  1. サンプル ホルダーの設計と準備
    1. 1 mm 厚のピーク フレームで 5 mm × 5 mm 正方形の掘削試料ホルダーを製造します。
    2. エタノール 70% (v/v) と洗浄によってきれいにしおいてください滅菌プレートを使用する準備ができるまで。
      小説細胞培養と細胞処理に適したサンプル ホルダーが必要です。それは細胞培養、体外観察光学顕微鏡と核マイクロ プローブ分析法とイメージングのために設計する必要があります。このホルダーは、ピーク フレーム13製です。
  2. 試料ホルダー
    1. クロロホルム 100 ml ホルムバール粉末の 1 mg を溶解してホルムバール ソリューションを準備します。
    2. 倍示すないように金属製のフレームにポリカーボネート箔をストレッチします。
    3. サンプル ホルダー穴の周りホルムバール ソリューションを広げるため滅菌チップを使用します。
    4. 伸ばされたポリカーボネート製箔 (5 mm × 5 mm の正方形) に接着剤と試料ホルダー繊細な下に置きます。
    5. 各複製の 1 つのサンプル ホルダーを準備する前の手順を繰り返します。
      小説ポリカーボネート (PC) フィルムは生体適合性、十分な厚さとさまざまなプロトコルおよび分析の制約に耐性です。
      注意- クロロホルムは有毒であります。吸入、摂取を避けるか、皮膚との接触します。常に適切に機能している化学発煙のフードと適切なフィルターを使用します。
  3. サンプル ホルダー滅菌
    1. インキュベーター/攪拌機を使用して一晩、180 rpm、37 ° C で撹拌下でエタノール 70% (v/v) の 50 mL の三角フラスコにマウントされた試料ホルダーを配置します。
    2. 滅菌蒸留水に数回ホルダーをすすいでください。
    3. 空気は無菌状態で乾燥し、それぞれの側に 30 分の紫外光 (クラス II、バイオ セーフティ ベンチから殺菌ランプ) にそれらを公開します。
    4. 使用する準備ができるまで滅菌 12 ウェル プレート (ウェルあたり 1 つのサンプル ホルダー) のサンプルを保ちます。
      注:複数の試料ホルダーは、滅菌と乾燥 12 ウェルのプレートが数日間パラフィルムでシールに室温で保存できます。

2. 適切な試料ホルダーの細胞の成長。

注意:プロトコルは、バイオ セーフティ層流ベンチ (クラス II) 汚染微生物を除外するために遂行されなければなりません。手袋と抗生物質 (例えばペニシリン、ストレプトマイシン) を処理します。生物学的材料 (細胞、遺伝子組み換え由来ひと細胞) を処理するときのベスト プラクティスを尊重します。

重要:使用細胞をチェックマイコ プラズマの感染にしていないことを確認する必要が。

  1. プラスミド ベアリング メーカーによって確立されたプロトコルに基づきトランスフェクション法を使用してマトリックス roGFP 17,18,19 U2OS セルラインを transfect します。
  2. プラスミド実施にトランスフェクションを確認するバイオ センサーとプラスミドの損失を防ぐためを選択し、適切な培地の transfected セルを維持します。
  3. 蛍光顕微鏡、トランスフェクションが発生したことを確認し、蛍光性の発現と網状と管状のミトコンドリア ネットワーク19の表示を確認して transfected セルを視覚化します。
    ポイントを一時停止:細胞は、数年間液体窒素で凍結することができます。
  4. サブ コンフルエントの細胞集団を得るために、適切な培地で細胞を培養して transfected セル人口を使用します。37 ° c、5% (v/v) CO2飽和水雰囲気の中で細胞を成長します。
  5. 種細胞濃度は, などは 80% の合流点で、固定の日。通常、μ L あたり 500 セルの濃度を使用可能性があります。0.25% トリプシン-EDTA の 400 μ L を使用してセル (v/v) を収穫し、37 ° C で 3 分間保持培養液の 1 ml のトリプシン アクションを停止します。230 x g と +4 ° C で 5 分間遠心分離によって細胞のペレット、培養上清を削除し、新鮮な培養液中の目的のボリュームを追加します。
    注意してください。プロトコルは、すべての細胞のタイプの適用と播種された細胞の数は、セル サイズと細胞倍加時間依存。
    注意:トリプシン、抗生物質や血清を凍結融解の繰り返しに服従させることを避けます。それらは滅菌してください。因数に原液を分割し、− 20 ° c. でそれらを凍結有効期限日まで採取を格納します。慎重にトリプシンを完全に除去するために細胞ペレットをすすいでください。残留トリプシンの痕跡は遅延し、めっき効率を減らします。
  6. セルをカウントし、新鮮な完全培地 μ L あたり 500 細胞と細胞懸濁液を得るために 37 ° C で保管と希釈を実行します。
    注:細胞懸濁液の濃度は 40 μ L のドロップをメッキするために携帯型の関数としてアレンジしています。
  7. ポリカーボネート箔の中心ドロップ 40 μ L をプレートします。37 ° C で 2 時間、5% (v/v) CO2のサンプルが、飽和水雰囲気慎重にします。
    重要な:インキュベーターのサンプルを配置すると後は、制限可能な限り高速細胞付着を支持するすべての機械式ムーブメントです。セルの種類に応じてセル編んで効率を最適化する 2 時間以上インキュベートする必要ことです。チェック滴が蒸発するを防ぐために飽和インキュベーター大気はよくあること。
  8. 細胞がよく光学顕微鏡を用いたポリカーボネートの箔に接続されていることを確認します。軽く新鮮な完全培地 2 mL を追加し、24 時間を維持します。

3. ナノ粒子作製と露出

注: 蛍光色素修飾 TiO2 NPs された設計、合成、およびテトラメチル ローダミン イソチオ シアン酸 (TRITC) で化学修飾しました。20,21この表面改質によりナノ粒子検出、追跡およびローカリゼーションの in situおよびcellulo の生活と固定の両方のセルまたは多細胞生物。12,13,18

注意:ナノ材料、ナノ粒子は、慎重に取り扱う必要があります。吸入、摂取を避けるか、皮膚との接触します。エアコンの普及を防ぐためには、ナノ粒子は、ソリューション (純水) に保持されます。

  1. 1 mg.mL− 1 TiO2純水 NPs の懸濁液を準備します。RT で強烈な 1 分の超音波パルスを用いた TiO2 NPs を分散 (750 W、20 kHz 振幅: 30%) 超音源と専用円錐型のプローブを使用して。
  2. 4 µg.cm− 2 (最終濃度) の露出の懸濁液を得るために TiO2 NPs 培養培地に必要な濃度を希釈します。媒体を置き換えますセルの中含む NPs の適切なボリューム、均一に分布 TiO2 NPs。 準備の TiO2 NPs の添加せず同様に制御の細胞を軽く混ぜます。
  3. 37 ° C、5% (v/v) CO2と飽和水雰囲気で 24 時間のセル人口を孵化させなさい。

4. パラホルムアルデヒド固定、蛍光顕微鏡検査。

  1. パラホルムアルデヒド溶液 (PFA、4 w/v) リン酸バッファー生理食塩水 (PBS、pH 7.4) にバッファーの新鮮なソリューションを準備します。
    1. 100 mL の PBS で PFA 粉末 4 g を溶解します。ヒューム フードの磁石と磁性攪拌器を使用して攪拌しながら 65 ° C への解決策を加熱します。ソリューションを消去するまで、一度に 1 メートル naoh 水溶液 1 滴を追加することによって pH を高めます。部屋の温度にソリューションを冷却し、pH 7.4 に調整。作りたてのソリューションを使用して、すぐに +4 ° C で維持や光から保護します。
      注:良質の固定と固定サンプルの長期保全を保証して PFA の場しのぎの準備しかし、既製の PFA ソリューションを使用できます。
      注意:PFA は有毒である;吸入、摂取を避けるか、皮膚との接触します。常に適切に機能している化学発煙のフードと適切なフィルターを使用します。
  2. 一度、インキュベーション時間が経過、TiO2 NPs。 リンス新鮮な培養液を一度と PBS (2 mL) のセル人口を含む培養液を削除します。PBS を削除、新鮮で冷たい PFA (4 %w/v, +4 ° C) の因数ですぐに洗い流してください。
    1. PFA (2 mL、4 %w/v, +4 ° C) を追加します。室温で 15 分間インキュベートします。
    2. PFA を取り出し、攪拌下の PBS (2 mL、3 回、5 分) でセルをすすいでください。
      ポイントを一時停止:蛍光イメージング (ステップ 5 に進む) 後「プランジ凍結"プロシージャこれらサンプルを化学的に固定使用できますまたは蛍光イメージング (4.3 ステップに進む) にのみ使用します。
  3. ヘキスト33342アドロイに PBS で 10 分間で核を染色します。Hoescht33342が 500 の最終的な集中で使用される nM。孵化後ソリューションを削除し、PBS で洗い。
    注意:ヘキスト33342セル側の透過物であり有害である可能性があります。直接接触を避けるし、準備し、ヘキスト33342を使用しながら手袋を使用します。
    重要:染色液ヘキスト33342は新鮮な準備、無菌状態で維持されることを確認します。
  4. プロセスは、その場で蛍光顕微鏡 (図 1) を用いた単一細胞イメージングのためのサンプルを修正しました。

5「凍結」固定・脱水

  1. 転送、アルミの板を準備するには、液体窒素で冷却します。ストア ボックスにプレートで液体窒素を充填、低温窒素の蒸気で液体上プレート表面を維持します。
    注:転送プレート作ることができる任意の金属板 (ここでは、私たちは、アルミニウムを使用) は液体窒素の温度に冷却できるし、凍結乾燥試料室を入力します。
    重要な:ボックス保管すべき閉鎖可能な限り水蒸気コールド プレート表面沈着を防ぐために。液体窒素で、準備中にプレートに格納されているサンプルは扱いません。
  2. 細胞培養液中に一度すすいで、2 回より、簡潔に、得るために生殖不能および超純水水で取り除く任意の残りの細胞外塩のトレース。
    重要な:メディアが新鮮な調製し、無菌状態で維持されることを確認します。37 ° C ですべてのメディアを使用する前に加熱します。リンスは非常に短い (数秒) する必要があります、サンプル液の過剰はできるだけ早く削除されます。
  3. 思い切って凍結細胞-150 ° c で液体窒素冷蔵 2-methylbutane 30 s と場所の間にアルミの上にそれらはプレートを転送します。他のすべてのサンプルの準備の間にここでのサンプルを格納します。サンプルはすべて cryofixed である場合は、凍結乾燥機で転送プレートを配置することによって一度ですべてを転送します。
    重要な:全体的な cryofixation プロセス転送ボックスに一時的に格納されているサンプルに表示されるための構造変更を防ぐために 20 分以上続くこと。
  4. 次のシーケンスを使用してサンプルを凍結乾燥: 1) 12 を 24 h (-99 ° C, 10-3 mbar)、低圧・低温の一次乾燥を実行し、2) にプレート温度の上昇、少なくとも 24 時間の二次乾燥段階を実行+ 40 ° C (+40 ° C, 10-3 mbar) 低圧を維持しながら。
    注意:液体窒素は非常に寒いと接触すると凍傷または目の深刻な被害を引き起こす可能性が。輸送のため適応ベンチ トップ コンテナーを使用し、(低温手袋、眼と顔の保護)、安全具を着用します。
    注意: 2 Methylbutane は非常に可燃性です。空気の有害な汚染は +20 ° C でこの物質の蒸発でより迅速にアクセスできます。吸入、摂取を避けるか、皮膚との接触します。呼吸と目の保護と手袋を使用します。常に適切に機能している化学発煙のフードを使用します。+4 ° C で保存されている可能性があります。
    重要な:「プランジ凍結」のセッション中に 2 Methylbutane 温度を監視する適切な温度計 (-150 ° C) を使用します。2 methylbutane は、液相で冷やしておかなければなりません。周囲の雰囲気に cryofixed のサンプルを転送する温度上昇または水蒸気サンプル表面に結露しないことによる細胞の損傷があります。転送が行われるに応じて、合理的に可能な限り高速 (30 s)
    ポイントを一時停止:Cryofixation 後、サンプルは、(ほこりや湿気から保護) 滅菌と乾燥条件で数日間常温保存できます。慎重に微細鉗子での検体、パラフィルムでシール滅菌 12 ウェル プレートにそれらを置きます。乾燥剤を使用して、雰囲気を乾燥できます。

6. 核マイクロ プローブ分析法

注: 核マイクロ プローブ分析を行った補完イオン粒子励起 x 線放出 (μ - ビーム分析技術を使用して AIFIRA (アプリケーション Interdisciplinaires デ Faisceaux d'Ions アン アキテーヌ地方) のマイクロビーム ラインでPIXE) と走査イオン顕微鏡 (μ-スティミュラス)。施設は、MeV エネルギー領域の光ビームを提供する 3.5 MV 粒子加速器に基づいています。22,23

ポイントを一時停止:AIFIRA は提案する実験の科学的な評価の後国内および国際的チームへのアクセスを提供するボルドー大学主催イオン ビーム施設です。

  1. 両面テープを使用して形状のプレートでピーク試料ホルダーをマウントします。
  2. 梁の方向に垂直な鉛直面内におけるサンプルのサポート プレートを配置します。
  3. 分析室を閉じて、分析室を掃除します。
  4. 走査型イオン顕微鏡 (μ-スティミュラス)
    注: スティミュラスをエネルギー損失 (µg.cm-2で表現) サンプルの密度に比例するという事実を利用して細胞質量エネルギー損失の変換後細胞の密度マップを記録する使用は。
    1. 約 300 の焦点面でサイズのプローブとして使用する 2 MeV ヘリウム (He+) マイクロビーム nm 径と低流暢 (2000 ions.s-1)。平面シリコン検出器 (検出器ピップ、25 mm2、5.4 MeV @ 11 keV エネルギー分解能) で送信されたイオンのエネルギー測定ビーム軸のサンプルの後ろに配置されます。
  5. 粒子励起 x 線放射 (μ PIXE) とラザフォード後方散乱分光法 (μ-RBS)。
    注: μ pixe 法と μ RBS 分析提供空間分布とサブミクロン分解能を持つ化学要素の定量化。
    1. 4 から 8 時間のスティミュラスと約 100 × 100 μ m2によって発見興味の同じセルで直径 1 μ m のスキャンに焦点を当てた 1.5 MeV プロトン (H+) マイクロビーム (50-150 pA) を使用します。
    2. 着信ビーム軸から 45 ° で配置されている高解像度 Si(Li) 固体検出器 (145 eV のエネルギー分解能, @Mn-Kα) によって (Na より重い) サンプルで現在の原子から放出される誘導 x 線光子を収集します。要素の濃度を決定するのにエミッタ (例えば要素の Z) と x 線強度の性質を識別するのに検出された光子のエネルギーを使用します。
    3. シリコン検出器を用いた-135 ° 後方散乱陽子を同時に収集 (部分的に劣化検出器、25 mm2、11 keV 5.4 MeV @ 半値幅) 受信の粒子数を測定して x 線強度を正規化します。
      重要な:認定された校正標準原子濃度分布の定量化のためのコレクションは、x 線検出器を校正するために使用されます。参考資料は、6.3 μ m 厚いマイラー箔の原子薄膜のコレクションです。20.2 0.6 (Li、K ライン) からの x 線エネルギー範囲を出力 keV (Rh、K 線)。

7. データ解析

  1. ImageJの IBA J プラグインを使用して化学元素マップを再構築します。24
    注: raw 核マイクロ プローブ分析データを処理する ImageJ のプラグインの形で専用ソフトをしました。Raw データは、時系列としてビーム位置と共に記録されているセルと粒子の相互作用から発生するイベントのリストに対応します。
    1. IBA J プラグインを使用の種類に応じてイベントを並べ替える: 後方散乱イオンのエネルギー (RBS) または x 線の光子のエネルギー (PIXE)、イオン エネルギー (スティミュラス) を送信します。その後、個別に各種類のデータを処理します。
    2. スティミュラス エリアマップの密度を計算します。
    3. X 線光子エネルギー スペクトルの平均を計算し、要素の空間分布を取得するために目的エネルギー ウィンドウの各化学要素の定義します。
    4. 領域 (ROI) (例えば個々 のセル、密集した構造、集計など)を定義し、対応する x 線スペクトルを計算します。
  2. 入射粒子25の合計数を計算するために対応する RBS スペクトルを分析します。
  3. X 線スペクトルの各 ROI の元素濃度を決定するために Gupix ソフトウェア26を使用してフィットします。
    注: メソッドの検出 (LOD) の典型的な制限範囲 1 に 10 µg.g-1 (LOD は Z と小さくなります) 要素の原子番号によって乾燥質量では。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞培養と蛍光に分類されたティオの蛍光イメージング2NPs

マルチ モーダル分析と同様、細胞培養、細胞処理に適したサンプル ホルダーを考案しました。具体的には、ホルダーがよく原子マイクロ プローブ分析法とイメージング ルーチンの光学顕微鏡検査を許可することが重要だった。このサンプル ホルダーは、ピーク フレーム上に堆積 2 μ m 厚のポリカーボネート製箔に基づいています。セルがポリカーボネート、数日間培養条件の上に直接成長させたし、NPs 露出など、さまざまな実験的設定の使用します。

(TRITC) fluorophores が付いている化学的表面改質は、生活またはパラホルムアルデヒド固定蛍光顕微鏡を用いた細...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

特に細胞内のレベルで、他のイメージング技術で何ができるを超えて有用な情報を提供する手法を提案します。そのイメージングの能力に加えて、核マイクロ プローブ分析法は、生体試料の組成に入る化学要素の定量化の可能性を提供しています。本研究ではひと細胞集団と TiO2 NPs にさらされる単一のセルに基づいて選択した領域の解析に焦点を当てて.他の技術との組み合わせは、元素の組成形態細胞イメージングと正確な定量的データの両方を提供します。

核マイクロ プローブ分析を正常に適用するには、潜在的な落とし穴を避けるために次の点を考慮するは必須です。まず、その微細構造とその生化学的整合性を保持するために低温セル固定のプロトコルを使用することが不可欠です。第二に、厚さ 20 μ m 以下の薄膜試料の分析を実行する必要はも。必要な場合は、cryofixed のサンプルの断面が実行でした。サンプルは、絶対に冷凍保管すべき。第三に、それも核マイクロ プローブ分析が生体試料の二次元表現を明らかにすることを念頭に重要です。したがって、得られた元素分布は誤解を招く可能性があることができる二次元...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

演出ビデオの編集、セルジュ ・ Borderes に感謝します。フランス国立研究機関は、研究プログラム チタン (ANR CES 2010 年、n ° CESA 009 01) をサポートしています。CNRS との統合活動として欧州共同体は、「サポートの公共および産業研究を使用してイオン ビーム技術 (精神)」EC 契約 n ° 227012 下を提供。この作品は、EC 契約第 317169 の下でマリー キュリー アクション -、「統合活動支援大学院研究とインターンシップで業界とトレーニングの卓越性」(スプライト、D1.3) として初期研修ネットワーク (ITN) によってサポートされています。C'NANO グランド シュッド ウエストと地域アキテーヌ研究プログラム TOX ナノ (n ° 20111201003) と研究プログラム POPRA (n ° 14006636 034) をサポートします。

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材料

マイクロ

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞培養
U2OSATCC、LGC 標準ATCC HTB-96
培地 MCCOY 5A w/o L-グルタミンドミニク・ダッチャーL0211-500
FBS 500 mLドミニク・ダッチャー500105U
ペニシリン/ストレプトマイシン サーモフィッシャーサイエンティフィック11548876
 L-グルタミン 200 mM, 100 mL Invitrogen25030024
Geneticin,  20 mLThermoFisher Scientific10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mLThermoFisher Scientific11570626
Viromer RedLipocalyxVR-01LB-01
Matrix-roGFP PlasmidAddGene#49437
Hoechst 33342サーモフィッシャーサイエンティフィックH3570取り扱い
<ストロング>NPs調製
TiO2 P25 AEROXIDEDegussa/Evonik
テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)SIGMA-ALDRICHT3163NPs
<ストロング>サンプル調製
ポリカーボネート箔GoodfellowCT301020
Polyether エーテル ケトン支持体 (PEEK)MatechplastA-239-4047
エタノール、ACS 絶対SIGMA-ALDRICH02860-6x1L
クロルホルム、無水、99%SIGMA-ALDRICH372978-1L 注意 有毒
Formvar 100 g寒天科学AGR1201有害です。10 µの濃度で使用します。クロロホルム
NaOHSIGMA-ALDRICHS5881-500G
Sample fixation
Powder、95%パラホルムアルデヒドSIGMA-ALDRICH158127-500Gの1mLあたりのg注意は有毒です。PBS
PBS(pH 7.4、Ca2+およびMg2+なし)サーモフィッシャーサイエンティフィック11503387
Prolong Gold 退色防止試薬サーモフィッシャーサイエンティフィックP36934
トリトン X-100SIGMA-ALDRICH93443有害
<強>サンプル凍結固定
液体窒素空気液体サンテ有害な
メチルブタン>=99%SIGMA-ALDRICH&nbsp;M32631-1L注意 有毒
アルミニウム トランスファー プレート自家製
蒸留水と脱イオン水自家製Barnstead Smart2Pure システムを使用して実験室で製造
ParafilmVWR52858-000
Equipment
Barnstead Smart2PureThermoFisher科学50129870
バイオセーフティベンチ、クラスIIサーモフィッシャーサイエンティフィックMSC-Advantage
TC20 自動セルカウンターBiorad145-0102SP
カウンティングスライド 2ウェルBiorad1450016
PIPS検出器、25 mm2、12 keV エネルギー分解能 @5.5 MeVキャンベラ PD25-12-100AM
高分解能Si(Li)固体検出器、145-eVエネルギー分解能、@Mn-Kαオックスフォード・インストゥルメンツ
エバーハート・ソーンリー型二次電子検出器(SED) オルセー物理学1-SED
XRF 校正標準 ナトリウムまたは塩素 NAClマイクロマター34381
XRF 校正標準 マグネシウム MgF2マイクロマター34382
XRF 校正標準 アルミニウム AS アル金属マイクロマター34383
XRF 校正標準 シリコン SIOマイクロマター34384
XRF校正標準 硫黄 CuSxマイクロマター34385
XRF校正標準 CaF2マター34387
XRF校正標準 チタン金属マイクロマター34388
XRF校正標準 鉄アズフェ金属マイクロマター34389
ソニケーター750Wソニックス材料11743619
3MMマイクロプローブバイオブロック 科学220-05
真空凍結乾燥機ElexienceEK3147
光学顕微鏡 Zeiss AxioObserver Z1Carl Zeiss MicroImaging, GmbH431006-9901
電動ステージ xyCarl Zeiss MicroImaging, GmbH432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 対物レンズCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 対物レンズCarl Zeiss MicroImaging, GmbH420781-9910
Zeiss filterset 02Carl Zeiss MicroImaging, GmbH488002-9901
ツァイス フィルターセット 38HECarl Zeiss MicroImaging, GmbH489038-9901
ツァイス フィルターセット 31Carl Zeiss MicroImaging, GmbH000000-1031-350
化学ヒュームフードErlabCaptair SD321
粒子加速器HVEEsingletron
Software
ImageJ softwareNational Institutes of health, USAImageJ 1.51
SimNRA softwareMax-Planck-Institut für Plasmaphysik, ドイツSIMNRA 6.06
Gupix softwareグエルフ大学, カナダGUPIXWIN 2.2.4
の4%溶液として使用

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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