頭頸部扁平上皮癌における神経周囲の浸潤のためのモデル

サマリー

神経周囲浸潤(PNI)は、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の一般的な特徴であり、生存率を低下させます。そのメカニズムはよく理解されていません。半固体マトリックスに閉じ込められたマウスの後根神経節から生成された神経突起を利用して、HNSCC細胞株のPNIに関与する経路を調べることができます。

要約

神経周囲浸潤(PNI)は、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の約40%に見られます。手術、放射線療法、化学療法による集学的治療にもかかわらず、局所領域再発と遠隔転移の発生率が高く、PNIを併用しないHNSCCと比較して全生存期間が40%減少します。HNSCC PNIに関与する経路のin vitro研究は、一貫性のある再現性のあるアッセイがないため、歴史的に困難でした。ここで説明するのは、HNSCCにおけるPNIの検査のための後根神経節(DRG)アッセイの適応です。このモデルでは、DRGは犠牲にされたヌードマウスの脊柱から採取され、半固体マトリックス内に配置されます。その後の数日間で、神経突起が生成され、DRGの細胞体から放射状に成長します。次に、HNSCC細胞株をマトリックスの周囲に周辺に配置し、神経突起に沿ってDRGに向かって優先的に侵入します。この方法により、複数の処理条件を迅速に評価でき、非常に高いアッセイ成功率と再現性が得られます。

概要

頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)は、米国で6番目に多い癌であり、全国で年間10,000人が死亡し^{、世界中で年間}300,000人が死亡しています1。HNSCCの全体的な予後は、過去数十年間50%で変化していません。神経周囲浸潤 (PNI) は、HNSCC 患者の予後不良の前兆となる最も顕著な病理学的特徴の 1 つです。残念ながら、PNIはHNSCCで頻繁に発生し、HNSCC患者の最大40%に見られます^2,3。

PNIは、悪性細胞が神経に沿って隣接する組織まで追跡するプロセスであり、局所的および遠隔的な広がりの割合を高めることができます。したがって、PNI陽性のHNSCC腫瘍は、局所領域の再発率と遠隔転移の割合が高く、PNI^4-8のないHNSCC患者と比較して全生存期間が低くなります。

PNI患者の治療は通常、手術、放射線療法、化学療法によって最大化されますが、これらの患者の全生存率は、PNI^9-11のない患者と比較して最大40%減少します。したがって、HNSCCの現在の治療法は、PNIに関連する予後不良の改善に効果がないことは明らかです。HNSCCでPNIに対する標的療法を開発するアプローチは、このプロセスを調節する要因の理解が不十分であるために妨げられてきました。これは、部分的には、HNSCCにおけるPNIの研究のための一貫したin vitroモデルの欠如の結果です。

近年、いくつかのグループが主に膵臓がんと前立腺がんのPNIを研究するためにin vitroモデルを利用しています^12-19。このモデルは、マウスやラットから分離された後根神経節から生成された神経突起を大神経浸潤の代理として使用します。後根神経節は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫細胞によって分泌される可溶化された基底膜タンパク質混合物である因子枯渇した半固体マトリックスに固定されています。このマトリックスは、神経突起の伸長と、これらの神経突起に沿った単一の癌細胞の追跡を可能にします。ここで説明するのは、HNSCCでのPNIの検査のためのこのモデルの適応です。

プロトコル

1.培養培地の調製と料理（10分）

1. 100μLを96ウェルV底プレートのウェルに、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を加えます。
2. 20℃の冷凍庫から半固体マトリックスの約100μLの前等分し、バイアルを取り外し、氷の上に直接配置します。
   注：半固体マトリックスは、その後の工程のために必要である、氷の上に液体状態に達するのに約30分かかりますので、この前後根神経節に（DRG）の収穫を行います。すべての回で、氷上で半固体マトリックスを維持するために失敗すると、低品質のマトリックス液滴を発生します。
3. ラベルグラスボトム永久インクでの培養プレート、プレートの下面に四隅のそれぞれに一意の識別子を作成します。プレート表面を冷却するために氷の上にプレートが右サイドを置きます。
   注：各マウス利回り32から40 DRGので、1から40にラベルを付けそれはプレチルパイする必要はありませんチルドのヒントは、潜在的に、マトリックス液滴を配置する行列の一貫性の違いを導入するコースを渡って温めますよう、ヒントをペット。

マウスDRGの2解剖（45分）

1. 例えばCO ₂室と開胸の使用を通じてなど、特定の研究室プロトコル、あたりなどの無胸腺ヌードマウスを安楽死させます。
2. 解剖エリアと顕微鏡を設定します。 15-または50-mLコニカルチューブ用ポリスチレン容器の、きれいな滅菌し、平らな底面を使用してください。
   注：また、彼らは、使い捨て、安価であるため、解剖面として使用するのに適しており、ピンまたは針を使用して脊柱の固定を可能にします。唯一の滅菌機器や針を使用しています。
3. 自然なビジョンの下では、直線状または曲線状の微細なハサミを持つマウスの頭に尾の付け根から背骨に沿って縦切開を行います。
4. SACRの下に横方向に分割する同じハサミを使用してくださいアル背骨。背骨の両側にハサミを使用して頭蓋底までのすべての方法を分析。この時点で、頸椎が頭蓋できるだけハサミで横に切開されていることを確認してください。
5. 低電力で手術用顕微鏡下で脊柱の子宮頸終了を確認します。白い脊髄は傍脊柱筋群および軟組織の可変量に囲まれている骨リングの真ん中には明らかです。
6. 微視的な春のはさみで3椎体 - 背側または第2の優れた面を分割します。ハサミのバネ作用を使用して、椎体の解剖は正中線で発生したことを確実にするために、この初期の骨のカットを開きます。仙骨に向かって少しずつ続行し、次に椎体の腹側または下面に同一のカットを完了することによって、背骨を二分します。
   注：下のDRG収率をもたらす骨脊柱の正中切開を確保するために失敗しました。
7. THIでS点は、脊柱を二等分に分割されています。代わりに脊髄で、脇1ヘミ背骨を置き、滅菌プレートに下向きに。
   注：DRGを脊髄に深いような場所に脊髄を残して、乾燥からのDRGを防ぐことができます。
8. ポリスチレン解剖プラットフォーム上の2つの18ゲージの針を他のヘミ背骨の両端を固定します。子宮頸終わりに出発し、穏やか約4椎レベルから脊髄をバック剥離、（背骨が狭いので明らかである、DRGは互いに接近している、とリブ挿入があります）。
9. DRGを接続する感覚神経（通常は2）を確認します。神経がDRGに挿入する領域で、静かに微細な鉗子で周囲の筋膜を把握します。 DRGを解放するために微細な春のはさみでこの筋膜およびその他の神経組織を解剖し、トリム。穏やかな後退は、骨、脊椎内のその位置からDRGをもたらすでしょう。
   注：増加この段階で、顕微鏡力が有益です。 DRGへの圧挫損傷は大幅に神経突起の成長を制限します。これは、直接DRGを把握することはありませんすることにより、むしろ周囲の筋膜を把握することにより回避されます。
10. DRGを解放するために微細な春のはさみで（DRGは一般的に解剖ビューに深い相対的なものである1末梢神経を持っている）、末梢神経をカット。
    注：それは神経が終了し、DRGはので、この時点でのDRGのできるだけ近くに、このカットを作り、緊張にしながら、始まりが理想的である把握するのが最も簡単です。この遠位枝が切断されると、近位の枝も同様にトリミングされています。
11. 微視的な春のハサミでの浮遊神経線維や筋膜の添付ファイルのDRGをトリミング。適切な単離後、96ウェルV底プレート内の室温の培地にDRGを配置します。
    注：プレートの下に暗い背景を配置すると、簡単にサブミリメートルホワイトのDRGを可視化することができます。唯一のEAC内の1つのDRGを置きます時間だけでなく、このように、それらは後の工程でより容易に説明することができます。
12. すべての方法1ヘミ背筋がこのプロセスを繰り返し、その後、他の。 40から32を合計20のDRG、 - それぞれの側は、16が得られます。
    注：これより少ないたDRGがある場合、脊椎の解剖は、さらに頭または尾を行う必要があります。 DRGを1が尾側に進行するよう、ますますあまり明確になります。

半固体マトリックス液滴の調製（プレートあたり<1分）

1. 氷から一方のガラスだけでなく、底板を外し、手術用顕微鏡下に氷のブロックの上に置きます。マトリックスのアリコートは、すべての回で氷の上に残っていることを確認します。
2. よくガラスの端からの液滴自体と少なくとも同じ偉大な距離を残して、2-μLまたは10μLのマイクロピペッターでガラス底板の四隅に行列の1.5-μLの液滴を配置します。
   1. 上に直接ピペットの先端を置き45度の角度でガラス。ゆっくりと行列をピペット。行列が板に従事した後、ゆっくりとガラス底部から離れます。
      注：行列とガラスとの間の表面張力が完璧な半球を毎回作成する必要があります。
   2. 行列の液滴への空気の不慮の注入は、行列の液滴の直径がはるかに大きくなり、除去するのが困難であるためである。先端が、空になる直前にピペッティングを停止
      注：ピペッティング手を安定させるために秒針を使用して、より正確な配置を容易にします。

半固体マトリックス液滴にDRGの4挿入（<プレートあたり2分）

1. 簡単に、室温（〜1分）でマトリックス滴でプレートを残します。これはわずかにDRGを正確に配置するのにそれが容易になり、マトリックスを補強します。
2. スクープ（把握していない）DRGそっと左手に閉じられた微細なピンセットで。ここでも、小さなに対して暗い背景、白DRGは、可視化を容易にします。右手に21ゲージの針の先端にDRGを転送します。この転送は鉗子上の残留メディアを残します。
3. 静かに21ゲージの針（ 図1）を使用して、マトリックス液滴の中央にDRGを挿入します。ほとんどの時間、DRGを容易にマトリックスに放出され、その後針を中央に配置することができます。
   1. DRGが針に付着した場合、針のオフとマトリックス液滴にDRGをプッシュするために微細な鉗子を使用しています。ラボでの微視的鉗子から余分なメディアをワイプ吸い取ります。
      注：行列への紹介メディアは、アッセイの直径、体積、および一貫性が変更されます。色や色の書き込みと氷のブロックは、この繊細なプロセスの可視化を容易に背景のコントラストを、提供します。
4. プレートはすべて4のDRGを持っていた後、DRGは、行列滴の中心にあることを確実にするために、最終的な検査を行います。調整を行います21ゲージの針を用いて、必要に応じて。
5. 37℃のインキュベーターに完成したプレートを転送します。これは、半固体マトリックスを固化した位置にDRGを修正します。
6. DRGのすべてについて、この手順を繰り返します。陰性対照としてDRGずにブランクマトリックス液滴を配置します。
7. すべてのプレートを完了し、少なくとも3分間37℃のインキュベーターにそれらを露出させた後、各ガラス底プレートに10％FBS培地を含むDMEMの4 mLを加え。わずかな角度でプレートを置き、ゆっくりと、それは徐々にマトリックス-DRGユニットと接触するように、メディアを追加します。
   注：媒体が速すぎるか、積極的に追加された場合、マトリックスおよび/またはDRGは追い出さになることができます。
8. 72時間 - 次の48を37℃のインキュベーター中でアッセイを保管してください。
   注：アッセイの定期検査では、行列のエッジ（ 図2）に向けて神経突起の周方向の伸長が表示されます。神経突起は、マトリックスへの道の4分の3よりも大きい場合には、それを細胞をプレーすることが適切です。

頭頸部癌細胞の5準備

注：頭頸部扁平上皮癌細胞以外の細胞株は、この実験の設計に使用することができます。

1. 37℃のインキュベーター中で好ましいフラスコまたは培養皿に10％FBSを含むDMEM中に扁平上皮癌細胞株を維持します。すべての培地培養フラスコまたはディッシュから実験、吸引用の細胞を調製し、PBSで2回それを洗浄します。 10％FBSを含むDMEMに続いて、5分間、0.025％トリプシンを適量添加することにより細胞を懸濁。 6 mLの培養皿への細胞および培地混合物のピペット4ミリリットル。
   注：6 mLの培養プレートは十分な細胞でも、50％未満コンフルエント以上のものを提供します。
2. 染色およびDRGアッセイにメッキの24時間前に異なる条件にHNSCC細胞株を公開します。再線量細胞は一貫environmeを維持するためにメッキされた後の状態をNT。
   注： - マトリックスへのDRGのマウスを解剖し、移植後2日目の細胞培養皿に1抗体、成長因子、サイトカイン、または他の分子を加えます。
3. （ - 3日マトリックスへのDRGの収穫と移植後2）細胞をプレーティングする前に、蛍光細胞の汚れを1時間を追加します。
   注：ここで使用される特定の汚れは、細胞膜を自由に通過。しかしながら、細胞内のチオール基と反応した後、染色は、細胞内に留まると娘細胞に受け継がれます。染色は大幅アッセイ内の可視化を容易にします。これらの実験の時間枠である3日、 - 蛍光は2のために存在しているので、これらの一時的な汚れは、これらのアッセイのために理想的です。また、多くの異なる色の使用を可能にし、蛍光タンパク質、トランスフェクトされた細胞株を作成する必要がなくなります。
   1. 無血清DMEMの2mLに2μLの10mMストック細胞の汚れを混合することにより、色素溶液の10μMの準備すべてのセルの状態のため。細胞に添加する前に37℃にこれを暖めます。
   2. プレートに付着HNSCC細胞を残し、6 mLのプレート内の培地を除去します。 DMEMを各プレートに添加し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の2 mLを加え、10μM細胞染色/無血清2mLのを削除
   3. 40分間37℃のインキュベーターに細胞染色で6 mLの培養プレートを返します。
   4. 40分後、培地を吸引除去します。 PBSの2ミリリットルを追加し、それを吸引除去します。各プレートに0.025％トリプシンの1 mLを加え、37℃のインキュベーターでそれらを交換してください。
   5. 3の後に10％FBSを含むDMEMの2mLのを追加 - 5分および15-mLコニカルチューブに懸濁した細胞を移します。細胞をスピンし、10％FBSを含むDMEMを1mLで再懸濁しました。
   6. 血球計又は自動化細胞カウンターで細胞をカウントし、その後mLの30万の細胞の最終細胞濃度を作成するために、10％FBSを含むDMEMを加えます。

6.メッキヘッドとNECK癌細胞

1. インキュベーターから行列-DRGアッセイとガラス底プレートを取り外します。
   注： - 3日神経突起は、一般的に2の後に起こるマトリックスのエッジへの道の少なくとも75％である場合もやはり、それらが適切です。これは最高の、少なくとも10倍の対物レンズを用いて見られています。
2. ガラス底プレート内の培地を吸引除去します。完全によくマトリックス-DRGユニットを取り外すことなく、ガラス内の培地を吸引除去します。
3. 200-μLのピペットを用いて30万細胞/ mL培地の200μLを描画します。各マトリックス-DRGアッセイを介して細胞の2滴を置きます。一方のプレート上の各セルの状態の4反復を作成し、各マトリックス滴に対してこの手順を実行します。
   注：行列の半球形状は、細胞が、アッセイ（ 図3a、図3b）の外周に沿ってリングに定住することができます。滑らかなトリガーとピペットを見つけることは、均一の配置ははるかに簡単に低下させます。
4. 同様の細胞数およびジを確認します4X顕微鏡下での様々な細胞条件のstribution。
5. 約60分間、37℃のインキュベーターにガラス底プレートを置きます。注：細胞および培地（〜150μL）のわずかなボリュームがありますがインキュベータ時間の数時間が経過するまで、アッセイが乾燥しないでください。
6. 60分後、そっとガラス底板の側壁に沿って10％FBSを含むDMEMの4 mLを加え。
   注：時間の期間にわたり、細胞が部分的にプレート底部に付着し、そして培地を添加する方法は、細胞に影響を与えません。異なる細胞型は、ガラス底プレートに付着し始めるために、多かれ少なかれ時間がかかるします。
7. 前の濃度レベルを維持するために、この時点で、任意の外因性薬剤または成長因子を交換してください。
8. 彼らは顕微鏡で検査されている場合を除いて、37℃のインキュベーターにアッセイを返します。顕微鏡イメージングによってこのアッセイの結果を定量化します。簡単に言うと、神経周囲浸潤の鎖を数えます4X顕微鏡画像を使用して、4つの象限インチ
   注：4X目的と蛍光機能を備えた顕微鏡は、光文書化アッセイのために適切です。アッセイの大きさは、神経周囲浸潤の個々の領域をキャプチャするのに十分な詳細である4X対物レンズの視野内にうまく収まります。神経周囲の浸潤は、24時間以内に明らかになったが、48時間を超えて、アッセイの整合性は、腫瘍細胞がマトリックスの周囲に沿って分割して侵入するように、弱体化し始めます。 48時間を超えて、明視野顕微鏡を用いて可視化を不明瞭DRG、からの線維芽細胞の実質的な流出もあります。したがって、このウィンドウの間に少なくとも2回のフォトドキュメント4X顕微鏡での結果と得策である（ 例えば、腫瘍細胞をプレーティング後24および48時間で）。これらは、3次元のアッセイであり、それは完全に画像全体を分析することは困難であることを留意します。ほとんどの神経周囲の浸潤は、プレートの底、トンから飛行機で発生します彼細胞はわずかにプレートの底の上にマトリックス中に埋め込まれています。この平面が水平に近いため、腫瘍細胞と神経突起の大半は4Xでの単一レベルの画像に取り込まれます。

結果

DRGの解剖とマトリックス液滴内で配置した後、アッセイの外観は、DRGが完全な円ではなく、それをマトリックス液滴内の中心に位置していることを、図1（注）のようになります。これは、部分的に、図2に示す360度における神経突起の伸長を可能にします。 DRGの特定の部分は、典型的には、遠心性と求心性神経の枝が入力され、それぞれ、DRGを出たところに対応し、他のものより速く、より大きな数字で神経突起を送り出すことに注意してください。我々は、このために無作為に4のグループでのDRGをメッキした後、ランダムに各セルの状態に与えられたプレートを割り当てることでのDRG間のサイズの違いを占めています。

前述したように神経突起は、典型的にはオンになっている行列のエッジへの道の少なくとも3/4、拡張した後、我々はHSNCC細胞株をめっき3日目添加した細胞は、行列（ 図3a）

ディスカッション

プロトコル内の重要なステップ

このプロトコル内の最も重要なステップは、後根神経節の正確な解剖と抽出されています。 2半棘に脊柱と正中線縦部門の適切離断は、DRGを大量に得るために重要です。個々のDRGの解剖時には、神経節は、直接処理するべきではありませんが、むしろ周囲の筋膜は、微細な鉗子で把持する必要があります。これを行うに失敗する可能性が神経突起伸長のための失敗の主な原因であるDRGの挫傷になります。これは、オーバー取り扱いDRGを、アッセイには神経突起の成長を取得しないリスクよりも、解剖時に周囲の神経組織をトリムの下で、はるかに優れています。

修正およびトラブルシューティング

上記のように実験プロトコルを満たす最適に反映します数年かけて作られた手続きの調整の多数から確立hodology。プロトコルセクションで対応するステップの直下に記載されているこの方法を使用するときに、著者の経験から得られたノー...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM/F-12 50/50 L-グルタミンと 15 mM HEPES	の混合 Corning Cellgro	10-090-CV	マナッサス、バージニア州
胎児ウシ血清	アトランタの生物学的製剤	S11150	フラワリー ブランチ、ジョージア
0.25% トリプシン-EDTA (1x)	Life Technologies Corporation	25200056	グランドアイランド、ニューヨーク
リン酸塩緩衝塩水 1x	Corning	21-040-CM	バージニア州マナッサス
Matrigel hESC-Qualif Mouse	Corning Incorporated	354277	Bedford, MA
ガンマ線照射 35 mm ガラス底培養皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ashland, MA
SteREO Discovery.V8 手術顕微鏡	Carl Zeiss Microimaging	495015-0021-000	ソーンウッド、ニューヨーク州
Schott ACE I光源	Schott	A20500	Germany
CellTracker	ライフ・テクノロジーズ・コーポレーション	C2925	カリフォルニア州カールスバッド
BD プレシジョングライド ニードル 18 G および 21 G	BD	305195	ニュージャージー州フランクリン レイクス ニュージャージー州フランクリン レイク
	60-3851	マサチューセッツ州ホリストン マサチューセッツ州ホリストン
ファイン オペレーティング・スタンダード ハサミ	ハーバード・デバイス	52-2789	マサチューセッツ州ホリストン
プレミアム・スプリング・シザーズ	ド装置	60-3923	マサチューセッツ州ホリストン
ドレッシング鉗子	ハーバード 装置	72-8949	マサチューセッツ州ホリストン
アチミックヌードマウス (002019)	ジャクソン研究所	002019	バーハーバー、メイン