方法論記事

GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します

DOI：

10.3791/55053

⸱

2017年2月17日

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Lehigh University, 2Department of Natural Science, DeSales University

この記事について

サマリー

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真核生物の発現のために設計されたカルボキシ末端にGFPタグを有する構築物をコードするTMEM184Aは、血管細胞中のヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定を確認するために設計されたアッセイに使用しました。

要約

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新規タンパク質は、親和性に基づく分離やバイオインフォマティクス解析によって識別されると、彼らはしばしば、主に特徴付けられていないです。予測される配列内の特定のペプチドに対する抗体は、いくつかのローカライズ実験を可能にします。しかし、抗体と他の可能な相互作用は、多くの場合、除外することはできません。この状況は、タンパク質配列に依存するアッセイのセットを開発する機会を提供しました。具体的には、タンパク質のC末端にGFPコード配列に連結された遺伝子配列を含む構築物が得られ、これらの目的のために使用しました。局在化、リガンド親和性、および機能の利得を特徴付けるための実験は、最初に設計し、ヘパリン受容体1としてTMEM184Aの同定を確認するために行きました。さらに、構築物は膜トポロジーの問題に取り組む研究および詳細なタンパク質 - リガンド相互作用のために使用することができます。本報告書は、ARを提示します簡単に他の新規タンパク質のために適合させることができる血管細胞で発現したGFP-TMEM184A構築に基づいて実験プロトコルのアンジュ。

概要

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新規な機能のための候補タンパク質の同定は、多くの場合、部分配列決意が続く親和性に基づく分離プロトコルに依存します。新たに同定されたタンパク質の最近の例は、膜貫通タンパク質184A（TMEM184A）、ヘパリン親和性相互作用1後に同定ヘパリン受容体、およびTgPH1、ホスホイノシチドPI（3,5）P 2 2を特異的に結合するプレクストリン相同ドメインタンパク質が含まれます。その他の新規タンパク質の同定は、このような、 らビタミンによって、そのようなペプチドの直接配列分析を必要とします。人は、以前に特徴付けられていない遺伝子3からタンパク質産物を識別するために、膜貫通ペプチドを使用していました。同様に、新規のタンパク質配列の同定は、このような新しい4TMタンパク質4の識別として以前に特徴付けられるタンパク質ファミリーの探索バイオインフォマティクスを用いて達成することができます。アクアポリンファミリー遺伝子配列の検査は、Alを有しますそのように新しい機能5と新メンバーの同定をもたらしました。識別後、タンパク質機能の解析は、しばしば、このようなアクアポリンの場合のように、タンパク質機能の特異的なアッセイを用いて試験することができる次のステップは、典型的には。

可能な場合は、新たに同定されたタンパク質の機能は、特定の酵素または類似のインビトロ機能アッセイを用いて調べることができます。新規タンパク質の多くの機能が唯一無傷の細胞または生物で発生する複雑な相互作用に依存しているため、in vitroアッセイは、必ずしも有効ではありません。しかし、 インビボアッセイは、それらが遺伝子配列に依存するように設計されなければなりません。細胞培養、および/または単純なモデル生物では、ノックダウンは、タンパク質/機能同定6のための証拠を提供することができます。上記のように同定された新規のタンパク質と、単に機能を確認するために、タンパク質をノックダウンすることがしばしば不十分です、D遺伝子配列に依存してin vivoでの機能アッセイの設計は、新規タンパク質の特徴付けのために重要になります。

ノックダウンは、識別と一致する結果が得られた後、ヘパリンレセプターとしてTMEM184Aの最近の同定は、アフィニティークロマトグラフィーおよびMALDI MS 1を使用して（すなわち、血管平滑筋および内皮細胞における炎症応答において増殖を調節する）、7は、アッセイのコレクションを開発する機会を提供し。最近のレビューは、ヘパリンは、多くの増殖因子、それらの受容体、細胞外マトリックス成分、細胞接着受容体、および他のタンパク質8と特異的に相互作用することが確認されました。血管系では、ヘパリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン（ヘパリンと同様の構造でヘパラン硫酸鎖を含む）は、数百のタンパク質9と相互作用します。機能的に股関節を確認するために、トンTMEM184Aはヘパリンの取り込みと結合に関与していた、TMEM184Aための遺伝子構築物を使用される技術が開発されました。本レポートでは、GFP-TMEM184Aに基づくアッセイのコレクションはヘパリン受容体としてTMEM184Aの身元を確認するのに使用するための構築物が含まれます。

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プロトコル

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GFPタンパク質構築物の1デザイン

  1. 購入、または設計および構築、問題のタンパク質に基づいたGFPタグ付きコンストラクト。
    注：購入した構造物については、標準的なベクターには、次の提案の一部またはすべてを含む商業研究所から入手可能である：膜タンパク質の場合、膜タンパク質輸送に干渉しにくいので、GFPのC末端の場所を選択します。問題のタンパク質のC末端をコンパクトタンパク質のドメインに折り畳まれていると信じる理由がある場合には、目的の遺伝子とGFPの間の延長を考えてみましょう。一般的な真核細胞発現のための構築物を選択したが、細菌系での生産を構築することができます。 GFPは、タンパク質の活性を妨害する可能性がいくつかの実験のために必要であれば、GFPを除去することができることによって（例えばTEVプロテアーゼのような）の切断部位が含まれます。このような局在や親和性のための追加のタグとして他のインサートを追加teractions（ 例えば、のHis6）。これは、本明細書に記載のアッセイのために必要ではなかったが、GFPの前に、GFPの除去が望まれる場合には、他のアッセイを容易にする、または遺伝子に直接隣接する便利かもしれません。

血管細胞における2 GFP-TMEM184A式

  1. 0.2％のゼラチンコーティングした組織培養皿上で培養内皮細胞又は血管平滑筋細胞を、以前に報告されているように1、6、7。
  2. リンス100ミリメートル、またはそれ以上、細胞のコンフルエント皿に5mLの細胞培養トリプシン溶液（w / vの0.5％）を加えます。細胞は単にプレートから放出されるまで、37℃でインキュベートし、滅菌ポリプロピレン遠心チューブに細胞を移します。
  3. トリプシン活性を制限するために、細胞/トリプシン溶液に、ルーチンの培養に使用されるように、トリプシンインヒビター（ 例えば、定期的な培地の等量）を加えます。 approximで5分間細胞をペレットately 600 XG（または適切な速度と時間は標準的な組織培養のための細胞をペレット化するために）。上清を吸引除去します。
  4. 時間の細胞の量を制限するHEBS（Hepes緩衝生理食塩水）、エレクトロポレーション緩衝液1mlに再懸濁細胞は、ペレットまたは懸濁液です。氷上で細胞懸濁液を置き、氷上で残りの手順を実行します。
    注：ペレットは、前の再懸濁にHEBSで1回洗浄することができます。
  5. 20μg/ mLのDNAの最終濃度を達成するために、細胞にGFPタグTMEM184Aプラスミドの十分な量を加えます。 GFP構築物のために同一のプロトコルを使用してください。
  6. エレクトロポレーションキュベットにHEBS中の細胞溶液の約0.4ミリリットルを置きます。使用前にキュベットを予め冷やし。
  7. 以下の条件を用いて、細胞をエレクトロポレーション：指数関数的減衰、500μF、∞オーム、および170 Vを
    注：所定の細胞型のための電圧を最適化する必要があります。内皮細胞および平滑筋セルを用いた予備的研究Lタイプは、例えば 図10に示すように 、ここで留意最適電圧値を決定するために、GFP-ビンキュリンコンストラクトを用いて達成しました。
    1. エレクトロポレーションを最適化するには、（いくつかの標準的な細胞タイプのための条件を含む）機器メーカーの推奨で始まります。希望の構築物のサイズおよび蛍光特性に類似の構築目的の構築物または対照の蛍光タンパク質を使用してください。
      注：小さな核酸は、大きな構成よりも容易に細胞に侵入するように見えるので、唯一の蛍光タンパク質を有する構築物は、1より大きく表現しやすいかもしれません。
    2. 細胞生存率、蛍光構築物は24および48時間後に発現している細胞の割合、および発現強度を決定するために、蛍光顕微鏡を使用してください。
      注：生存率が低い場合には、わずかに電圧および/または時間を減らします。培養表面から細胞の放出および復帰の間の最短時間を目指します培養の細胞生存を強化します。生存率が高く、発現が低い場合、時間または第二のパルスのわずかな増加は、構築物の取り込みを改善することができます。最適条件および発現は、細胞型間で変化します。構築物を発現する細胞の割合が高いが、強度が低く、DNA濃度を増加させ、タンパク質の半減期ならびに発現に基づいて変化する最適な強度、時間かけてトランスフェクトされた細胞を監視する場合、強度を向上させることができます。染色強度は、抗GFP抗体を用いたGFPの免疫蛍光染色によって、必要に応じて、いくつかのアッセイのために拡大することができ
  8. エレクトロポレーション後、イメージングまたは組織培養皿にカバースリップと6の30mm組織培養ウェルに細胞を播種します。培養細胞を、標準的な細胞培養法を用いて。
  9. オプション：任意のHEBSエレクトロポレーションバッファーを除去するために、24時間後に培養液を交換してください。

GFP-TMEMの3可視化184Aのローカライズ

  1. 少なくとも24時間培養した後、PBSで穏やかに振盪しながら細胞を洗い流します。 GFPの退色を避けるために、明るい光への露出を制限します。
  2. 穏やかに振盪しながら室温で15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定してください。細胞を透過性にすることができる任意のメタノールを含有する試薬を使用しないでください。リガンド相互作用を評価する必要がない場合はメタノールで固定を使用することができます。
    注意：パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な個人保護具を着用します。注意して、ドラフト内で使用し、適切に廃棄します。
  3. 上記のようにPBSですすいでください。抗体ベースの染色のために、3.6以下を参照してください。
  4. マウントモヴィオールまたは他の適切なマウンティング培地を用いてスライドにカバースリップ。
  5. 画像は、GFPの励起および発光スペクトルのための適切なフィルターセットを用いて、共焦点または蛍光顕微鏡を用いてスライドします。共焦点顕微鏡法があるため、z平面内のサンプルを分離する能力で好ましいです。 quのためのグレースケールで画像を保存TIF形式のantitation目的（イラストフルカラー画像に加えて）。
  6. 細胞によって発現されるWT TMEM184Aとの比較のために、 例えば TMEM184A配列からのペプチド（複数可）に調製した一次抗体を用いて免疫蛍光のために他の細胞を、調製1。 GFP-TEMEM184Aの同定はまた、GFPに対する抗体を用いて達成することができます。同一の顕微鏡技術により、両方の細胞サンプルを評価します。

4.ローダミンヘパリンGFP-TMEM184Aトランスフェクト細胞との結合と共局在

  1. 100μg/ mLのローダミン - ヘパリンとGFP-TMEM184A発現処置細胞は、培養培地に添加し、そして細胞はのA7r5細胞を、10分より典型的には一定時間、インキュベートすることを可能にします。すすぎ、3.1と3.2のように修正します。
    注：最適な時間とリガンドの濃度は、細胞応答、得られたリガンドおよび画像強度の蛍光強度に依存します。このconcentratそれは他のアッセイ11において50％以上の応答をもたらすためのヘパリンのイオンを使用しました。この濃度は、標準的な蛍光顕微鏡法を用いて可視化することができるので、それを増加させる必要はなかったです。細胞中の下、蛍光の非標識ヘパリンの結果とローダミンヘパリンの希釈は、このように画像および定量化することはより困難です。
  2. GFP-TMEM184Aトランスフェクションに結合するローダミン - ヘパリンを定量するために、トランスフェクトされたGFP-TMEM184Aせずに同一の細胞を調製。
  3. 画像に適切なGFP（488 nm）をローダミン（543 nm）の励起および発光と共焦点顕微鏡を用いて細胞（500 - GFPのための530 nmおよびローダミンのためのより大きい560 nm）の値は、共局在を決定します。統計情報を取得するために、少なくとも3つの別々の実験からの少なくとも50個の細胞の画像を得ます。実験内で同一の設定を維持し、コントロールサンプル（複数可）（無処理で例えば、トランスフェクトされた細胞）を採用番目複数の実験の分析のためのデータを標準化するために使用することができます。
  4. 結合の定量化のために各セルに/取り込みを結合相対ローダミンを決定するためのコンピュータプログラムを用いて画像を調べます。
    注：彼らは分析のために便利であり、彼らが最初にその形式で保存されなかった場合、多くのコンピュータプログラムにグレースケールに変換することができるようにTIF画像が採用されるべきです。画像J（フリーウェア）は、本分析で用いられると、画像内の任意のユーザ定義領域について測定すべき領域とピクセル強度を可能にしました。
    1. 蛍光画像内の細胞を一周し、その空間内の強度を決定するための対策ツールを使用するためにフリーハンドツールを使用します。
      注：これらの測定値は異なる形状と異なるセルを比較する方法を提供し、ユーザ定義領域（全細胞、核など ）のための全強度を計算するために必要な情報を提供しています。背景の領域にわたって強度が報告されることを意味し、その促進分析のためのバックグラウンド強度のSコレクション。
    2. 強度を乗じた面積を計算し、地域の同じ量のバックグラウンドを減算するスプレッドシートにエクスポートします。統計的有意性を得るために十分な細胞/実験用の蛍光/細胞を平均化。

ローダミンヘパリンへのGFP-TMEM184Aから5.蛍光共鳴エネルギー移動

  1. トランスフェクトされた細胞を調製し、3.1のように200μg/ mLのローダミンタグ付きリガンドとインキュベートします。蛍光リガンドとのインキュベーション時間は細胞型に依存することに注意してください。唯一のPFAで固定し、イメージングのためのスライドをマウントします。
  2. （ - ; FRET 685 nmの566）まず、ローダミン発光のための405 nmおよび画像で励起します。第二に、GFP（493の画像 - 530）のために488で励起し、第三、（ - 685 566の画像）ローダミンのために561で励起します。 GFP-TMEM184Aなしまたはローダミンヘパリンなしのコントロールが重要です。

ローダミンHepariの6ライブセルイメージングn個の取り込み

  1. 生細胞イメージングのために設計された個々の皿にGFP-TMEM184Aトランスフェクト細胞をシードし、プロトコル3のように扱います。
    注：必要な細胞の数は、所望の細胞型及び密度に依存します。懸濁液中にある時間の細胞の量を最小限に抑えるために、細胞をカウントされません。 48時間でコンフルエント近くの細胞を得るために、6 35 mmのライブイメージング皿に100mMのコンフルエント皿から種子細胞。
  2. 48時間後、フェノールレッドを含まない培地で培地を交換してください。
  3. 温度を維持するために加温ステージを共焦点顕微鏡への細胞のディッシュに移し、顕微鏡の焦点を合わせます。
  4. 皿にピペットを100μg/ mLのローダミン - ヘパリン、穏やかに混合します。
  5. すぐにライブ映像の記録を開始します。ヘパリンのない細胞取り込みは、ビュー領域内で発生しない場合は、ローダミン標識を含む少なくとも1つの緑色の小胞を有する細胞を同定するためにわずかに皿を動かします。
    注：イメージング励起および発光仕様がありますヘパリン取り込みプロトコル（セクション5）と同じ。画像間の時間は約16秒でした。実験や顕微鏡の条件は、典型的には、画像を得ることができる速度を決定します。

培養細胞からのGFP-TMEM184AとGFPの7の単離

  1. 培地を除去し、PBSで洗浄した後、2mLの0.2％（対照結合アッセイのために）GFP-TMEM184AまたはGFPを発現する細胞のの150mmプレートに、プロテアーゼ阻害剤と（w / v）のCHAPS、1×PBS溶液を加えます。 、皿から細胞をこすり取る氷上で15 mLのポリプロピレンチューブに細胞/ CHAPSソリューションを配置し、タップしてよく混ぜます。 GFPタグは以下の結合アッセイのために漂白されていることを確認するために、明るい光の中ですべてのステップを完了します。
  2. 具体的にGFP-TMEM184A（または適切なGFPコントロール）をバインドするには、ソリューションに2μgの/ mLのビオチン化抗GFP抗体を追加し、揺り動かしながら4℃で一晩インキュベートします。
  3. 500μLを追加3〜5分間、約600×gで少なくとも5 mLの0.2％CHAPS / PBSと遠心機にストレプトアビジン - アガロースビーズの。上清を取り除きます。毎回新鮮なCHAPS / PBSでさらに2回繰り返します。抗体と細胞液にビーズを加え、ビーズがGFPまたはGFP-TMEM184Aに結合したビオチン化抗GFP抗体に結合することができるように揺らしながら4℃で一晩インキュベートします。
  4. （7.3のように）遠心分離することにより、ビーズをペレット化し、非結合物質を除去します。洗浄するために、少なくとも5 mLの0.2％CHAPS / PBS /プロテアーゼ阻害剤を加えます。効果的に未結合タンパク質を除去するために、少なくとも3回繰り返して洗浄し、遠心分離。
  5. 最終洗浄を除去した後、自由GFP-TMEM184Aまたはフリーの結果（抗体結合-GFPを解離させるために0.2 Mグリシン/ 3分間、氷上でPBS中0.2％のCHAPS（HClを用いて2.0のpH）1mLでビーズをインキュベートGFP）。 30秒ごとをタップして穏やかに混合します。
  6. 約600×gで遠心分離し、精製Pを含む上清を転送5 mLの1 M重炭酸ナトリウム（pHを7にもたらす）と直接中和し、新しい15mLのチューブにrotein。
  7. 万ダルトンの分子量カットオフ遠心濃縮器を用いてサンプルを濃縮（供給業者が推奨する遠心分離速度を採用）。体積は約0.5ミリリットルに達すると、0.2％CHAPS / PBSを加えます。 0.2％CHAPS / PBSの少なくとも10巻（回開始サンプル容量）までより0.2％CHAPS / PBSを集中し、追加を続行追加されました。
  8. 、単離されたGFPまたはGFPタグ付きタンパク質の量の推定値を決定する280 nmでの吸光度読みを取得し、同じ緩衝液中のウシ血清アルブミンまたは他の制御タンパク質から作成した標準曲線と比較することができます。
    注：吸光係数の差に起因は、この濃度は推定値であるが、試料を無駄にすることなく、更なる分析を容易にするためのおおよそのタンパク質濃度を提供することができます。正確なタンパク質濃度を抑止することができますサンプルと同じ緩衝液中で、標準的なタンパク質を調製する特定の製造マイクロローリー法を用いて、採掘。単離されたタンパク質のさらなる分析は、予測された分子量と比較（抗体GFPの検出を使用して）単離されたタンパク質のウェスタンブロッティングによって達成することができます。また、TMEM184A抗体の使用は、予測構造物の大きさのバンドを生じるはずであるが、二量体（またはより高次のオリゴマー）は、試料中に存在する場合も、WT TMEM184Aバンドになることがあります。純度の推定値は、出発物質のアリコートからの全タンパク質対単離されたサンプルからの全タンパク質についてブロットを染色することによって得ることができます。

8. インビトロヘパリン結合アッセイ

  1. 振盪しながら、200μLの0.2％CHAPS / PBSで5分間3回洗浄することにより、黒アビジン被覆96ウェルプレートを準備します。同じ洗浄手順を用いて、同一の黒色非被覆96ウェルプレートを準備します。準備します（三連で）実験試料のレイアウトは、アッセイの間に従います。 GFPの漂白を確認するために、標準ヘパリン濃度用井戸、バッファ制御、およびヘパリンなしのGFPサンプルをウェルの中に含まれます。
    注：最適化された単離またはリガンド相互作用のバッファが問題のタンパク質のために異なっている場合は、最適な緩衝系でプレートの準備や洗濯のすべてを行います。
  2. GFPは結合が所望されるアビジンコートプレート内のすべてのウェルに60ピコモル/ウェルのビオチン化抗GFPの100μLを加えます。抗体の量はわずかウェルに高親和性アビジンを飽和するのに十分です。
    1. 唯一の制御目的のために使用されるすべてのウェル（無GFPまたはGFP-TMEM184Aが所望の結合）にバッファを追加します。蒸発を防ぐために、プレートカバーでウェルを密閉します。振盪しながら、室温で2時間インキュベートします。
      注：ボリュームをウェルに加え、インキュベーション時間は、プロバイダからの推奨に基づいています。
  3. 全てのウェルを3回洗浄200μLの0.2％CHAPS / PBSで5分間。
  4. アビジンコートプレートのウェルを適切かつ振とうしながら室温で1時間インキュベートする5ナノモル/ウェルGFP-TMEM184AまたはGFPの100μLを加えます。 8.3のように再び洗浄します。
    注記：タンパク質のこの濃度は、すべてのサイトが過剰GFPまたはGFP-TMEM184Aで飽和させたことを確実にするために選択しました。これは、同量のタンパク質を各ウェルに結合されることを保証することが重要です。タンパク質の低い量はまた、プレートでのタンパク質のいくつかの濃度をインキュベートし、結合アッセイを、未結合タンパク質とリガンドを比較した後、残りの未結合タンパク質を評価することにより調べることができた可能性部位を飽和することがあります。
  5. 0.2％CHAPS / PBSで、フルオレセイン標識ヘパリンの種々の濃度を調製し、 例えば 、10、25、50、75、100、200 / mlの。暗闇の中で、この残りのすべての作業を行います。
    注：前の濃度を調製すること、他のリガンドのための特定の濃度はproteiのために決定されるべきです問題のn個のターゲット。最低濃度は、プレートリーダーで検出可能であるべきです。したがって、最初の使用の緩衝系で正確に検出することができる範囲を決定することが重要です。その後、測定可能な結合を得るために必要な範囲を決定します。 10μg/ mLの下のフルオレセインヘパリンの濃度は一貫して使用されるバッファー条件の下でプレートリーダーに登録しませんでした。ローダミンヘパリン他のアッセイにおいて使用されるような、緩衝液条件および結合のために必要な濃度で、プレートリーダーで視覚化することができるが、同様に、標準の蛍光読み取り値は、フルオロフォアで再現差はなかったです。
  6. 両方アビジン被覆および非コートプレートにアビジンコートプレートと濃度の標準ウェル中で適切な試験ウェルにフルオレセイン - ヘパリンの100μLを加えます。振盪しながら室温で10分間インキュベートします。暗い（またはホイル覆われた）でプレートを保管してください。
  7. プレートレアを使用デルは、両プレートの対照ウェル中のヘパリンおよびアビジンコートプレートで固定化されたGFP-TMEM184AまたはGFPを有するウェルからの初期蛍光（合計）排出量から初期蛍光発光を記録します。必要であれば、最低と最高濃度と蛍光ヘパリンの検出を確実にするために、機器のゲインを調整します。
    注：特定のプレートリーダーは、上から井戸を読み取り、それが調整可能である場合、ウェルに最適な場所で読み込みしてください。問題の研究のために、最適な場所をウェルダウン約75％でした。プレートリーダーを用いて入手可能な情報には、黒のプレートに結合されたサンプルのアッセイを読み取るための問題のプレートリーダーに固有な提案を提供する必要があります。
  8. 固定化されたGFP-TMEM184AまたはGFPを有するウェルから未結合の蛍光ヘパリンを削除し、非コート黒色プレートの対応するウェルに配置します。すぐに蛍光発光をお読みください。
  9. int型の新鮮な0.2％CHAPS / PBS 100μLをバックに追加Oウェルは、そこからフルオレセインヘパリンを除去し、蛍光発光を読み取りました。
  10. 8.9 3X - 繰り返して、8.8を繰り返します。
    注：塗装板からのこれらの測定値は、GFPまたはGFP-TMEM184Aウェル内に残っているフルオレセインヘパリンを示しています。かなりの蛍光が第三の結合していないサンプルで発見された場合は、追加の洗浄が発生する必要があります。蛍光は各洗浄で除去され続ける場合は、リガンドの結合は、低親和性であるかもしれない、との条件が再評価されるべきです。最後の読み出しは、結合したヘパリンの読み取りを構成しています。
  11. 各洗浄のための番号を取得する非被覆プレートで削除された、結合していない、試料からのレコード蛍光発光、。これらは、「未結合」の読みです。
  12. 各ウェルに加え、ヘパリンの正しいレベルを確認するために8.7で得られた全ヘパリン排出値を使用します。値から平均バックグラウンド測定値を引きます。
    注：ウェルズ任意のフルオレセインヘパリンなしによる抗体、GFPおよびバッファに背景としての役割を果たす。 AveragE背景は、背景値を得るために繰り返されます。実際の値を取得するために結合および非結合の測定値からバックグラウンドの平均測定値を引きます。
  13. 総フルオレセインヘパリンはヘパリンの量対放出の規模を決定するために追加された対放射のプロットを採用しています。
    注：抗体単独で、または抗体と抗原は、蛍光の一部消光をもたらしました。したがって、総ヘパリンは、8.7で述べたように、総追加ヘパリンに基づいて決定されました。
  14. GFP-TMEM184AケースとGFPの場合の両方で三連のために追加されたヘパリン対に補正バインドヘパリンをプロットします。
  15. 特定の濃度のためにすべての洗浄から未結合の測定値を追加することにより、遊離リガンドを決定します。

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結果

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、理論的には、任意のDNAのトランスフェクション細胞への構築物は、親油性のトランスフェクション試薬を用いて達成することができるが、これまでの報告は、GFPのより効果的なトランスフェクションはエレクトロポレーション12を使用して、内皮細胞への構築物を示します。ここに提供されたプロトコルは、一般的に使用される主要由来内皮細胞および平滑筋細胞の80％以上でGFP構築物の発現を達成しました。採用コンストラクトのデザインが急速にこの構築物を提供できる市販のシステムを使用していました。主な目的とする用途には最適な真核生物のタンパク質発現および継続的な構築物の生産に伴って、膜に従って正しい配信、場所の問題に焦点を当てた第一に考慮しました。含めることができますその他の考慮事項：折り畳まれた領域の一部であるC末端、wantiの可能性と異なって局在するタンパク質またはタンパク質のためのGFPの別の場所（プロテアーゼ切断部位を追加）、GFPを除去するためのngの、および二次親和性部位。後者は、GFP構築物を精製し、結合アッセイのために表面上でそ...

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ディスカッション

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ここで報告されたプロトコルは、血管細胞1におけるヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定のための確証的な証拠を提供するように設計されました。ノックダウン技術は、日常的に、新規なタンパク質の同定を確認するための1つのメカニズムとして使用されます。しかし、ノックダウン後のいくつかの機能の損失は、典型的には、候補タンパク質が実際に正しい受容体（または他の機能性タンパク質）であることを十分な証拠はありません。候補タンパク質が実際に機能を発揮するという証拠を持っていることも重要です。 GFPでタグ付けされた新規遺伝子ための構築物を採用することにより機能実験の利得を可能にし、GFPの親和性に基づいて、タグ付けされたタンパク質の単離を容易にします。このプロトコルに用いられるエレクトロポレーションは、（細胞の80％以上は、構築物を発現）構築物の非常に高いトランスフェクション効率を促進しました。エレクトロポレーションが使用可能かどうか、所望でない場合は、他のトランスフェクション機構を使用することができます。新規タンパク質の機能を確認するためにGFPタグ付き構築物を選択するいくつかの利点があります。まず、G...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
GFP-TMEM184A コンストラクトOriGeneRG213192
ローダミン-ヘパリンクリエイティブ PEGWorksHP-204感光
オレセイン-ヘパリンクリエイティブ PEGWorksHP-201感光
MowiolEMD Millipore475904-100GM
パラホルムアルデヒド (PFA, メタノールフリー)Thermo Sci Pierce Biotech,フィッシャーのフィッシャーサイエンティフィのPI28908ヒュームフード
反応結合ニュートラアビジンプレート(アビジンコーティングされた黒96ウェル皿)ッシャーサイエンティフィッシャー保存性に注意してください
黒96ウェルプレートフィッシャーサイエンティフィック064432を通じて購入
ラインATCCCRL 1444MEM培地1
BAOECウシ大動脈内皮細胞Cell Applications, Inc.B304-05最初に推奨される培養は、継続培養のためのMEM培地に交換することができます1,7
BAOSMCウシ大動脈平滑筋細胞Cell Applications, Inc.B354-05最初に推奨される培養は、継続培養のためにMEM培地に交換することができます1
>RAOECラット大動脈内皮細胞Cell Applications, Inc.R304-05aHeBS を通じて、MEM培地に交換して継続培養することができます7
pHは、
N末端Santa Cruz Biotechnologysc292006N末端領域に対する唯一の既知のTMEM184A抗体です。
C末端に対するTMEM184A抗体ProSci Inc, Poway, CA Pro Sci 5681ProSci Figure 1
GFP抗体Santa Cruz Biotechnologysc9996Figure 5
>二次抗体で使用され、TRITCまたはCy3で標識Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA711 025 152 (ロバ抗ウサギ、TRITC)
715 165 150 (ロバ抗マウス、 Cy3)		交差反応性が最小限で、非特異的な染色を最小限に抑えます。
CHAPSC5849から購入このカタログ番号は廃止されました。 サプライヤーは、交換に関する情報を提供します。
ライブイメージング 35mmディッシュMatTek (Ashland MA)P35G-1.0 – 20 mm - C
共焦点顕微鏡ZeissLSM 510 Meta 63倍油浸レンズ付きFigure 1, 2 and 3
Confocal MicroscopeNikonC2+ confocal with a <strong>Figure 5
共焦点顕微鏡ZeissZeiss LSM 880 63倍油浸レンズ付きFigure 2C
エレクトロポレーション装置バイオ・ラッド遺伝子パルサー X細胞システム
エレクトロポレーションキュベットMidSciEC2L機器サプライヤーからも入手できます
プレートリーダーTECAN TECAN Infinite® m200 Proプレートリーダー読み取り値は、表面ではなく井戸の中央にあります。
染色強度測定用コンピュータプログラム画像Jhttps://imagej.nih.gov/ij/
オンラインで入手可能なプログラムと情報		適切なプログラムを使用することができます。詳細については、https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html を参照してください  
細胞培養トリプシン溶液SigmaT417410x溶液として購入
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参考文献

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