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方法論記事

遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

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DOI：

10.3791/55058

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2016年12月12日

1Department of Pharmaceutical and Biomedical Sciences, University of Georgia

この記事について

サマリー

連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。

要約

この方法では、連続した凍結切片は、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いて、遺伝子発現のための組織の組織学とRNAの濃縮のための両方の顕微鏡アプリケーションを可能にするために収集されます。典型的には、それがバッファボリュームは、効率的な研削用途には低すぎるかもしれないので、まだ十分な機械的破壊することなく、小さな骨格筋サンプルの適切な均質化を達成するために挑戦され、緩衝剤の筋限界浸透の密集組織構造は、最終的に低いRNA収量を引き起こします。ここで報告されたプロトコルに従うことにより、30μmのセクションでは、収集され、バッファへの浸透のために露出表面積を増加させ、凍結切片およびその後の針均質化が筋肉を混乱させる機械的にできるようにプールしました。技術の主要な制限は、クライオスタットを必要とすることであり、それは比較的低いスループットです。しかし、高品質のRNAをプールし、Mの小さなサンプルから得られますuscle凍結切片は、多くの異なる骨格筋および他の組織のために、この方法は、アクセス可能にします。測定は直接実験的不確実性を低減し、のための小さな組織を供給するのに必要な複製の動物実験を低減するためにアプリケーション間で比較することができるように、また、この技術は、単一の骨格筋の隣接領域からの一致分析（ 例えば、組織の組織病理学および遺伝子発現）を可能にします複数のアプリケーション。

概要

この技術の目的は、単一の小さな骨格筋ソース組織からアクセスでき、そのような組織学および遺伝子発現など異なるモダリティ、ことで、複数の実験的な分析を行うことです。顕微鏡アプリケーションを注意深く凍結保存中に氷晶アーチファクトの形成を制限するように制御されなければならないサンプルの保存方法に最も敏感です。したがって、この方法の開発は、部分的に免疫蛍光顕微鏡法および遺伝子発現の両方のための原料物質分析として-140℃の液体窒素冷却2-メチルブタン浴中で樹脂を埋め込んで被覆された凍結前脛骨（TA）筋に基づいています。

多様な技術的アプローチのために同一の原料物質を使用する必要性は、左右の筋肉が異なる条件、実験の1つずつの制御を表す筋肉内注射に基づく実験のために特に重要です。例えば、筋肉再生の研究で一μSCLEは反対側の筋肉がビヒクル注射対照1として機能する広範な組織の損傷を引き起こす毒素を注射します。同様に、筋疾患の遺伝子治療研究は、典型的には、反対側2の空ベクター、無関係ベクターまたはビヒクル対照と比較する筋肉内注射による遺伝子治療ベクターの検証で始まります。したがって、別のアプリケーションに各TA筋を供給することは不可能です。

この問題に対処するための一般的な戦略は次のとおりです。私は）ii）の追加のマウスを使用すること、またはiii）は、各アプリケーションのための筋肉の一部を遮断するために、アプリケーションごとに異なる筋肉群を使用します。しかし、筋群の間に実質的な差異は、それが困難な別個のアプリケーションからのデータを比較することを可能にする、追加の動物は費用を増加させ、他の選択肢が存在する場合、不十分正当化されます。異なるアプリケーションを調達するために解剖した後に筋肉を割ると、最良の選択肢の私ですnは多くの場合。しかし、筋肉片は、しばしば均質2-5のために液体窒素または機械的な粉砕技術の下で粉砕を使用するには小さすぎます。筋肉は、細胞外マトリックス及び収縮タンパク質を充填した高度に構造組織であるため、不十分な機械的な均質化は、その後のDNA、RNAまたはタンパク質の低い収率をもたらします。ここでの詳細な方法は、複数のアプリケーションで使用するための1つのソース筋からの組織の少量を可能にし、凍結切片と針粉砕を含めることは、より良好なRNAの収量のための機械的均質化を向上させます。

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プロトコル

すべての動物の手順は、動物使用プロトコルA2013 07から016（Beedleといったロック）の下でジョージア制度動物実験委員会の大学によって承認されました。

未固定の骨格筋の1凍結保存

  1. 準備
    1. 約（ソースマウスや筋肉を特定し、非常に浅いカットを作るために2メチルブタンに耐性のある先端の細いマーカーでコルクに書き込み、かみそりの刃で小さな四角形（X 1センチメートル約1cm）にコルクをカット上面全体の1ミリメートル）。組織を配向するために使用するカットにプラスチック製のカバースリップを挿入します。コルクを凍結保存するすべての組織のための準備ができるまで繰り返します。
    2. 液体窒素、2-メチルブタン、包埋樹脂、低温温度計、コルク、解剖ツール、および研究のマウスを入手します。
      注意：液体窒素を加熱した場合に爆発する可能性が圧縮ガスです。 niの液体取り扱いの際白衣、低温手袋、保護面を着用トローゲン;皮膚や目に接触はやけどや凍傷を起こすことがあります。 2-メチルブタンは可燃性、毒性、健康と環境の危険です。個人用保護具（白衣、手袋、安全メガネ）を着用し、ドラフト内で在庫コンテナを開き、しっかりと閉じることができ、別の容器に（典型的には200〜400ミリリットル）を凍結するために必要な少量を転送、および吸入を避けます。
    3. 麻酔下で安楽死の承認方法でマウスを安楽死させます。簡単に言えば、マウス後20秒ペダル反射をチェックするために移動を停止するまで待って、イソフルラン気化器からの酸素中の2.5％イソフルラン吸入室にマウスを挿入します。ペダル反射が負の場合、頸椎脱臼6によって研究マウスを安楽死させます。
      注：安楽死の方法は、機関の倫理委員会による承認を必要とします。
    4. 遠位後肢を覆う皮膚を削除し、うまくポイントdisseと足首の上に遠位前方の腱を切っctionはさみ。細かい鉗子で遠位腱をつかみ、ゆっくりと筋肉を解放するために横方向の筋膜を切断しながらアップし、膝に向かって引っ張ります。膝から垂直筋を引き出し、TA筋7を切除する最終的なカットをします。
      注：TA筋は、ここでは例として使用されますが、ユーザの実験的な目標に適切であれば、任意のマウス骨格筋や心臓がこのプロトコルでTAの代わりに用いることができます。唯一の制限は、組織は、その深さ全体に急速凍結保存を達成するのに十分に小さくなければならないということです。 1センチメートル×1 cmで最大の組織サイズが推奨されます。
    5. 反対側の脚に繰り返し、収集すべき他の組織を解剖します。凍結保存の前に組織の劣化を制限するために可能な限り迅速に解剖を行います。
    6. オリエントその前標識されたコルクでの横断切片のための各筋肉。コルクに触れ遠位腱と筋肉の内線のトップとコルクに垂直な筋肉スタンド離れて終わる、カバーガラスによって直立開催。
    7. 好ましくは5分以内に、解剖後できるだけ早く組織学的分析のために全ての組織を凍結保存間違いなくソース動物の安楽死以来経過していない15分以上の時間。
  2. 低温保存
    1. 解剖の終了前に凍結保存槽に5分間の冷却を開始します。約3cmの深さに開いた金属ビーカーに2-メチルブタンを注ぎます。 2〜4センチの深さまで断熱容器に液体窒素を注ぎます。液体窒素中に2-メチルブタンのビーカーを設定します。窒素が沸騰し始めます。 2-メチルブタンビーカーにはね窒素を避けてください。
      注意：ヒュームフードまたは換気の良い場所でバスを凍結する準備します。
    2. 温度を監視し、さらに冷却を確実にするためにフォークで頻繁に攪拌して2-メチルブタンに低温温度計を挿入します。 2-MEまで撹拌を続け、クールthylbutaneは、必要に応じて、外槽に新たな液体窒素を添加すること、-140℃に達します。
      注：-140°Cは横紋筋で氷の結晶のアーティファクトを最小限に抑えるために最適な温度です。他の組織は、異なる温度で最高の凍結保存することができる（ 例えば、脳、-90°C）。
    3. それはコルクを満たしているとすぐに-140℃で2-メチルブタンにコルクをドロップし、筋肉の50％ - のみ下35への埋め込み樹脂を適用します。急速凍結バッチ当たり最大8の組織のために繰り返します。組織が固化2-メチルブタンに凍結しないことを確実にするためにビーカーの底を掻き取り、30秒間攪拌します。
    4. フォークを使用して、2-メチルブタンから各組織のコルクを引っ張ってスプーンや大規模な鉗子をスロット。迅速に、カバースリップを削除ビーカーに過剰の2-メチルブタンをオフに軽くたたく、その後、外窒素浴に組織コルクをドロップします。ビーカー内の残りのすべてのコルク栓のために繰り返します。
    5. 液体窒素中またはドライアイス上で転送サンプルストレージのための-80℃の冷凍庫。
    6. 任意の組織が凍結保存のために残っている場合、繰り返しは、1.2.4に1.2.3を繰り返します。 -140°Cまで、必要に応じて再クール外槽へのビーカーや液体窒素に追加の2-メチルブタンを追加します。有害廃棄物として使用される2-メチルブタン廃棄してください。

2.組織学およびRNAアプリケーションのための凍結切片を収集

  1. 準備。
    1. 化学天秤でのDNase / RNaseフリーオートクレーブ処理チューブを事前に重量を量ります。その後、予冷するクライオスタット室に移動します。チューブは、収集するすべてのプールされた凍結切片試料の準備ができるまで繰り返します。
    2. 骨格筋切片の場合は、クライオスタットチャンバの温度は、その内部サーモスタットにより-21〜-22°Cがあることを確認します。チャンバー内に切断される組織との任意の容器を移し、容器（複数可）が開く前に少なくとも15分間、クライオスタットの温度に平衡化することができます。
    3. 新しい使い捨てクライオスタットブレードを挿入します。代わりに、のddH 2 Oですすぎ、RNaseを除染液でスプレー、既存のブレードを取り外し、冷却するクライオスタット内に再挿入します。 70％エタノールでクリーンな組織をスプレーし、慎重にブレードとブレードクランププラットフォームを拭いてください。
      1. RNアーゼ除染溶液でクリーンな組織をスプレーし、クライオスタットブラシで汚れを拭き取ってください。 ddH 2 Oで組織をスプレーし、再びブラシを拭いてきれいな表面にクライオスタット室でそれらを設定します。
        注意：使用されていないクライオスタットブレードはナイフガードでカバーされるべきです。また、RNアーゼ除染液は毒性があり、冷たいクライオスタットチャンバ内の沈殿物を形成するために凍結します。そのため、取り扱いに注意しクライオスタット室での使用を避けます。
    4. クライオスタットチャンバ内には、ダイムサイズのドロップ温かい試料チャック上に樹脂を埋め込む（約300μl）を配置し、ダウン樹脂の上部、プレスで組織コルクを設定し、FRにチャックを設定レールまたは利用可能な場合、高速凍結要素上をeezing。
    5. 包埋樹脂が固化（白）した後、組織の下位35％の周りに、コルクの上に追加の埋め込み樹脂を追加し、より良い組織を安定化させるために、高速凍結のために包埋樹脂に熱抽出を押してください。樹脂が完全に硬化することを可能にするために、切片の前に5分間待ってください。
    6. 試料クランプは、その最も後退した位置、ブレードから最も離れていることを確認してください。試料クランプに組織標本チャックを挿入します。
  2. 凍結切片の準備。
    1. 、ブレードキャリアホルダーを緩め10°（または使用される刃のキャリアのための適切な角度）に刃の逃げ角を設定して、再度締めます。ブレーキを解除し、ブレードに向けて筋肉を下げるためにハンドホイールを回します。組織と刃の間の最短距離を推定し、その後離れて刃から組織を移動し、ハンドホイールブレーキを従事。
    2. 高さ調整LEVEを緩め組織の端が刃からより約2 mm以下である場合にrは、それぞれ、前後に刃キャリアを移動し、またはブレードは、組織を打つ場合。締め、ブレードから距離を確認するために、再度組織を下げます。ブレードは視覚推定による組織の末端から1〜2mm程度になるまで調整を繰り返します。
    3. ブレードに向けて組織を下げて、横断面のための組織の角度を評価します。ハンドホイールをロックし、試料クランプレバーを放します。試料クランプは、左または右組織の水平方向がブレードに対して垂直になるまで押し込みます。
    4. 試料がクランプアップまたはダウン組織切片は、筋肉の長軸に対して垂直になるように「y」の向きを調整するためにプッシュします。試料クランプレバーを締めます。
    5. それだけで、ブレードに接触するまで試料を進めるためにコースや細かいフィードフォワードを使用してください。特定の組織の深さからセクションを求める場合は、（ゼロにセクションの厚さの合計をリセット組織のトップ）。
    6. 30ミクロンで切片厚とトリミング機能にクライオスタットを設定します。カットし、組織収集のための事前に選択された深さに到達するまでのセクションを破棄し（ 例えば、上から400ミクロン）。
  3. RNA抽出のための凍結切片を収集します。
    1. セクションを収集するためのチューブを開き、ブレードキャリアの近くに配置します。それはブレードから切断されているように各セクションをピックアップし、チューブに凍結切片を転送するために事前に冷却し、クリーンブラシを使用してください。プールされたセクションでは、30 mgの重量を量るか、所望の組織の深さに到達するまで繰り返します。
      注： - 40mgの成体マウスの前脛骨筋の場合は、約400〜4,000ミクロンの組織の深さからのコレクションは、典型的には25が得られます。セクションが付着して金属表面に凝集する傾向があるとして、収集チューブにセクションを転送するために金属鉗子を使用することは推奨されません。
    2. 樹脂を埋め込みは筋肉の凍結切片を囲む場合は、ハンドブレーキをロックしにカミソリの刃を使用します筋肉の上部の周りに薄い層のみが存在するまで、樹脂の小片を剃り落とします。常に筋肉から離れて角度を付け刃で樹脂をカット。
      注：樹脂を埋め込むの薄層は、実質的に下流のRNA調製物を損ないません。厚い包埋樹脂が存在する場合は、収集管に凍結切片を移動する前に離れて筋肉からそれをいじめるためにブラシを使用しています。
    3. また、コレクションチューブにバルク中の刃キャリアと移転に関するセクションをプールします。
      注：ただし、この方法は遅くなる傾向があり、セクションは、後の工程で針均質化の効率を低下させることができ、付着して一緒に凝集しやすくなります。
    4. 迅速分析天びんやレコード管重量にプールし凍結切片チューブを配置します。直ちに-20℃に近い部分の温度を維持するために、コールドクライオスタット室にチューブを返します。プールされたセクションの重量を計算します。
      注：RNAの単離が広告を発生しますifferent日、使用するまで-80℃でプールされた凍結切片チューブを格納します。
  4. 組織学のための凍結切片を収集します。
    1. 細かい切片化し、使用の矢印は7ミクロン（または他の適切なセクションの厚さ、典型的には6〜10μm程度）にクライオスタット切片厚を設定するための切片厚ボタンを押してください。
      注：薄肉部（6〜10μm）をその染色試薬は、組織切片の深さに浸透できることを確認するために、組織学的用途のために使用されるべきです。薄切片は、凍結切片中の任意の深さから採取することができるが、組織の深さとともに増加包埋樹脂は、組織学的染色を損なわないため、より深いセクションが好ましいです。
    2. 一貫性のある、でも、組織表面を得るために、4〜7のセクションをカットし、捨てます。組織の深さをメモします。
    3. セクションをカットし、ブレードキャリアの表面上に向けます。迅速かつ優しく温かい（室温）顕微鏡スライドに触れることによって、セクションをピックアップ刃キャリア上のセクションに。室温にスライドを返します。目的のスライドの数が得られるまで続けます。最終的な組織の深さをメモします。
      注：各組織のための第二（重複）のセクションを収集することをお勧めします。
    4. 完全な切片では、ハンドホイールブレーキを従事一番奥の位置に検体を返し、組織チャックを削除します。試料チャック上の組織コルクを保持埋め込む樹脂を溶融するためにクライオスタット熱要素を使用します。 、組織コルクを削除する組織と乾燥、およびストレージに戻ります。
    5. 残りの各組織のためのステップ2.1.2から繰り返します。最後の組織がマウントされた後、スライドを20分間乾燥することができます。その後、組織学的または免疫蛍光染色のためのスライドを使用するか、または必要になるまでスライドボックス内で-80℃で凍結します。

プールされた凍結切片から3. RNAの単離

  1. RNA抽出
    1. 氷にプールされた凍結切片のチューブ（複数可）を移動します。すぐに追加50 mgの凍結切片の重量当たり約1ミリリットルの試薬の比で有機RNA抽出試薬、チューブ当たり、通常、600μlの。
      注意：RNA単離試薬は、毒性、腐食性、および刺激性です。安全な取り扱いについては、製造元の指示に従ってください。
    2. 18ゲージ針を用いて1mlシリンジを使用して、RNA抽出液を上に描画し、すべての組織は、溶液中に懸濁されるまで、チューブの壁をすすぎます。針の均質化の間に気泡を最小限に抑えるようにしてください。
    3. 管壁に付着した塊状凍結切片と作品をマッシュアップし、分散させるために針の先端を使用してください。粉砕物は5打のための針を介して上下にサンプルを通過させることにより均質化し、次いで、氷にサンプルを返します。すべての塊を破壊し、針を介して簡単にサンプルを渡す必要があるとして、両方が3〜5倍、または何度でもステップ繰り返します。
    4. 18ゲージの針を外し、22ゲージの針に交換してください。慎重TR5打のためのサンプルをiturate、その後、氷にサンプルを返します。非常に微細に分散した組織ホモジネートを達成するための磨砕を3〜4回繰り返します。
      注：組織粒子は、サンプルを描画するときに針をブロックするために開始した場合、注射器からのすべてのサンプルを追放し、さらに均質化のための18ゲージの針に戻します。 25または26ゲージ針を有する追加の粉砕工程は、最大収率を得るために添加することができます。サンプルこぼれの危険性があるのでしかし、針が目詰まりすることがあります。
    5. 室温に氷から試料を移動させます。分子複合体を破壊するために5分間インキュベートします。
    6. ヒュームフードでは、使用されるRNA単離試薬（ステップ3.1.1）、チューブあたり典型的には60μlに1ミリリットルあたり1ブロモ-3-クロロペンタン（BCP）の0.1ミリリットルを追加します。 （ない渦を行う）15秒間手で激しくチューブを振ります。 2〜3分間、室温でサンプルをインキュベートします。その後、12,000×gで4℃で15分間遠心操作します。
      注意： BCPは、可燃性及び毒性です。ドラフト内で取り扱う、手袋、白衣、安全メガネを着用してください。
    7. 慎重に上部の水相（無色）を含むRNAを収集し、清潔なチューブに移します。 （DEPC水で）70％の同量のエタノールを加え、ボルテックスで混合します。最大10分間室温でインキュベート。
      注：中間相間および下フェノールBCP相を製造業者の指示に従って、それぞれ、ゲノムDNAおよびタンパク質のために処理するか、適切な廃棄のためにフェノールBCP有害廃棄物容器に収集することができます。
  2. RNA精製。
    1. 8マイナーなバリエーションと結合サンプル、洗浄および溶出のための製造元の指示に従ってください。例えば：
    2. ステップ3.2.4のための-は暖かい事前に37℃の浴やインキュベーターにDNアーゼ/ RNaseフリー水の分量を置きます。
    3. 15秒間のサンプル上記の3.1.8から精製カラムや遠心にRNAサンプルを追加します。室温で12,000×gで。同じカラムおよび再遠心分離にバックを通る流れを注ぎます。 RNA結合を最大化するためにさらに1回繰り返し、その後を通じて、最終的な流れを捨てます。
    4. 製造元の指示8に記載の洗浄手順を実行します。 12,000×gで15秒間のカラムに洗浄バッファー700μlの（なしエタノール）、スピンを適用し、フロースルーを捨てます。
    5. 12,000×gで15秒間の列に（エタノールで）洗浄緩衝液500μl、スピンを追加し、フロースルーを捨てます。このステップを1回繰り返します。
    6. 膜を乾燥させるために12,000×gで1分間空の列をスピン。
    7. クリーンのRNase、DNaseをフリーチューブにスピンカラムを移します。カラム・メンブレンの中央に（3.2.1から）予め温めておいたのDNase / RNaseフリー水40μlのを追加します。室温では、2分間インキュベートした後、12,000×gで2分間遠心します。
      注：40μlの溶出量は、元の1mgあたり約1.3マイクロリットルでありますプールされた凍結切片の30 mgのための組織。異なる出発組織重量に応じて溶出量を調整したが、32μlの下に減少しません。第二の溶出は、元の組織1mgあたり約0.7マイクロリットルを用いて、総RNAの収量を増加させるために添加することができます。
    8. 分光光度計、電気泳動、および/またはバイオアナライザーによって濃度および純度のためのRNA（カラム溶出）を分析します。このような定量的PCR 4のための逆転写などの下流の用途に必要とされるまで-80℃でRNAを保管してください。
      注：DNase処理は、下流アプリケーションでのRNAを使用する前に、推奨されます。この処理は、任意の下流のアプリケーションの最初のステップとして、洗浄ステップの前に、カラム溶出後に、この特定のポイントで、またはRNAのアリコートに、いくつかのRNA精製カラム上で行うことができます。 RNAは、数年間は安定していなければなりません。

免疫Stainin 4.組織学的解析筋肉凍結切片のグラム

  1. シンプルな免疫蛍光プロトコル。
    1. 各スライド上のセクションのグループを一周するように疎水性のペンを使用してください。静かな組織に触れないように注意しながら、丸で囲んだ領域に（大きな表面積のために500μlのまでの小面積では約80μl）をPBSをドロップします。室温で5分間インキュベートします。
      注：凍結したスライドを使用する場合は、-80℃の冷凍庫からスライドを削除し、20〜30分解凍し、乾燥し、その後、上記のように進行し、室温でインキュベートします。少なくとも2つのスライドが必要とされている：1つの実験のスライドを一次および二次抗体中でインキュベートします。一次抗体のための1つの制御スライドは、「二次のみ "コントロールを除外されています。
    2. PBSを捨てるために、スライドをヒント。丸で囲んだ領域へのPBS（ブロッキング溶液）中の5％ロバ血清を追加します。筋肉切片が乾燥しないように注意してください。湿度チャンバー内で数時間、室温で30分間インキュベートする（または）。
    3. 筋肉再生を分析するために、一次抗体溶液を準備します。 eMHC抗体（1：40）とColVI抗体（：千1）で、ブロッキング溶液混ぜます。それぞれ、小、中、または大規模なスライド領域のために、300μlあるいは500μLを約150μlのを準備します。 5秒間ボルテックスし、次いで沈殿物をペレット化するために15,000×gで2分間遠心します。
    4. 実験的なスライドの場合は、ブロッキング溶液を注ぎ出し、その後、4.1.3からの一次抗体溶液を追加するスライドを傾けます。二次制御スライドのために、ブロッキング溶液を注ぎ出し、その後、新鮮なブロッキング溶液（抗体なし）を追加するスライドを傾けます。 4℃で一晩湿度チャンバ内のスライドをインキュベートします。
      注：スライド上に抗体溶液をピペットときは、必ず一次抗体溶液管の上部から液体を引き出し、チューブの底に沈殿物を妨害することはありません。
    5. ヒントソリューションをオフに注ぐためにスライド。洗浄するために、各スライドの円で囲んだ領域にPBSの滴下を追加し、先端が降り注ぎますオフ、その後、より多くのPBSを追加し、3〜5分間インキュベートします。合計3回の洗浄のために繰り返します。
      注記：洗浄時間が非常に柔軟であり、必要に応じて20分まで延長することができます。一般に、溶液の変化の数が時間よりも重要です。
    6. DAPI核の10,000希釈：マウスIgG1（eMHC）とウサギIgG（ColVI）と1を検出するために、赤と緑の蛍光団結合二次抗体の1：500希釈を使用して（二次制御スライドを含む）すべてのスライドのための二次抗体溶液を準備します染色。
      1. 例えば、DAPIの1:10希釈液を作るためのddH 2 Oの9μlのDAPIの1μLを混合します。その後、500μlの最終容量、ブロッキング溶液の447.5μlに1時10分DAPIの1.0μlの1.0 +抗マウスIgG1-赤μlの抗ウサギIgG-緑+ 0.5μlを添加します。渦は、任意の沈殿物をペレット化するために15,000×gで2分間混合し、遠心分離します。
        注：理想的には、すべての二次抗体は、同じ宿主種からでなければなりません。
    7. 最後のPBS洗浄を捨てるためにスライドをヒント。全ての組織をカバーするために、二次抗体溶液を加えます。光から保護し、30分間室温でインキュベートするスライドをカバーしています。
      注：すべての二次抗体は、二重標識実験で他の種と最小の交差反応性を持つように検証する必要があります。
    8. 4.1.5で説明したようにスライドを洗浄します。最後の洗浄後、PBSをオフに注ぎ、組織のスライドを設定するには、スライドを傾けます。一辺に沿ってメディアをマウント水溶液の3〜4滴を追加します。
    9. ちょうど取り付けメディアの外縁にカバーガラスのエッジを設定します。鉗子を使用して、ゆっくりと組織に向かってカバーガラスを下げ、その後、カバースリップを解放し、静かに所定の位置に、それをタップします。最後に、そっとそれを安定化させるためにカバースリップの各コーナーを押してください。
    10. 使用するまで4℃で光とストアからスライドを保護します。
      注：長期保存のために、目の縁に沿ってマニキュアの薄い層を適用します乾燥からスライドを防ぐために、電子カバースリップ。
  2. 組織学的評価。
    1. 画像適切なフィルタを落射蛍光または共焦点顕微鏡を用いてスライドをeMHC（赤）を検出します。 ColVI（緑）。典型的には20X対物レンズ1,5を用いて、核（青）をDAPI染色しました。
    2. 実験のスライドからの蛍光シグナルがeMHCとColVI検出4の特異性を実証するために、二次制御スライドと異なっていることを確認してください。
      注：eMHC正再生繊維は筋肉の損傷後に可変筋ジストロフィーのマウスでは約2〜7日から見えるはずです。コラーゲンVIは、筋線維、血管、および神経を周囲の細胞外マトリックスおよび周囲および筋外膜のより大きい結合組織束中に存在します。 DAPI核染色は、筋線維の再生を示す末梢核対中心核を有する繊維、および私の存在を同定するのに有用です細胞をnfiltrating。壊死性または負傷した繊維が原因で損傷した筋膜を通して繊維に浸透し、内因性IgGの検出にマウスIgG二次抗体と弱く染色することができます。
    3. 再生を定量化するために、画像全体の各蛍光フィルターと重なる顕微鏡写真を撮ります。場所ごとにeMHC、ColVIとDAPI画像をマージした後、セクション全体の1,5のマップを再構築するために画像の位置を合わせます。
    4. 解析ソフトウェアを使用して、eMHC陽性線維の数と最近の再生（100 *（＃eMHC +繊維/＃総繊維））を計算するために、総繊維の本数を数えます。また、（100 *（＃CN +繊維/＃総繊維））1,5より長い期間にわたって再生を測定するために、総繊維のうち、中央に有核繊維の数を数えます。

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結果

筋肉凍結切片のRNAは、品質が高く、ほとんどのアプリケーションのための十分な収量を提供します

分析は、16骨格筋のRNA調製物を、8匹の対照マウスからプールした前脛骨（TA）筋の19.4〜41ミリグラムを用いて、 表1に示します。どちらの左（L）と右（R）TAの筋肉がメソッドを使用して、筋肉の損傷を引き起こすことが3日、生理食塩水または10μMのカルジオトキシンの25μlに縦筋肉内注射後に採取した筋肉で再生実験で調製したが、以前に1を報告しました 。 表1に示すように 、筋肉凍結切片のRNAのためのA260 / 280比は、典型的には、これらの代表的なサンプル中の2以上の近くにあります。 「純粋な」RNAは2.2 2.0〜A260 / 280 1.8のA260 / 280を有すると考えられているように、凍結切片のRN...

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ディスカッション

余分な樹脂は、プールされた凍結切片のコレクションが遅くなりますし、RNA単離に樹脂汚染を埋め込む増加させることができるので、この方法で最良の結果を達成するために、組織の凍結保存中に筋肉の下3分の1または半分に制限された樹脂を埋め込む保ちます。また、針の均質化中細心の注意は、収量を最大化し、針を目詰まりの可能性を最小限にすることが重要です。プロトコルは、針がブロックされ、目詰まりを取り除くために高圧が必要になった場合、サンプルの損失から保護するために、ルアーロックシリンジを使用して変更することができます。 25または26ゲージ針を有する付加的な針の均質化ステップは、さらにRNAの収量を増強するために、より微細な組織懸濁液を製造するために添加することができます。クロロホルムは、BCPの代わりに用いることができるが、これは、BCPとして推奨されていないRNA 12の有機抽出の際、水相中のゲノムDNA汚染の低いレベルで毒性が低く、その結果です。増加均質化はあまり効率的であるように、30ミクロン以上のプールされた凍結切片のセクション厚さも推奨されません。

RNA収量が...

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開示事項

著者は、競合する金銭的利益はないと宣言しています。

謝辞

Madison Grant、Steven Foltz、Halie Zastre、Junna Luanが技術支援を提供しました。この出版物で報告された研究は、国立衛生研究所の国立関節炎および筋骨格系および皮膚疾患研究所によって賞番号AR065077で支援されました。 内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コルクVWRサイエンティフィック23420-708鋭利な刃で小さな正方形にカットします。
プラスチック製のカバースリップフィッシャーサイエンティフィ12-547凍結時に筋肉の向きを変えるために使用されます。
低温温度計VWR科学89370-158
2-メチルブタンシグマM32631-4L注意:危険な化学物質。可燃性のキャビネットに保管してください。
埋め込み樹脂:「cryomatrix」サーモフィッシャーサイエンティフィック6769006他の埋め込み樹脂は、cryomatrixの代わりに使用できます。
クライオスタットサーモフィッシャーサイエンティフィックマイクロm HM550 使い捨てブレードキャリア付きプロトコルには、動作するクライオスタットで十分です。
使い捨てクライオスタットブレードサーモフィッシャーサイエンティフィック3052835使用するクライオスタットに適したブレードまたはナイフを使用してください。
RNase除染液:「RNase Zap」サーモフィッシャーサイエンティフィックAM9780
分析天びんメトラー・トレドXS64
ペイントブラシダラー・ローニー214900920クライオ切片の取り扱いに使用します。シンプルな画材を扱う店頭で見つけることができます。
カミソリ刃VWR Scientific55411-050
顕微鏡スライドVWR Scientific48311600
RNA 有機抽出試薬: TRIzolサーモフィッシャー サイエンティフィック15596026注意: TRIzol は危険な化学物質です。注:骨格筋からのRNA抽出には、有機抽出試薬のみが推奨されます。
18ゲージニードルVWRサイエンティフィックBD305185
22ゲージニードルVWRサイエンティフィックBD305155
26ゲージニードルVWRサイエンティフィックBD305115オプション。RNA抽出プロトコルにおける3回目のサンプルトリチュレーションに使用できます。
1mlシリンジVWRサイエンティフィックBD309659非常に価値の高いサンプルには、Luer-Lokシリンジ(例:、VWR BD309628)をお勧めします。
1-ブロモ-3-クロロペンタン (BCP)SigmaB9673
DEPC 水中の 70% エタノールの場合: 200 プルーフアルコールDecon Laboratories, Inc.+M18027161M200プルーフアルコール35ml + DEPC水15ml を混ぜる 
DEPC水中の70%エタノールの場合:DEPC処理水サーモフィッシャーサイエンティフィックAM992235 ml 200プルーフアルコール+ 15 mlDEPC水。
RNA精製キット:PureLink RNAミニキットサーモフィッシャーサイエンティフィック12183018ARNA調製の最終ステップ。
DNase/Rnaseフリー水 Gibco10977DEPC処理水も使用できます。
分光光度計 Nanodrop 2000サーモフィッシャーサイエンティフィックNanoDrop 2000
Dnase IサーモフィッシャーサイエンティフィックAM2222精製されたRNAを処理して、下流のアプリケーション化の前にDNA汚染を除去します。
疎水性ペンサーモフィッシャーサイエンティフィック8899
ダルベッコのPBSGibco14190PBS 免疫蛍光プロトコル用。
ロバ血清Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc017-000-121製造元の指示に従って正常なロバ血清ストックを再水和し、免疫蛍光のためにアリコートを5%に希釈します。 通常のヤギの美容液も使用できます。
eMHC 抗体アイオワ大学 Developmental Studies Hybridoma BankF1.652
コラーゲン VI 抗体Fitzgerald Industries#70R-CR009x
ロバ 抗ウサギ AlexaFluor488サーモフィッシャーサイエンティフィックA21206
ヤギ抗マウス IgG1 AlexaFluor546サーモフィッシャーサイエンティフィックA21123
DAPI (4',6-ジアミディノ-2-フェニルインドール)サーモフィッシャーサイエンティフィックD1306
水性封入剤:PermafluorサーモフィッシャーサイエンティフィックTA-030-FM色防止特性を備えた蛍光アプリケーション用に設計された封入剤のみを使用してください。
ガラスカバースリップVWR Scientific16004-314免疫蛍光プロトコルの末端にスライドを取り付けるための使用
画像解析ソフトウェア: ImageProExpressMedia Cybernetics, Inc.Image-Pro Express、またはより高度な製品Freeware ImageJは、手動カウントにも機能するはずです。セグメンテーション機能を備えたより高度なソフトウェアにより、プロセスの部分的な自動化が可能になる場合があります。例:、ImageProPremier。
セクションの画像のマージとマッピング:PhotoshopAdobePhotoshop
CardiotoxinSigmaC9659Sigma C9659は廃止されました。カルジオトキシンの他のオプションは、EMDミリポア#217503です。アメリカンカスタムケミカルズコーポレーション#BIO0000618;またはGeスクリプト#RP17303。しかし、これらは検証されていません。
逆転写キット Superscript III ファーストストランド合成システムサーモフィッシャーサイエンティフィック18080051バリデーション済みの高品質な逆転写試薬を使用することができます。
標準PCR:GoTaq FlexiポリメラーゼシステムPromegaM8298検証済みの高品質なTaqポリメラーゼシステムであれば、どれでも使用することができます。DNAシーケンシングをPCRの下流のアプリケーションに使用する場合は、代わりにハイフィデリティPCRシステムを使用する必要があります。
SYBR greenThermo Fisher ScientificS7585専用の qPCR マスターミックスを使用しない場合の qPCR に使用します。SuperROX(Applied Biosystems機器用)およびGoTaq Flexiポリメラーゼおよびバッファーと併用します。
ROX: SuperROX, 15 mMBioResearch Technologies, Inc. Novato CASR-1000-10SuperROXはPCR反応においてより安定しているため、ROX(カルボキシ-X-ロダミン)よりもqPCRパッシブリファレンス色素としての使用に適しています。Applied Biosystemsの装置によるqPCRの場合
リアルタイムPCRApplied Biosystems7900HT
ック ミックス退である

参考文献

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RNA
遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化
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