マイクロスケールの熱泳動を使用してATPのアプタマーの結合部位のマッピング

サマリー

MicroScale Thermophoresis (MST) は、アプタマーとターゲットの相互作用を特徴付ける高感度技術です。この原稿では、アプタマーと低分子の相互作用を特徴付けるためのMSTプロトコルについて説明します。

要約

結合親和性、化学量論、熱力学などの基本的な結合パラメータの観点から分子相互作用を特徴づけることは、基礎科学と応用科学において不可欠なステップです。MicroScale Thermophoresis(MST)は、この重要な情報を取得するための高感度な生物物理学的方法です。この技術は、温度勾配を通る分子の移動を表す熱泳動と呼ばれる物理的効果に依存しており、溶液中の結合パラメータを迅速かつ正確に決定し、緩衝条件(緩衝液から溶解物/血清まで)を自由に選択することができます。MSTは、結合していない分子が結合パートナーと複合体を形成している分子とは異なる熱泳動運動を示すという事実を利用しています。熱泳動運動は、分子相互作用の瞬間に、サイズ、電荷、および水和シェルの変化により変化します。2つの結合パートナーの異なる分子比の移動プロファイルを比較することにより、結合親和性(pMからmM)などの定量的情報を決定できます。アプタマーと小さな化合物のような小さなサイズの分子間の困難な相互作用も、MSTで研究することができます。この原稿では、DH25.42 DNAアプタマーとATPとの間の十分に研究されたモデル相互作用を使用して、アプタマーと低分子の相互作用を特徴付けるためのプロトコルを提供します。この研究は、MSTが非常に感度が高く、7.9 kDaのDNAアプタマーの結合部位をATPのアデニンにマッピングできることを示しています。

概要

分子間の相互作用は自然の基礎です。したがって、基礎および応用研究の多くの分野の科学者は、異なる種類の分子相互作用の基本的な原理を理解してみてください。マイクロ熱泳動（MST）は、バッファを自由に選択して、高速、正確な、コスト効率の高い、溶液中の分子間相互作用の品質管理特性評価を行うために、科学者を可能にします。 MSTを使用して、1,000以上の出版物は、ライブラリースクリーニング、結合事象の検証、競合アッセイ、および複数の結合パートナー^1-8を用いた実験を含めた分析の種類を記述する、単独で2016年から、すでにあります。一般的に、MSTは、このような分子間相互作用の任意の種類の結合親和性（mmまでPM）、化学量論、および熱力学、のような古典的な結合パラメータ、の研究を可能にします。 MSTの大きな利点は、相互作用パートナーの大きさの独立した結合事象を研究する能力です。でもCHALlengingの小核酸アプタマーとの相互作用（15-30塩基）等の小分子、薬物、抗生物質、または代謝産物などの標的を定量することができます。

アプタマー-ターゲット相互作用を特徴づけるために、現在の最先端の技術は、実験室強く、非常に複雑されているか、またはアプタマー-小分子相互作用^9,10を定量化することができません。表面プラズモン共鳴（SPR）はゲル状^、19をプロービングにライン、アッセイ^11,12と、本当にそ....

プロトコル

アプタマー作業ストックの調製

1. 製造元の指示に従って、水にオリゴヌクレオチド（5-Cy5でCCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3、参照¹⁸からの配列）を溶解、100μMの最終濃度に達します。
2. 結合緩衝液で200 nmまでのオリゴヌクレオチドストックを希釈することにより、アプタマー作業溶液を準備します（20 mMトリス、pHが7.6; 300mMのNaCl; 5mMのMgCl _2、0.01％のTween20）。
3. 90℃で2分間混合物をインキュベート、サンプルはすぐに氷上で冷却し、室温でサンプルを使ってみましょう。

リガンド希釈シリーズの調製

1. 各リガンド（アデノシン三リン酸（ATP）、アデノシン二リン酸（ADP）、アデノシン一リン酸（AMP）、アデニン、グアノシン三リン酸（GTP）、シチジン三リン酸（CTP）、デオキシアデノシン三リン酸（dATPを）、及びS-アデノシルメチオニン（SAM）のために; 10 mMストックずつ）、16ステップシリアルdilutiを準備200μlのマイクロ反応チューブ内に。
   注：14,000×gで5分間のリガンド株式の遠心分離は、凝集物を除去するのに役立つことがあります。低容量は、低結合反応チューブは、チューブ壁に分子の吸着を避けることをお勧めします。
2. 推定親和性より少なくとも5....

結果

この研究では、MSTは、ATPのDH25.42 DNAアプタマー¹⁸の結合部位を特徴付けるために適用されました。ランダム^38-40一つ以上の蛍光体で標識タンパク質と小分子をATPの相互作用を特徴付けるまたはATP模倣他の研究とは対照的に、本研究では、5 '末端上の1つのCy5分子と7.9 kDaの一本鎖DNAアプタマーのラベル付きバージョンが含まれています。異なるATP誘導体および関連分子、様々な位置にATP異なるすべては、ATP分子上の結合部位をマッピングするために使用しました。異なるリガンドの（50％ずつリガンド濃度を減少させる16段階で）希釈系列を調製し、Cy5標識アプタマーの一定量と混合しました。サンプルを、25％のLEDと20％のレーザー出力において標準キャピラリーで分析しました。移動プロファイル（MST時間トレース）を記録し、T-ジャンプ相に由来する蛍光単位は、リガンドconcentrに対してプロットしました。エーション（ 図1Cを比較）。カーブフィッティングは、EC

ディスカッション

品質コントロール：

非特異的表面への試料物質の付着/吸着、ならびに凝集効果、親和性データの質に劇的な影響を与えます。しかし、わずか数最先端の技術は、これらの影響を監視し、回避するために、正確かつ迅速なオプションを提供しています。 MSTは、技術的なセットアップの段階的な最適化を可能にする、検出し、これらの問題を克服するのに役立つ統合された品質管理を提供しています。凝集/沈殿効果（ステップ7.7）に移動プロファイルで監視することができ、一方、粘着蛍光効果に関する重要な情報は、毛細管スキャンキャピラリー形状（5.2および7.5ステップ）から抽出することができます。これらのコントロールは、データ品質の一定の改善のために有効にして、プロトコルにおける重要なステップを表します。

吸着効果とトラブルシューティングの検出：

キャピラリースキャンは、主にINIとして行われますTiAlのステップは、その上に蛍光をスキャンすることによって、トレイ保持部上の毛管の位置を決定します。各ピークは、MSTの計測.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アプタマー結合バッファー			20 mM Tris pH 7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01% Tween-20
蛍光標識 ATP アプタマー	IDT, Leuven, Belgium		配列: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM ストック溶液を - 20 °C で保存。C
ADP	Sigma Aldrich(ドイツ)	A2754	10 mM ストック溶液を - 20 °C で保存。C
AMP	Sigma Aldrich(ドイツ)	A2252	10 mM ストック溶液を - 20 °C で保存。C
アデニン	・シグマ・アルドリッチ(ドイツ)	A8626	10 mM ストック溶液を - 20 °C で保存。C
SAM	Sigma Aldrich、ドイツ	A7007	10 mM ストック溶液を - 20 °C で保存。C
dATP	Sigma Aldrich, ドイツ	11934511001	10 mMストック溶液を-20°Cで保存。C
CTP	Sigma Aldrich(ドイツ)	C1506	10 mM ストック溶液を - 20 °C で保存。C
GTP	Sigma Aldrich(ドイツ)	G8877	10 mMストック溶液を-20°Cで保存。C
モノリスNT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MSTデバイス、標準検出器付き、Monolith NT115 pico is MSTデバイス、高感度検出器付き
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith Control software. 2.1.33, プリインストールデバイス	NanoTemper Technologies、ミュンヘン、ドイツ
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies、ミュンヘン、ドイツ
Kaleidagraph 4.5.2	Synergyソフトウェア