トコジラミに対する殺虫剤の有効性の評価方法、ナンキンムシ、卵とファースト齢

サマリー

殺虫剤の評価は、多くの場合、成虫ではなく、未熟な段階を標的としています。ここでは、最初の幼虫ベッドのバグのステージと比較して、ベッドのバグの卵に対する殺虫剤を評価するためのプロトコルを提示します。他の昆虫は、非成人期段階で殺虫剤の有効性を評価するためにこれらのプロトコルを調整することができます。

要約

害虫に対する殺虫剤の標準的な毒性評価は、主に成虫に行われています。評価は用量または殺虫剤の濃度として死亡率増加が増加する用量 - 反応又は濃度 - 応答曲線に基づいています。このような卵や早期齢や幼虫の段階として、試験集団の50％の死亡率をもたらすテストは非成人昆虫のライフステージに対する殺虫剤の毒性を評価するために挑戦することができ、標準的な致死濃度（LC _50）と致死量（LD _50）、 。しかし、この情報は、制御および治療の努力に影響を与えるすべてのベッドのバグのライフステージにおける殺虫剤の有効性を、理解するために不可欠です。このプロトコルは、幼虫最初の齢を治療するためにベッドのバグの卵と接触殺虫アッセイのために修正された標準的な浸漬バイオアッセイを使用しています。これらのアッセイは、さらに、殺虫剤の評価のためのLC ₅₀値を定量化するための濃度-応答曲線を生成します。

概要

ベッドのバグは、そのヒト宿主^{1、2、3、4、5、6}の血液損失、皮膚の炎症、不眠症、うつ病、および不安を引き起こす可能性がある重要な都市の害虫です。ベッドのバグを排除し、制御のコストが高く、多くの場合、時間が害虫駆除会社⁷による家庭への複数の訪問を必要とします。複数の訪問は通常ので、ベッドのバグと、それらを殺すことに関連する困難の不可解な行動が要求されています。具体的には、ベッドのバグの卵は、サイズが小さいためと卵殻による胚の保護を制御することが困難です。

現在、米国の多くの害虫駆除会社のための一般的な方法は、化学殺虫剤を使用して、ベッドのバグのために家を治療することです。それは、よく知られています卵は制御が困難であることを、非常に多くの企業が再治療の⁸のために2週間の時間枠を実装しています。最初の齢が出現し、うわさによれば、殺虫剤で殺すために容易になりますように、これは、ベッドのバグの卵を孵化するのに十分な時間を可能にします。しかし、ベッドのバグの卵と第一齢に対する液体殺虫剤の有効性を評価する研究で不足があります。

昆虫の卵は、多くの農業害虫に加えて、ベッドのバグ以外の都市害虫に制御するための最も困難なライフステージであることが報告されています。いくつかの研究は、殺虫剤抵抗性を報告しているが、これらの困難の大部分は、卵殻に起因しています。卵の段階での抵抗は、 コナガは ¹¹ コナガ ^、10 capitis Triatoma infestansの ^9、 ヒトジラミにRhyzoperthaのドミニカ ^12を文書化されていますナンキンムシ^13、及び複数の格納されている製品の甲虫（ すなわち ノコギリヒラタムシ、モドキTribolium castaneum、Cryptolestes ferrugineusとRhyzoperthaのドミニカ ）。 ¹⁴卵の段階での抵抗性の発達および未成熟の段階だけでなく、卵殻を通して殺虫剤の浸透に伴う合併症は、これらのライフステージに対する殺虫効力バイオアッセイの必要性を必要とします。

このプロトコルは、一般的なベッドのバグの卵と第一齢段階、 ナンキンムシに殺虫剤の有効性を決定するためのステップバイステップ手順を提供します。これらのプロトコルは両方とも、LC ₅₀値の定量化を可能にする濃度反応アッセイです。濃度 - 応答アッセイは、一般毒性試験に使用され、ただし、このプロトコルは、簡単に、ベッドバグ卵第齢のグループを処理するように適合されています。これらのアッセイは、適合させることができます様々な昆虫の卵や未熟ライフステージのために。

プロトコル

注：このプロトコルは別々のベッドのバグの卵と第一齢を治療するための2つの殺虫剤のアッセイが含まれます。両方のプロトコルは同じ殺虫剤を用いて行ったが、プロトコルが殺虫剤の曝露を確実にするために、容易に試験片を操作するように適合されなければなりませんでした。

1.卵浸漬殺虫剤アッセイ

1. コロニーから交配、よく給餌成人女性のベッドのバグを引き、ろ紙でペトリ皿にメス（5-10）を配置。殺虫剤のアッセイのための十分な卵が存在するであろうことを確実にするために、少なくとも10の反復を持っています。女性は毎日卵を築いているかどうかを確認してください。
   1. 彼らは卵を産むたら、ペトリ皿（6センチメートル×5センチ）のうち、女性を取り、毎日新しいろ紙で新しいペトリ皿にそれらを入れて、古いものと新しいペトリ皿上の日付を記録します。
   2. アッセイを開始する前に5日齢4個の卵を許可します。胚発生時の殺虫剤の変化に対する感受性は、よO卵の年齢のために制御することが重要です。 Dの光周期、60％RH、および27°C：午前12時12 Lで、すべてのライフステージを開催しています。
2. 卵が適切に熟成させた後、ソフトチップの鉗子を使用して濾紙から静かにベッドのバグの卵を削除します。静かにピンセットを用いてろ紙に付着した卵の底をこすり、その後、静かに投げベッドのバグの卵を制限するために、卵に多くの圧力を適用せずにつかみます。
3. プラスチック製のペトリ皿の内側に、それぞれのグループに削除されたベッドのバグの卵を置きます。柔軟仕上げ剤シートと外側に各ペトリ皿の底をこすることによりベッドのバグの卵を投げつけから静電気を制限します。すべてを一度にベッドのバグの卵の治療群（1群当たり5-10の卵）。 1グループに複製を考慮し、このアッセイのために複製し、少なくとも5（またはそれ以上）を使用します。
4. イミダクロプリド（0.1％）/β-シフルトリン（0.5％）と制御のための0.21から21μL/ mLの（5異なる濃度の範囲を得るために、殺虫剤の連続希釈液を準備溶剤（水道水）を有する溶液のみ。浸漬アッセイのための十分な容量を持つように各濃度の20ミリリットルを加えます。
5. 35 mLの線で切断した遠心分離管（50mL）を内側カットオフホイールアクセサリとの回転工具を使用し、次いで遠心分離管（直径= 2.54cm）のアルミニウムと同じ回転工具を用いたキャップに穴をカット石のアクセサリーを研削酸化物。切断時にキャップがしっかりとチューブ（ 図1）にねじ込みますように、キャップの端に5センチのままにします。
6. キャップ（〜5cm ²の）に適合するのに十分な大きさの正方形に細かいメッシュをカットします。遠心管のキャップを使用して、遠心管に、任意の凹凸をなくし、しっかりメッシュスクリュー。
7. 遠心管の内側にメッシュ上にペイントブラシを使用して、ベッドのバグの卵のグループ（1複製）を配置します。 5秒間の殺虫剤濃度にカット遠心管の内側にベッドのバグのグループを浸し。
8. 目のうち、遠心分離管を削除します電子殺虫剤液。実験室の組織に直接遠心管を配置することによって、内部の卵でメッシュを乾燥させます。
9. 小さな、細かい毛ペイントブラシを使用して、遠心分離管のうち、卵のグループを削除し、クリーンなフィルターペーパーできれいにペトリ皿に入れます。
10. すべての卵が孵化するのに十分な時間を持っていることを確認するために14日間のレコード卵の死亡率（孵化に失敗）。
11. アボットの式（ - ％コントロールの死亡率/ 100 - 制御死亡率×100％試験の死亡率）を用いた制御処理における死亡率に対する正しいです。
12. LC ₅₀値を計算するために、分析ソフトウェア¹⁵に対応する濃度で記録された死亡率を挿入します。

まず齢殺虫剤アッセイ

1. 好ましくは1日前に送られ、十分に供給されたベッドのバグ（5成人男性と5成人女性）のグループを分離し、matinのために提供ろ紙でペトリ皿（6センチメートル×5センチ）に入れますグラムと産卵。大人のベッドのバグが合わさると、約7-9日間卵を産むことを許可します。給餌のために、血液^16を囲むガラスチューブ内の温水を循環させる人工的な供給システムを使用しています。この研究のために、defibronatedウサギの血液を使用します。
2. ペトリ皿（5センチメートル×6センチ）から成人を削除し、卵をペトリ皿内の第1齢に孵化することができます。ベッドのバグの卵は室温で孵化するのは約7-9日かかります。
3. ペイントブラシを使用して、同じ年齢の無給電最初の齢を収集します。年齢は、毎日最初の齢を除去し、それらが斜線日を記録することによって決定することができます。殺虫剤アッセイまで、新しい、きれいなペトリ皿に入れます。 1齢幼虫は耐性が非常に乾燥剤ではありませんので、殺虫剤のアッセイは、できるだけ早く完了する必要があります。
4. アッセイのために、5つの異なる濃度と制御ソリューの範囲を取得するために、イミダクロプリド/β-シフルトリンの連続希釈液を準備溶剤のみでる。米国のベッドのバグの制御のために標識策定製品はこれらの研究のために使用した、したがって、溶媒が（ラベルに従って）水でした。
5. ピペット個々のろ紙上に対照群に対する各殺虫剤の濃度と水の150μLのアリコート（＃1; 4.2センチメートル直径）。ろ紙の縁部全体と中央付近の液滴を適用することにより、ピペッターを使用して、全体のろ紙の上に殺虫剤を配布します。
6. 個々のハードボードパネル（7センチメートル^2）の上に個別に処理された濾紙を置きます。
7. しばらくまだ殺虫剤で濡れとペトリ皿の反転底部と第一齢をカバーする個々の濾紙上に最初齢のリリース群（1群あたり10から5）。
8. 処理された表面から逃げるの1齢ベッドのバグを防ぐために、ペトリ皿の上に重量を配置します。
9. すべてに24時間曝露後の1齢ベッドのバグのレコード死亡殺虫剤の濃度。
10. アボットの式（ - ％コントロールの死亡率/ 100 - 制御死亡率×100％試験の死亡率）を用いた制御処理における死亡率に対する正しいです。
11. LC ₅₀値を計算するために、分析ソフトウェア¹⁵に記録死亡率および濃度を挿入します。

結果

卵はイミダクロプリド/β-シフルトリンの5の異なる濃度（μL/ mL）に浸漬しました。最初の齢は、イミダクロプリド/β-シフルトリン5つの異なる濃度（ 図2）の処理された表面上に置きました。

ハーラン、リッチモンド、およびエピックセンター（ 表1）：私たちはC. lectulariusの三つの異なる集団を使用します。ハーラン株はピレスロイド系殺虫剤の影響を受けやすいと博士ハロルドハーランから2005年に買収されました。リッチモンドとエピックセンター株は両方デルタメトリンに耐性です。リッチモンド株はOH、エピックセンター株はシンシナティで2008年に採取した2008年にリッチモンド、バージニア州の高齢者グループホームから収集しました。

ディスカッション

このアッセイの重要なステップは、アッセイの前に表面から取り除かれた卵が損傷しないようにすることです。 多くの昆虫は卵を基質に固めるため、除去が死に至らないようにするための予備テストが必要になる場合があります。このテストは、対照群(トコジラミが除去されていない)と比較して、治療グループ(トコジラミが濾紙から除去された)を数回繰り返して実施できます。治療群と対照群の間で死亡率が同様に低い(または死亡率が低い)と、除去が卵子死亡率を引き起こさないことが保証されます。したがって、殺虫剤アッセイで記録された死亡率は、殺虫剤処理によるものであるはずです。同じ予備実験を1齢を使用して実施し、収集方法が実験昆虫を殺さないことを確認できます。後で実施されるすべての実験には、殺虫剤を投与しないが溶媒で処理される対照複製を含める必要があります(これらの実験では、水道水が溶媒でした)。

予備実験は、配合された製品の推奨ラベル率で実施し、次に連続希釈して正しい濃度を決定し、20〜80%の範囲の死亡率の濃度応答曲線を生成する必要があります。同じ昆虫または化合物に関する以前の殺虫剤研究も、適切な濃度を決定しよ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シャーレ	:フィッシャーサイエンティフィック社	08-757-105	プラスチック
濾紙	Whatman	1001-042
フェザー級鉗子	フィッシャーサイエンティフィック社	4750
Temprid SC (イミダクロプリド/ビフェントリン)	Bayer CropScience
Transport GHP (アセタミプリド/ビフェントリン)	FMC Corp.
遠心分離管		06-443-18	50 mL; フラットトップスレッド
細かいメッシュ		7250C
KimWipe		06-666A	11 cm x 21 cm
小さなペイントブラシ			小さなペイントブラシ
ハードボードパネル			ホームセンターからは複合材またはタイルで十分です
金属			ペトリ皿の重量を表面に固定する任意のタイプの金属ネジ