3D細胞培養のための肺細胞外マトリックスから調整可能なヒドロゲル

サマリー

これは、肺の細胞外マトリックスからの3次元細胞培養の足場を作成するための方法です。無傷の肺は、三次元での細胞の増殖を支持することができるヒドロゲルに加工されます。

要約

ここでは、in vitroでの肺細胞培養のための複数の成分の細胞培養ヒドロゲルを確立するための方法を提示します。ブタ、ラット、またはマウスからのブロックの肺組織エン健康に始まり、組織は、灌流し、細胞破片を除去するために、後続の化学洗剤に浸漬されます。処理前と後の組織の組織学的比較は、二本鎖DNAとアルファガラクトシダーゼ染色の95％以上の除去を確認する細胞破片の大部分が除去される示唆しています。脱細胞化した後、組織を凍結乾燥し、次いで粉末にcryomilled。マトリックス粉末は、酸性ペプシン消化液中で48時間消化し、次いでプレゲル溶液を形成するために中和されます。プレゲル溶液のゲル化は、37℃でインキュベートすることによって誘導することができ、すぐに次の中和を使用するか、または2週間まで4℃で保存することができます。コーティングは、cのための非処理プレートにプレゲル溶液を用いて形成することができますエルアタッチメント。細胞は、細胞が足場を通って移動する、又はコーティング上に播種することができ、そこから形成されたゲルの表面にメッキ3D培養を達成するために自己集合の前プレゲルに懸濁することができます。提示戦略の変更は、ゲル化温度、強度、またはタンパク質断片の大きさに影響を与えることができます。ヒドロゲル形成超え、ヒドロゲルの剛性がゲニピンを用いて増加させることができます。

概要

in vitroの結果を臨床に翻訳することは、生物医学研究者が直面する最も困難な問題の一つです。組織培養プラスチックのin vitro研究は、より簡単で便利で、高い細胞生存率を維持します。¹ このアプローチは合理的な出発点ですが、結果への臨床的な応用は限られています。ラボでは、従来の2次元法に代わる3次元構造を取り入れるケースが増えています。生物学的な足場から高分子の足場まで、多くの三次元環境についてレビューが提供されています。^2、3

生物学的フレームワークは、ネイティブマトリックスのタンパク質とグリコサミノグリカン成分の多くを含み、細胞が付着して認識するための身近な結合部位を提供するため、生体内の環境の特性を模倣することができます。細胞外マトリックス(ECM)由来の材料は、細胞の接着と増殖のための有能な足場であることが示されています。⁴ ECMハイドロゲルプラットフォームの適用を制限する課題の1つは、ゲル化後の本質的に弱い機械的特性に起因しています。天然組織は、多くの場合、ハイドロゲルよりも桁違いに高い機械的特性を持っています。無毒の架橋剤は、ヒドロゲルの機械的特性を向上させ、天然の組織環境をよりよく模倣することができます。ゲニピンは、クチナシ植物に由来する無毒の天然架橋剤であり、ゲニピン濃度の変化に応じてECMの機械的特性を密接に調整する能力があります^5,6。

体のほぼすべての細胞は、ECM内に存在し、ECM上に組織化されています。彼らはそれを生成または維持しています。あらゆる臓器やシステムの組織、状態、機能におけるECMの普遍的な重要性に新たな焦点が当てられたことで、in vitro研究用のマトリックスベースのプラットフォームが誕生しました。ブタ小腸粘膜下組織法は、最も広く研究されている天然由来の足場であり、腱、靭帯、骨格筋⁴、さらには骨⁷の再生に用いられてきた。他の臓器やドナー種からのマトリックスも、良好な組織再生の可能性を示しています。外来のECMコンポーネントの使用は、免疫調節の問題を最小限に抑えます。宿主細胞物質の除去後、残りのECMは、アミノ酸含量および組織化において他のすべての哺乳類種と類似するであろう⁸。in vitroで細胞とECMの相互作用を調べる最善の方法は、臓器特異的なECMスキャフォールドを利用することだという考え方が広がっています。各臓器は、タンパク質とプロテオグリカンのユニークな組成を提供し、細胞のニッチを作り出します。ニッチは、細胞外マトリックスの構造的、機能的、さらには酵素的分解を提供し、生物物理学的シグナル伝達に寄与します。in vivo微小環境に最も類似したin vitro微小環境を達成するためには、組織特異的ECMを使用することで、研究のための細胞ニッチを最適化することができます。

このプロトコルの目標は、肺ECMに固有のハイドロゲル足場を確立する方法を提供することです。この方法は、肺細胞とECMの相互作用に関するin vitro研究のためのプラットフォームを提供します。

プロトコル

溶液	無菌フィルター	行き方
DIH 2 O	はい	DIH 2 O;滅菌濾過
0.1％トリトンX-100溶液	はい	ヒュームフードの下でDIH 2 O 100 mlに100μlのトリトンX 100ソリューションを追加し、溶解するまで撹拌します。 滅菌フィルター。
2％デオキシコール酸溶液	はい	ヒュームフードの下で2グラムデオキシコール酸ナトリウム溶液を加え 100ミリリットルDIH 2 Oあたり、溶解するまで撹拌します。無菌フィルター
1MのNaCl	はい	DIH 2 Oの1 Lに58.44グラムのNaClを追加します。溶解するまで撹拌します。 無菌フィルター
DNase溶液	はい	12,000を追加1 L DIH 2 O単位のDNアーゼ; 0.156グラムのMgSO 4を追加します。 （無水）、および0.222グラムのCaCl 2;溶解するまで撹拌します。無菌フィルター
PBS	はい	、27.2グラムのNa 2 HPO 4・7H 2 O（二塩基性七水和物）を組み合わせ 80グラムのNaCl、および10 L DIH 2 Oで2グラムのKCl;溶解するまで撹拌します。 pHを7.4に調整します。無菌フィルター

表1： 組織の脱細胞化のために必要なソリューション。脱細胞化プロセスのための上記の解決策を行います。 4℃で保存。約2.5 Lは1ブタの肺のために必要とされるであろう。

1.ヒドロゲル形成

1. ブタ肺脱細胞化（参考文献^9,10から適応）
   1. 心とVASCで、屠殺場から、 一括通常のブタの肺を入手そのままulature。
   2. 心臓にできるだけ近い血管系を切断し、心を離れて分析する組織ハサミやメスを使用し、残りの血管系は、灌流のために、後の工程で使用されます。
   3. 慎重にメスやハサミを使用して、気管、気管支、および血管系を周囲の結合組織を離れて解剖。
      注：脱細胞化プロセスの有効性を妨げることが胸膜および無気肺または血管閉塞、大量の大きな切り傷や刺し傷なしで肺を選択することで、残りの手順のために使用するのに最適な肺を決定します。
   4. （廃棄することができる心、結合組織および削除肺葉）できるだけ気管に取り付けられた同じくらい気管支を残し次善の肺を切り取ります。気管や血管系に付着したまま1肺があるはずです。
      注：必要であれば、組織学のためのセクションを保持します。 ⁹
   5. Pにクランプまたは縫合糸で切断された気管支を閉じますrevent過剰逆流。
   6. （ 表1）を 、必要になるまで4℃で脱細胞化ソリューションをして冷蔵庫を準備します。
   7. ハンドポンプを使用して、肺動脈および気管の両方を介してDI水で肺組織を3回灌流、肺動脈に適合するようにカニューレ。最初のたびに血管系を灌流。血管系に約1 Lで始まり、1.5 L各灌流のための気管内に、しかし、細胞破片を除去されるより多くの液体は、システムに灌流することができます。
   8. トリトンX-100溶液で血管系および気管の両方を灌流。
   9. 4℃で24時間、トリトンX-100溶液中に肺組織を浸します。
   10. リンスするためにDI水で血管系および気管3回灌流。
   11. デオキシコール酸溶液を用いて血管系および気管の両方を灌流。
   12. 4℃で24時間、デオキシコール酸で組織切片を水没。
   13. リンスするためにDI水で血管系および気管3回灌流。
   14. NaCl溶液で血管系および気管の両方を灌流。
   15. 4℃で1時間濾過NaCl溶液中で組織を浸します。
   16. リンスするためにDI水で血管系および気管3回灌流。
   17. DNase溶液で血管系および気管の両方を灌流。
   18. 4°Cで1時間フィルタリングDNase溶液中で組織を水没。
   19. 血管系および気管PBSで5回の両方を灌流。
   20. 唯一の呼吸ゾーン（主に周辺領域）を残して、気道を行ってから顕著な軟骨組織、気管および（主にへそと肺の内側部分の周りに見られる）、直径が全て尿細管2ミリメートル以上を離れて解剖。
   21. 1インチのセクション以下に組織を解剖。組織の向きは、このステップのために重要ではありません。
   22. 過剰の液体を捨て、50mlのコニカルチューブに組織を配置します。 -80℃で組織を凍結します。
       注：細胞の除去を確実にするために、組織学のためのセクションを保持し、携帯debrisの、所望の場合。我々は、H＆E、αガラクトシダーゼ、ピコグリーン、ヒドロキシプロリン、ニンヒドリン、アルシアンブルー、SDS-PAGE、および特徴付けする質量分析法を使用しています。 ⁹
2. 肺処理
   1. 脱細胞化肺組織を含む凍結したチューブから蓋を外します。
   2. チューブ開口部の上にろ紙を置き、ゴムバンドで固定します。
      注：チューブおよび内容はまだ凍結するまでそれ以外の場合は-80℃に置く凍結保存してください。
   3. すべての過剰な液体は、メーカーの指示に従って凍結乾燥機を使用して、なくなるまで組織を凍結乾燥。ミルへの準備ができるまで-80℃で保管してください。
   4. 労働条件に絶縁し、内部コンポーネントを冷却するためにフリーザーミルに液体窒素を追加し始める前に。
   5. ミルチューブから磁気ミルバーを取り外し、底部をカバーするために組織を追加します。
   6. ミルバーを元に戻し、ゆるく充填された組織を追加します。ミルバーはまだ自由に移動する必要があります。
   7. ミルチューブを閉じ、ナンプラーフリーザーミルでCE。
   8. 最大充填ラインに液体窒素を充填します。
   9. フリーザーミル微粉末に全ての組織（約5分〜600分の衝突速度^-1）、ステンレス鋼のインパクターを有するポリカーボネートシリンダーだけでなく、製造業者の指示に従ってフリーザーミルを用いてステンレス鋼製の端栓インチ使用直前まで-80℃で保管してください。
3. ミクロ多孔質ゲルの形成（8 mg / mlで）（参考文献から適応^9,11）
   1. （w / v）のために、室温で、一定の攪拌（液体のトップレベルでの流れを見ることができるはずです）の下で、M HClを0.01にペプシンの（w / v）の脱細胞化粉末と0.1％の1％を追加します。 48時間。
      注：粉末は静的に帯電したので、粉末がチューブ壁から過剰を洗浄するための機会を提供した後、塩酸を加えています。
   2. 48時間消化した後、氷上で5分間溶液および試薬を配置します。
   3. 冷蔵10％を使用して（v / v）の0.1 MのNaOH、D 11.11パーセント（v / v）の10倍PBS（1倍濃度の溶液全体をもたらすために）、7.4の生理学的pHに消化されたタンパク質溶液をもたらします。
      注：溶液が今までに1週間4℃で保存することができます。必要であればレオ^9を使用してゲル化速度を実行します。

2.機械的強度を改善するためにヒドロゲルを架橋

1. 1％、0.1％、および0.01％W / Vゲニピン架橋溶液の溶液を、10％DMSO中にゲニピン粉末の必要量を溶解することによって調製しました。
2. 1時間ごとに溶液を15分間ボルテックス。
3. 以前部1.3.4に組み立てられたECMヒドロゲル（96ウェルプレートの各ウェルに100μL）を覆うゲニピン溶液を加えます。
4. 37℃で24時間架橋するために、各ECMハイドロゲルのままにしておきます。
5. 洗浄液がもはや青になるまで、ECMハイドロゲルをPBSで3回リンスしません。架橋ヒドロゲルは、さらなる特性評価およびCEの準備ができているでしょうLL培養研究。

微多孔ジェル3.細胞培養

1. 二次元のコーティング
   1. 1.3.3からの溶液を用いて、96ウェル非組織培養処理プレートの各ウェルにプレゲル溶液20μlを加えます。
   2. タンパク質吸着板できるように一晩4℃で冷蔵します。
   3. 吸引しプレゲル溶液を、PBSですすいでください。
   4. 継代細胞^9。
   5. ウェルに10,000細胞/ cm ^2で追加します。
   6. ウェルあたり100μlにメディアを増やして、37℃でインキュベートします。
2. 三次元細胞培養⁹
   1. 1.3.3からの溶液を用いて、プレゲル溶液1,000,000細胞/ mlの濃度になるようにペレット化した細胞を再懸濁します。
   2. 迅速な3D細胞培養〜500μmの厚さのヒドロゲルを形成するために、96ウェルプレートの各ウェルにプレゲル細胞懸濁液の16μLを分注します。
   3. 30、37℃でインキュベートゲル分間が形成されます。
   4. 形成されたヒドロゲルの上部にメディアの100μlを添加して、37℃でインキュベートします。
3. 可変剛性ゲル上で三次元細胞培養
   1. 96ウェルプレートの各ウェルにピペット、1.3.3からプレゲル溶液100μlの溶液を用いて。
   2. ゲルを形成するために37℃で30分間インキュベートします。
      注：パート2からの架橋の手順は、ここで使用することができます。
   3. 継代細胞^9。
   4. ウェルに10,000細胞/ cm ^2で追加します。
   5. ウェルあたり100μlにメディアを増やして、37℃でインキュベートします。

結果

この方法を用いて、通常のブタ、ラット、およびマウスの肺（ 図1）からヒドロゲルを生産しています。処理された肺はそれぞれ5ミリグラム、40ミリグラム、およびECM粉末10gを推定与えます。プロセスの概要を図2に示されています。プロセス中の主な視覚化が含まれます：デオキシコール酸をすすいだ後、肺の白い外観を。プレゲル形成した後、溶液は不透明であるべきであり、4℃で保存した場合ソリューションは、数ヶ月のために、均一な表示されます。私たちは、プロセス（ 表2）を通じて、エラーの発生源を特定するために、基本的なトラブルシューティングの表が含まれています。ゲル化後、ヒドロゲルは、すぐに使用することができるか、または将来の使用のために保存しました。レオロジー試験は、ゲル化の90％以上が37°C（ 図3）に到達した後、最初の数分で起こることを確認します。形成されたヒドロゲルは、長いPBS中の期間が、細胞の付着およびproliferatio安定ですnが（ ...

ディスカッション

生物学の不可欠な側面の一つは、特定のタスクを実行する階層構造への分子の自己組織です。ラボで^13は 、自己組織化は、このような塩濃度、pH、および消化時間など多くの要因に依存します。示されるように、自己組織化ハイドロゲルの形態で可溶化タンパク質は、生理的温度に戻るとき。形成されたヒドロゲルは、in vitroでの細胞付着及び増殖を促進することができます。

ECMからの生物物理学的シグナルに対する細胞応答は、ポリマーを用いて調査することはできません。生物物理学的信号に組織特異的細胞応答は、他の組織を使用して調査することができません。再生の研究者や臨床医は、脱細胞化された足場を使用すると、組織再生および創傷治癒を向上させると信じています。慢性肺疾患の患者は、臓器の可用性を向上させ、免疫原性を減少するための治療の改善を必要とします。臓器特異的、細胞のECM相互作用がなければなりませんさらに臓器生物学に研究しました。

肺細胞の細胞足場としてECMを使用すると、一貫性のある結果を示しています。 <...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
トリトンX-100	フィッシャーサイエンティフィック	BP151-100	目の保護具と手袋を着用したヒュームフードで使用します。
ナトリウムデオキシコール酸	Sigma-Aldrich	D6750-100g	目の保護具と手袋を着用したフードで使用します。
硫酸マグネシウム	Sigma-Aldrich	M7506-500g	なし
塩化カルシウム	Sigma-Aldrich	C1016-500g	なし
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	なし
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	目の保護具と手袋を着用して使用してください。
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	目の保護具と手袋を着用したヒュームフードで使用します。
水酸化ナトリウム	フィッシャーサイエンティフィック	BP359-500	保護具と手袋と一緒に使用してください。
ジェニピン	和光ケミカルズ	078-03021	ヒュームフードに使用し、目の保護具と手袋を着用してください。
PBS 10x	品質 生物学的	119-069-151	なし
PBS	VWR	45000-448
なし フィルターペーパー	Whatman	8519	N/A
ハンドポンプ	フィッシャーサイエンティフィック	10-239-1	N/A
グラデュエートビーカー	VitLab	445941	N/A
クライオミル	SPEX	6700	クライオグローブとアイを使用保護。
凍結乾燥機	FTS FlexiDry		手袋を使用してください。
レオメータ		ディスカバリーHR-2	手袋と目の保護具を使用してください。