方法論記事

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

DOI：

10.3791/55101

⸱

2017年1月3日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Delaware, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston, 3Delaware Biotechnology Institute

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)ハイドロゲルに埋め込まれた血管由来の生体模倣マイクロ流体ネットワークを製造するための、イメージ誘導レーザーベースのハイドロゲル分解の実装を概説しています。これらの生体模倣マイクロ流体システムは、組織工学アプリケーション、in vitro疾患モデルの作成、および高度な「オンチップ」デバイスの作製に役立つ可能性があります。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この詳細なプロトコールは、PEGDAヒドロゲルに埋め込まれた血管由来のマイクロ流体ネットワークの製造のための画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解の実装の概要を説明します。ここでは、画像誘導レーザ制御を可能にする仮想のマスクの作成について説明します。マイクロ流体ネットワークの製造及び圧力ヘッド駆動流に適したmicromolded PEGDAハイドロゲルの光重合;フェムト秒パルスのTiとペアになって、市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡のセットアップと使用：ヒドロゲルの分解を誘導するSレーザー;蛍光種および共焦点顕微鏡を使用して製造、マイクロ流体ネットワークのイメージング。これらは複雑な数が含まれているマイクロ流体製造目的のための市販の顕微鏡を使用する際の重要なステップであるなどのプロトコルの多くは、顕微鏡ソフトウェアおよび顕微鏡マクロの適切な設定方法や実装に焦点を当てています。このtechniquの画像誘導成分eは、それによって創造的なマイクロ流体設計のため、事実上任意の構成の複雑なマイクロ流体システムの製造を可能にする、3D画像スタックまたはユーザーが生成した3Dモデルの実装を可能にします。組織工学における予想される影響で、このプロトコルで概説された方法は、臓器と人間のオンチップデバイスのための高度なバイオミメティックmicrotissue構築物の製造に役立つ可能性があります。 in vivoでの血管系の複雑なアーキテクチャ、屈曲度、サイズ、および密度を模倣することにより、本質的な生物学的輸送プロセスは、薬物動態及び疾患のより正確なin vitroでのモデリングにつながる、これらの構築物に複製することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

リンパ管および心臓血管の両方からなる血管系、フォーム栄養と酸素の輸送および代謝老廃物の除去のために不可欠である高密度のネットワークを。したがって、血管新生した組織に存在する細胞は、以上の50から100ミクロン離れて容器1からなることはありません。 in vitroで の生体内の血管構造を再現する能力は、正確に操作された構築物を用いてin vivoでの輸送過程をモデル化することが重要です。 3,4および疾患モデル5,6をハイスループットスクリーニングの薬剤のための臓器・オン・チップデバイス2を開発するための最近のドライブでは、この方法は、描画された合成または天然ヒドロゲルにおけるin vivo様の輸送を再現マイクロ流体ネットワークを作成します大きな関心。これらのデバイスで使用される微細組織のバイオミミクリーを強化するために、我々は、三dimensionaを用いる画像誘導レーザベースのヒドロゲルの分解法を開発しましたL（3D）天然の血管系の画像スタックをテンプレートはPEGDAヒドロゲル7に埋め込まれた血管由来微小流体ネットワークを生成します。このプロトコルは、画像誘導、レーザーベースの劣化を経てPEGDAヒドロゲルにおける血管由来、生体模倣マイクロ流体ネットワークを製造するフェムト秒パルスレーザーを搭載した市販のレーザー走査型共焦点顕微鏡の使用を概説します。

ヒドロゲルを流動化するための現在のアプローチは、内皮13-16用の事前定義されたチャネルを作成するには8-10脈管や血管新生10-12内皮細胞の自己組織化と微細加工技術の誘導が含まれます。自己組織化ネットワークは、微小血管の密度と複雑なアーキテクチャを再現しながら、彼らはしばしば、薬剤スクリーニングアプリケーションのためのモデリング輸送に問題となる可能性がin vivoでのネットワーク11,17,18、より透過性です。自己組織化ネットワークはphysiologから成り的には、関連する毛細血管サイズの船が、それらは、より大きな細動脈サイズの血管を生成する際の制限のために、バルク流体の流れとの統合が困難な場合があります。これらのネットワークの集合体の上に直接制御がないため、最終的なアーキテクチャは、繰り返し同じ流体の流れおよび輸送特性とのネットワークを生成することが困難になる、サンプル間で変化し得ます。

3D、反復ジオメトリと明確に定義されたアーキテクチャを有するヒドロゲル埋め込み微小流体ネットワークを生成するために、微細加工技術の数は、モジュールアセンブリ13、犠牲材料16、ダイレクトライトアセンブリ14と、全方位印刷15の3Dプリントなど、開発されてきました。これらの方法は、微小流体アーキテクチャ、したがって流体の流れと輸送特性を適用し、繰り返し多くの構築物を横切って製造することができます。これらのアプローチの主要な制限は、しかしながら、作成することができないことであるmicrof毛管サイズの特徴、4〜10μmの19とluidicネットワーク。ほとんどの微細加工技術は、多くの場合、直径13,16に150から650ミクロンまでの範囲の特徴に限定されています。いくつかの既存の技術には、直接書き込みアセンブリ14のために10〜300μmで、広い直径範囲にわたってチャンネルを階層的ネットワークを生成することが可能であり、かつ全方位印刷15 18へ600μmのは、それらは、密なネットワークまたはを生成する能力が制限されています単一の構築物7内に近接した複数のマイクロ流体ネットワークを生成します。

これらの制限のいくつかを克服するために、我々は、生体模倣の反復可能な製造を可能にする画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解技術、in vivoでの微小血管系のアーキテクチャを再現階層型マイクロ流体ネットワークを開発しました。これを行うには、80 MHzで動作する790 nmで、140フェムト秒（fs）は、パルスレーザは、ラスタスキャンiはin vivoでの血管系の画像で定義されたように、n、ヒドロゲル内の3D位置を希望します。私たちは、水が20を拡張したように、分解プロセスは、水のレーザ誘起光学破壊、結果として得られるプラズマ形成、水のその後の急速な熱弾性膨張、およびヒドロゲルの局所的劣化を介して動作することを推測しています。この機構は、タンパク質ベースのヒドロゲル21-24のレーザーベースの分解から若干異なります。低多断面を有するPEGDAとは異なり、タンパク質は、しばしば大規模な多断面を有し、したがって、多光子吸収によって誘起される化学破断23を介して分解されます。画像誘導微小流体ネットワークを生成するために、レーザシャッタは、微小流体アーキテクチャを定義する関心9の領域のモザイクから成り画像誘導仮想マスクによって制御されます。このアプローチを用いて、3D血管由来のバイオミメティックマイクロ流体を製造する能力が実証されています局所的に分解中に送達されるエネルギーの量を変化させることによりヒドロゲルの多孔性を制御するために、 インビボでの脈管構造の緻密で蛇行アーキテクチャを再現ICネットワーク。また、近接（15ミクロン）に絡み合う二つの独立したマイクロ流体ネットワークを生成することができたが、直接7を接続したことがありません。我々はまた、内皮細胞の接着および管腔形成7を促進するために、インテグリン連結ペプチド配列、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン（RGDS）でポスト分解官能を通じてレーザー分解マイクロチャンネルを内皮化する能力を実証しました。

このプロトコルでは、PEGDAヒドロゲルにおける複雑なマイクロ流体ネットワークの世代は、多くの大学のキャンパスでアクセス可能な市販の顕微鏡を用いて画像誘導、レーザーベースの分解を経由して可能となります。分解プロセスは、デジタル、仮想マスクによって案内されるように、このファブリカション技術は、多種多様な用途での使用を可能にする、マイクロ流体ネットワークの創造的なデザインのために適しています。私たちは、ここで説明する方法は、バイオミメティック器官とモデリングの薬物輸送2における重要な生物学的輸送プロセスを複製することができる人間のオンチップデバイスを設計する際に最も有利になることを期待しています。この製造技術はまた、癌転移5,6及び血液脳関門モデル25を含む、 インビトロでの疾患モデルの生成のために関心のものであってもよいです。レーザーベースのヒドロゲルの分解は、以前に神経突起伸長21-23の誘導のためのトラックを作成するために使用されているように、この技術の画像誘導延長は、ユーザー定義の3D空間配置内のセルを配置するために、高度な組織工学戦略において有用であることが証明できました。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.仮想マスクを作成

注：マウス脳微小血管系の3D画像スタックは、このプロトコルのためのマイクロ流体モデルとして選ばれた全体マウス脳微小血管系の画像を含むはるかに大きなデータセットから抜粋されました。微小血管の画像は、ナイフエッジの走査顕微鏡（KESM）26、2を介して取得しました。同様の微小血管のデータがKESMマウス脳アトラス28を介して公然と入手できます。

  1. （Zによってyでx）は450ミクロンのx 450μmのX 1.5ミリメートルに収まる、画像処理ソフトウェア29を開き、開いた、希望のマイクロ流体ネットワークは、ヒドロゲル内で生成されるように、ネイティブ血管系の3D TIFの画像スタックをトリミング窓。これを行うには、所望の領域の周囲に四角形を描画し、「イメージ」→「トリミング」をクリックします。所望のスライスに「画像」→「重複」とタイプをクリックすることにより、z方向のスライスを削除します範囲。
    注：これは（yでx）の所望の特徴は、視野内に収まることを保証します（531.2 X 531.2μmで2884 X 2884ピクセルのフレームサイズと0.8のズームと20X（NA1.0）水浸対物レンズを使用した場合レーザー走査型共焦点顕微鏡）および20X（NA1.0）水浸対物レンズの作動距離（Z）。未知の場合は、他のシステムの視野は、所望の目的と設定で画像を取得することによって決定することができます。
  2. 機能は主にラスタースキャン、またはx方向の方向と一致している、「イメージ」をクリックして→→「回転」「変換」するように画像スタックを回転させます。これは、製造に必要な時間を減少させます。
  3. 画素サイズが一致するかは、共焦点顕微鏡で分解のために使用される設定（0.184ミクロン/ピクセル2884ピクセルによって2884のフレームサイズと20X（NA1.0）水浸対物レンズを使用して超えるようにトリミングされた画像スタックを拡大縮小および0.8のズーム）。これを行うには、「イメージ」をクリック→→「サイズ」を「調整」と「幅」（ すなわち、450ミクロン、または0.184ミクロン/ピクセルによって分割された画像の大きさ）は、「2446」を入力します。
  4. しきい値/「Ctrlキー+ Shiftキー+ T」を入力することで画像スタックを2値化。 「暗い背景」を選択解除して、→「OK」「適用」をクリックします。 「イメージ」→「ルックアップテーブル」→「反転LUT」をクリックしてプロセスを完了します。
  5. カスタム・アルゴリズムを使用して、X（ラスタ走査の方向に平行な二値（白）フィット単一の画素高四辺形のモザイクと特徴、プログラミングソフトウェア9（ソースコードは、参照原稿の補足資料で利用可能です）方向）<関心領域のレーザ位置およびシャッター9、7、30、31を導く（関心領域） を生成しますSUP> 32。
    注：カスタムアルゴリズム9は、RLSファイルにTIFの画像スタック内の個々の平面に変換します。
  6. 分解中に使用するために.OVLするRLSファイルのファイル拡張子を変更します。

2.レーザー走査型共焦点顕微鏡の構成

注：パルスレーザを備えた他のレーザ走査型顕微鏡を使用することができるが、ここでの設定およびプロトコルは、そのソフトウエアと組み合わせてレーザー走査顕微鏡（LSM）の使用を記載しています。

  1. 上のレーザー走査共焦点顕微鏡では、顕微鏡ソフトウェアを開き、クリックして "スタートシステム」を「メンテナンス」タブで客観「Wプラン - アポクロマート20X / 1.0 DIC VIS-IR M27 75ミリメートル」を選択します。
  2. 「ヒドロゲルの可視化」のコンフィギュレーション設定
    1. 「取得」タブでは、レーザ線（514nmのアルゴンレーザー）は「レーザー」windoで選択し、オンされていることを確認ワット注：このチャネルは、オリエンテーションの目的の7のためのエオシンYの蛍光を介したハイドロゲル画像に使用されます。
    2. 「イメージングの設定」ウィンドウで、「フレーム」に「すべてのトラックの切り替え」、および「トラック1」を選択し、「チャネルモード」は、「モード」に設定します。
    3. 「光パス」ウィンドウでは、516 nmの735までの範囲で、唯一のCh1の蛍光検出器を選択します。メインビームスプリッタ（MBS）の可視光回線上の514分の458フィルター;そして、不可視光のラインでプレート。明視野光電子増倍管検出器、「T-PMT」を選択解除します。
    4. 「取得モード」ウィンドウで、正しい目的が選択されていることを確認し、XとYに「2884」に「フレーム」を「スキャンモード」、「フレームサイズ」を設定し、「ラインステップ」を「1」 「平均」に「ライン」、「平均化方法」に「1」、「平均化モード」、「平均化回数」、「ビット深度」を「16ビット」、および「方向」を「 - 双方向走査のために、「<>。
    5. 所望のように「取得モード」ウィンドウで、「スピード」を設定し、 "0.05"に "コアーX」と「Y」に設定するか、または使用されている特定の顕微鏡の必要に応じて調整してください。 「HDR」を選択解除します。
    6. 「取得モード」ウィンドウで、「ズーム」が「0.8」に設定すると、「スキャン領域」は、「531.2ミクロンのx 531.2ミクロン」と「0.18」の「ピクセルサイズ」の「画像サイズ」が表示されていることを確認;ゼロに他のすべての「スキャン領域」の値を設定します。
    7. 「チャンネル」ウィンドウで、Ch1の蛍光検出器として「トラック1」を選択します。 "800"の「10.0」のパーセントパワーで選択レーザーライン「514」、「1AU」の「ピンホール」、最初の「ゲイン（マスター） "、" 0 "から"デジタルオフセット」、および「デジタル・ゲイン」の4; 1 "。
      注：特定の顕微鏡用必要に応じてこれらの設定を調整し、使用されています。
    8. 「ハイドロゲル可視化」として、この設定を保存します。
  3. 「チャネル形成」のコンフィギュレーション設定
    1. 「レーザー」ウィンドウ内に選択されていると：「取得」タブでは、レーザーライン（SレーザーのTiパルス化790nmの140フェムト秒）がいることを確認してください。 790 nmでの最大電力出力のために、「4000」から「GDD補正」を設定します。
    2. ステップ2.2.2で概説したように「イメージングの設定」ウィンドウを設定します。
    3. 「光パス」ウィンドウでは、可視光のライン上のMBS 458/514/561/633フィルタと不可視光回線上のMBS 760+フィルターで、何の蛍光検出器が選択されていないことを確認してください。明視野光電子増倍管検出器、「T-PMT」を選択解除します。
    4. 「取得モード」ウィンドウで、正しい目的がリストされていることを確認。 3 "に"スピード "を設定「ステップ2.2.4で概説されるように他のすべての設定。
    5. 「チャンネル」ウィンドウでは、T-PMT検出器として「トラック1」を選択します。 「800」の「100.0」、最初の「ゲイン（マスター）」のパーセントパワーのレーザライン「790」を選択し、「0」から「デジタルオフセット」、「1」の「デジタルゲイン」 。
    6. 「ステージ」ウィンドウで、「ゼロを設定する」をクリックするだけでステージをゼロ。 「マーク」をクリックすることで、位置をマーク。これは、ステップ3で、顕微鏡マクロに仮想のマスクをアップロードするために重要です。
    7. 「時系列」ウィンドウで、「0」として「1」と「間隔」と「サイクル」に設定します。
    8. 「ブリーチ」ウィンドウで、「スタート漂白＃スキャンの後に "チェックボックスをオンにして、「1の0」の値に設定します。 「3」（8.96マイクロ秒/ピクセルの画素滞留時間に相当）の値で、「異なるスキャン速度」を選択します。 「安全なBLを選択GaAsPのための各 "。
    9. 「ブリーチ」ウィンドウのレーザー線区間では、790レーザーラインを選択し、「100.0」パーセントの電力を設定します。選択されていない漂白ウィンドウ内のすべての他のボックスのままにしておきます。 「ブリーチ」ウィンドウで漂白設定を保存します。
    10. 「チャネル形成」として、この設定を保存します。
      注：「Z-スタック」、「地域」、「フォーカス」、および「ステージ」ウィンドウもこのプロトコルにとって重要であるが、初期設定時に設定または調整する必要はありません。

3.レシピを作成し、顕微鏡ソフトウェアおよびマクロへの仮想マスクをアップロード

  1. 「チャネル形成」構成でまだ実行されているレーザー走査共焦点顕微鏡、まだ上の顕微鏡ソフトウェア、選択します（次の「実験を開始する」ボタンへ）のみ「リージョン」ウィンドウで。
  2. マスクが正しい顕微鏡マクロにロードすることを確認するために、LY、「8」に「取得モード」ウィンドウで「0.2」から「チャンネル」ウィンドウと「速度」にパーセントのパワーを設定し、画面の左上にある「スナップ」をクリックします。
  3. 画像の「情報」タブで、「0.18」のピクセルサイズで、画像サイズは「531.2ミクロンのx 531.2μmのは "まだであることを確認してください。これらの値が正しくない場合は、もう一度「フレームサイズ」と「ズーム」の値を確認してください。
  4. CRITICAL：「ステージ」ウィンドウで、XとYの位置をゼロしていること、および位置は、顕微鏡のマクロを開く前にマークされていることを確認してください。 2.3.6ステップを参照してください。
  5. 顕微鏡マクロ、タイプ「Altキー+ F8」を開くには、「ロード」をクリックして、正しいバージョンを選択します。具体的な材料/機器のリストで詳細を参照してください。サブマクロの長いリストは、「マクロ・コントロール」ウィンドウで開きます。
  6. 「マクロコントロール」ウィンドウで、MICRを開くには、「ファイル名を指定して実行」をクリックしますマクロOSCOPEし、「マクロ・コントロール」ウィンドウを閉じます。
    注：顕微鏡マクロの代替バージョンでは、このプロトコルを使用してレーザーベースのヒドロゲル分解と互換性がない場合があります。
  7. 顕微鏡マクロの「保存」タブで、「単一ファイル出力」を選択し、任意の「ベースファイル名」を提供し、「一時ファイル」フォルダを選択しました。で、場所「1」に「オープンTEMPフォルダを「設定」シングル一時イメージフォルダ」を選択し、レシピに名前を選択し、「場所の一覧を思い出してください」と「店舗/レシピを適用します」。最初にレシピを作成するには、「ストア」をクリックしてください。
  8. 顕微鏡マクロの「取得」タブで、「スキャンの設定は、「ステップ2.3で設定された顕微鏡のソフトウェア構成に与えられた名前と一致することを確認。 「0」の「間隔」で、 "1"に "ブロック内の時間がないのポイント」を設定します。 Z STACのトップへ - "Zをマークすることを確認しますkが「緑の強調表示されている。彼らがそうであるように他のすべてのデフォルト設定は大丈夫です。
  9. 顕微鏡マクロの「タイミング」タブで、「遅延を待って」いることを確認し、緑色にハイライト "1"と "0" "最初の場所でブロックする前に待機間隔」に「実験繰返し」と「グループ繰り返し」に設定されています。他のすべてのデフォルト設定をそのまま罰金です。
    注：「グループ繰り返し」（とない「実験繰返し」）1は、領域にわたって回レーザースキャンの数を設定することができボックスがある（ すなわち、レシピの繰り返し）。
  10. 顕微鏡マクロの「Zリスト」タブでは、z方向の劣化面が指定されています。使用する仮想マスクの数と一致するように設定された「ポジション数」と、「1ミクロン」に、「dZとする「Z-間隔を設定します。
  11. 「ドロップダウンリストに表示されるリチウムを「Zリスト」を作るために "Zスタックを作成」ボタンをクリックしてくださいウインドウの下部にある場所」のstが。場所とz間隔の数が正しいことを確認し、XとYの位置をゼロにしていること。
    注：そうでない場合は、レシピを格納しません。顕微鏡マクロを閉じて、顕微鏡マクロを再度開いて、もう一度レシピを設定する前に、ステップ2.3.6を繰り返します。
    注：顕微鏡マクロに個々のマスクをロードするようにする代わりに1ミクロンずつ離間100マスクを有することが、例えば、同等のマイクロ流体構造を得るために、それぞれが二回使用され、1マイクロメートル離れた、50のマスクを有することが有利であることができ時間がかかる可能。
  12. 顕微鏡マクロの「ブリーチ」タブでは、マスクのすべてがロードされなければならないと「場所のリスト」内の特定の番号の位置が一致しました。開始するには、「ブリーチ」ボックスを選択していることを確認し、「コンフィグ」。主顕微鏡ソフトウェアの画面で「ブリーチ」ウィンドウで漂白設定の名前と一致する（ステップ2を参照してください.3.8）。 "0"に「ブリーチ後の遅延を待ち "に設定し、「スポット」、および「ROI」空を残す選択を解除します。
  13. 「場所」、「タイル」、「グリッド」、「オートフォーカス」、「ブロック」、およびデフォルト設定から「オプション」タブには何も変更しないでください。
  14. 顕微鏡マクロにマスクをロードするには、顕微鏡ソフトウェアの唯一の「リージョン」ウィンドウを選択し、顕微鏡マクロの「ブリーチ」タブを開きます。 「リージョン」ウィンドウで、「読み込み」をクリックして、分解されzスタックの底にマスク用の.OVLファイルを選択します。
    注：「Zリスト」の最初の場所は、zスタックの底であり、顕微鏡マクロは、zスタックの最上部、またはヒドロゲルにそのように動作します。
  15. ROIのリストは、「リージョン」ウィンドウに表示されたら、（画像上にステップ3.2でスナップ）視野内にマスクののROIを表示するには、矢印ボタンをクリックします。 ROIは内に収まることを確認します視野。
  16. その後、顕微鏡マクロにロードされたマスクを保存する「ブリーチ」タブの「ROIリストに現在のリージョンを追加」ボックスにマスクに名前と番号を与える、とするには、「ROIリストに現在のリージョンを追加」ボタンをクリックします。名前と番号は（他の以前に作成したレシピからマスクを含む）を、他のマスクで「ROI」ドロップダウンリストに表示されます。顕微鏡ソフトウェアの「リージョン」ウィンドウでマスクを削除します。
  17. 繰り返しは、顕微鏡マクロにすべてのマスクをアップロードして保存する3.14と3.16を繰り返します。
  18. 各Z-場所にアップロードされたマスクを割り当てるには、ドロップダウンリストの「場所の一覧」に位置1を強調表示します。 「ROI」ドロップダウンリストから適切なROIを選択します。 「ブリーチ」ボックスを顕微鏡マクロで「ブリーチ」タブの上部に選択されていることを確認。
  19. その後、繰り返し「場所の一覧」ドロップダウン内の全ての位置のためのステップ3.18、および＆の「ストア」をクリック＃34;保存」タブでは、その最終的な形でレシピを保存します。

4. PEGDAヒドロゲルを光重合

  1. トリエタノールアミン（TEOA）で滅菌HEPES緩衝生理食塩水（HBS）を作ります
    1. 1-Lのビーカーに、塩化ナトリウム2.922グラム、HEPESの1.196グラム、およびヒュームフード内TEOAの7.5ミリリットルを加えて混ぜる、撹拌棒を500ミリリットルのDI H 2 Oを追加します。
    2. パスツールピペットで滴下することにより、1 N水酸化ナトリウム溶液でpH 8.3に調整します。
    3. 滅菌フィルター500mLのオートクレーブしたガラス製メディアボトルに0.2μmの真空濾過カップを通して溶液。 4℃でアリコートとストア。
  2. 底部のうち20 mmの穴カットに特化した60 mmのペトリ皿にバッキングと両面接着剤のリングを取り付けます。接着リング上のバッキングを残して、ペトリ皿と接着剤との間から気泡を押し出します。
  3. 材料を準備します。合成された33 3を持参してください。4 kDaのPEGDA -80°Cの冷凍庫のうち、それが室温に到達することができます。ヒドロゲルを光重合前に、白色光源少なくとも15分をオンにします。
  4. ヒュームフードでは、（エオシンY、光開始剤の露光を防止するために使用）箔で覆われ、2 mLの琥珀色の遠心分離管にTEOAとHBSの1 mLを加え。 DI H 2 OにY二ナトリウム塩エオシン1 mMと10μLを追加
  5. ドラフト内で、パスツールピペットでガラスビーカーに、1-ビニル-2-ピロリドン（NVP）の少量を抽出します。このボリューム、NVPのピペット3.5μLからHBS、TEOAと琥珀色の遠心管、およびエオシンYの中へ
  6. 第二の箔で覆われ、2 mLの琥珀色の遠心管に3.4kDa PEGDA 10mgを追加（プレポリマー溶液の誤った光活性化を防止するために使用されます）。 PEGDAプレポリマー溶液w / vの5％Y、NVP液エオシン、HBS、TEOAの0.2 mLを加え。 PEGDAまで渦が完全に溶解します。電力計と検出器ワンドを使用して、白色のLiの強度を調整します95ミリワットにGHTソース。
  7. ポリ（ジメチルシロキサン）（PDMS）金型の構築
    1. 取り扱いを容易にするために、より大きな表面（ガラス、ポリスチレン組織培養皿）にPDMSモールド7を構築し、成形ヒドロゲルは20 mmの直径の円内に収まるように、金型を組み立てます。
    2. 厚さ500μmの矩形のヒドロゲルを生成するには、2つの定義されたヒドロゲルのエッジを作成するために、PDMSの表面上に2厚さ500μmのPDMSのスペーサーを配置します。
    3. 流体を導入するために有用であるハイドロゲルの表面に300μmの深井戸を付与する300μmのPDMSのスペーサーが含まれます。
  8. PEGDAプレポリマー溶液w / vのPDMSモールドの上に5％のピペット60μL。ピペット操作中に気泡を導入しないように注意してください。
  9. センターと配置[3-（メタクリロイルオキシを）プロピル]トリメトキシシラン（TMPSA）は、溶液の上に＃1.5カバーガラス、40 mmの直径7を官能。 coverslていることを確認してくださいipが500μmのPDMSスペーサー上に載っています。ヒドロゲルは、メタクリルカバースリップに結合し、溶液中に浮遊からヒドロゲルを防ぐことができます。
  10. PDMS、PEGDAプレポリマー溶液を置き、3分間の白色光源下でのアセンブリをカバースリップ。
  11. 金型とPDMSからヒドロゲルを分離するためのカバーガラスとの間の流れのDI H 2 O。 DI H 2 Oでハイドロゲルをすすぐラボ組織でカバースリップの端を乾燥させます。ヒドロゲルから水を触れたり吸い上げないように注意してください。
  12. 接着剤からバッキングを除去した後、準備されたペトリ皿にカバースリップを接着し、静かに接着剤とガラスの間から気泡を除去。 DI H 2 Oでペトリ皿にヒドロゲルを水没
    注：PDMSモールドは、DI H 2 Oですすいだ場合に、追加のヒドロゲルを作製するために再利用し、窒素で乾燥し、埃のない保つことができます。

5.血管由来のマイクロ流体ネットワークを製作レーザーベースの分解を経由しての

  1. 上のレーザー走査型共焦点顕微鏡と顕微鏡ソフトウェアを使用すると、「メンテナンス」タブで客観「Wプラン - アポクロマート20X / 1.0 DIC VIS-IR M27 75ミリメートル」を選択します。上にあり、ウォームアップ：「取得」タブで、必要なレーザーライン（Sレーザー514nmのアルゴンレーザーとTiをパルスした790 nmの140 fsは）ことを確認してください。
  2. 入口チャネルを形成するためにヒドロゲルを設定します
    1. ステージインサート上のヒドロゲルおよびペトリ皿を取り付け、顕微鏡ステージ上のステージインサートを配置します。 DI H 2 Oへの水浸対物レンズを下げる前に、目でDI H 2 Oセンターの少なくとも5 mLのハイドロゲルとよく機能してシャーレを埋めます
      注：目的-2でハイドロゲルを粉砕しないでください触れてはいけません！
    2. ヒドロゲルを見つけるには、ステップ2.2から「ハイドロ見える化」設定に切り替えます。上のレーザーラインを回すと目を持参する「ライブ」をクリックしますヒドロゲルの上部の（CH1蛍光検出器で検出）エオシンY信号を見ることができるまで、ヒドロゲルに電子目的近いです。
      注：簡単にヒドロゲルを検索するには、パーセントのパワーを大きくすることができ、またはピンホールを開くことができます。目的は、ヒドロゲルに焦点を当てされると、しかし、蛍光検出器を保護し、検出器の過飽和を避けるために、かつ正確にヒドロゲル表面を見つけるために戻って1AUにピンホールを減少させるパーセントの力をドロップします。
    3. 「ステージ」ウィンドウでは、ヒドロゲルの井戸の底の上下の位置をマーク。
      注：Z値ここでは、ヒドロゲルの厚さと井戸の深さを決定するのに役立ちます。
    4. ウェルのエッジを見つけるために、XとYに移動するにはジョイスティックを使用してください。 その逆も左でもして、画面の右側にハイドロゲルを置き、または。ヒドロゲルは、視野のない3分の2以上を埋めないように許可します。
    5. plのドロップフォーカスダウン150μmの「フォーカス」ウィンドウ内の「150」「ステップサイズ」を設定し、「Z位置」ボックスの横にある下向きの矢印をクリックしてヒドロゲルへのANE。繰り返しステップ5.2.4、必要に応じて。
      注：注入口のx、y及びzの位置は、単に仮想のマスクの設計に依存します。
    6. CRITICAL：ゼロ「ステージ」ウィンドウで、XとYの位置は、他のすべての印を付けた位置を削除し、のみ、この場所をマーク。
      注：このステップが実行されない場合は、顕微鏡のマクロが正常に以前に保存されているレシピに場所を復元しませんし、ヒドロゲルは、所望の位置に分解されることはありません。
  3. 入口チャネルを形成します
    1. 「スナップ」の画像と「地域」ウィンドウ内の四角形のボタンを使用して血管網への入口になる矩形領域を描画します。
      注：地域のことを確認してください一部は番目のことを確保することは、十分に出て延びています電子入口は血管網にも接続します。
    2. 次の「リージョン」ウィンドウで生成されたROIに、「取得」を選択し、「ブリーチ」と「分析」を選択解除します。
    3. 「ヒドロゲルの可視化」設定を保存し、「地域」を選択解除し、ステップ2.3に設定し、「チャネル形成」設定に変更します。 「チャネル形成」設定では、「地域」を再度選択します。
      注：「ヒドロゲルの可視化」と「チャネル形成」の設定を切り替えると、画面の左上にある領域を選択解除してください。これを行わない場合時には地域のスケーリングは、構成の間で予期せず変更することができます。
    4. 「チャネル形成」設定では、唯一の "地域"と "Zスタック」が選択されていることを確認します。 「Z-スタック」ウィンドウで、トップとし、 "センター"お尻で「センター」ボタンをクリックしてください上記の現在のZ位置などのzスタックの中心を設定するには、「オフセット」。入口があることが必要であるか大きいによって、「1」の「間隔」と「スライス」の数を設定します。 Z-スタックのサイズは、「範囲」の下に表示されます。
    5. 「取得モード」ウィンドウ内の「スピード」が「3」に設定し、「チャンネル」ウィンドウ内の「パーセントパワー」を「100」に設定されていることをされていることを確認してください。設定を保存し、「実験を開始」ボタンをクリックします。
      注：入口チャネルを生成するために、ここで実行されるような顕微鏡マクロは、複数の面で同じ単純な形状を分解するために必要とされていません。各個々の平面上の異なる領域を分解するとき、マクロにのみ必要であり、レシピ内の仮想マスクを格納するために使用されます。
    6. トンで地域場合は、「チャンネル」ウィンドウで分解中にハイドロゲルを視覚化し、いずれかの「ゲイン（マスター）」を増加させるために、彼の視野が黒で、または領域が白であれば「ゲイン（マスター）」を減少させます。
      注：ここで気泡形成はレーザ誘起ヒドロゲル分解の指標です。
    7. 入口に一度だけ、複数回の代わりを分解するために、「時系列」ウィンドウ内の「サイクル」を調整します。
    8. 「ヒドロゲルの可視化」の構成では、入口が形成されたことを確認するために「ライブ」をクリックします。
  4. マイクロ流体ネットワークを生成するためのハイドロゲルの設定
    1. 「リージョン」ウィンドウで、仮想マスクのzスタックから任意の.OVLファイルをロードし、視野内のROIを表示するには、矢印ボタンをクリックします。
    2. 「ヒドロゲルの可視化」の構成をスキャンして、入口は血管網内の正しい場所に接続するように、XとYにヒドロゲルを配置するために、ジョイスティックまたは「ステージ」ウィンドウを使用生きるために「ライブ」をクリックします。
      注：確認してください仮想マスクのROIが先に形成された入口をわずかにオーバーラップします。
    3. 「フォーカス」ウィンドウ内の「ステップサイズ」を使用し、 "Zポジションの横にある下向きの矢印をクリックし、ダウン焦点面前回の中心Z-場所から50ミクロン、またはハイドロゲルの表面から200ミクロンをドロップ"ボックス。これは、顕微鏡、マクロの最初の位置になります。
      注：z方向に移動する実際の距離は、ネットワーク設計に依存します。目的のネットワークは、z方向のヒドロゲルの上部または下部表面を越えて延びていないことを確認してください。
    4. CRITICAL：ゼロ「ステージ」ウィンドウで、XとYの位置、他のすべての印を付けた位置を削除し、そして唯一のこの場所をマークします。
      注：これは、顕微鏡マクロの出発点になります。レシピは、ハイドロゲルの表面に向かって戻すように動作します。
    5. 「スナップ」「ヒドロゲルの可視化」構成の画像、削除しdeselecトン「地域」、およびコンフィギュレーションを保存します。
  5. マイクロ流体ネットワークの生成
    1. 「チャネル形成」設定に変更し、唯一の「時系列」と「漂白」ウィンドウを選択します。彼らが最初のステップ2.3.7および2.3.8で設定されたように、「時系列」と「漂白」ウィンドウの設定があることを確認します。
    2. 「8」を「取得モード」ウィンドウの「スピード」と「チャンネル」ウィンドウ内のレーザラインに「0.2」のパーセント電力を設定します。設定を保存します。
    3. ステップ3.5以下の顕微鏡マクロを開きます。マクロの「保存」タブで、ステップ3から以前に作られたレシピを選択し、「適用」をクリックします。
      注：「ストア」をクリックしないでくださいまたはレシピが上書きされます！
    4. すべてのタブの設定を確認し、仮想マスク（.OVLファイル）がまだ正しくトンに関連付けられていることを確認ドロップダウンリストで、彼Z-場所。また、最初のZ位置は、顕微鏡ソフトウェアの「ステージ」ウィンドウでマークされた場所と一致することをご確認ください。
      注：顕微鏡マクロは、ハイドロゲルの底からそのように動作しますよう反し、ドロップダウンリストの2番目の位置が（に最も近い（最も遠い目的から）ヒドロゲルの先頭に、最初の位置の上に物理的になります目的）。
    5. 再び「チャネル形成」の設定を保存し、顕微鏡マクロで「更新」をクリックします。 「現在位置のリストを上書きしますか？」に「いいえ」をクリックして、[レシピを開始するために、顕微鏡のマクロで「スタート」をクリックします。

6.マイクロ流体ネットワークの可視化

  1. ヒドロゲルと劣化後の形成された微小流体ネットワークを表示するには、顕微鏡のマクロを閉じます。エオシンYのsiを表示するには、 "ハイドロゲルの可視化」の設定に切り替えヒドロゲルのgnal。劣化したネットワークは暗く表示されます。
    注：顕微鏡マクロの実行中にヒドロゲルの分解を視覚化することができません。
  2. 具体的には、マイクロ流体ネットワークを表示するには、ヒドロゲルのネイティブエオシンY信号よりも明るいシグナルを有する導入フルオレセイン（FITC）標識デキストランのイメージングを可能にするために低いレーザーパワーで「ヒドロゲルの可視化」の設定を使用します。
  3. 蛍光標識デキストランを導入する前に、ラボの組織を使用してヒドロゲルに井戸から水を吸い上げます。 DI H 2 O中5mg / mLの2000 kDaのFITC標識デキストランの10μL（0.2μmのシリンジフィルターを通して事前にフィルタ処理）でピペット。
    注：ゲル中に拡散するのを防止するために、任意のデキストランのサイズの2,000キロダルトン以上を使用してください。イメージングは​​、より長い30分間、FITC標識したデキストラン溶液からヒドロゲルの乾燥および水の蒸発を防ぐために、60％の湿度（またはそれ以上）とインキュベートしたステージを使用する場合。
  4. ヒドロゲルaを削除しますステージからのNDシャーレ以降の実験中に形成された血管網の容易な場所を有効にするには、ペトリ皿をマーク。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3D、血管由来のマイクロ流体ネットワークを生成するために、画像誘導、レーザーベースのヒドロゲル分解の実装を実証するために、我々は27、ナイフエッジの走査顕微鏡（KESM）26を介して取得されたマウスの脳血管系の3D画像スタックを利用しました。上記のように、より大きな微小血管データセットの選択された3次元領域が、画像誘導微小流体ネットワークを形成するための仮想のマスクのシリーズに変換しました。製造後、得られた微小流体ネットワークは、FITC標識、2000 kDaのデキストランの溶液で灌流し、共焦点顕微鏡を介して画像化しました。ネットワークアーキテクチャ（ 図1AおよびC）を定義して作製微小流体ネットワーク（ 図1BおよびD）は、Z-突起（ 図1AおよびB）と3Dレンダリングを生成するために使用されたインビボでの脈管構造（ 図1CのイメージスタックとD in vivoでの血管系の複雑な構造を再現3Dバイオミメティックマイクロ流体ネットワークの製造を可能に示しています。技術は、直径の広い範囲を含むネットワークの製造に適しています。 図1内に、直径が3.3から28.8ミクロンの範囲のチャネルが生成しました。 図1Bの左上にあると、図1Dの左の隅に、より大きな長方形の構造がネットワークに流れを導入するための入口チャネルであることに注意してください。

figure-results-1
図1：マイクロ流体ネットワークを血管由来。マウス脳血管系（AとC）の画像スタックから派生した仮想一連のマスクは、ファブリカに使用されました画像誘導、レーザーベースの劣化を経てPEGDAハイドロゲル（BおよびD）に埋め込まれたテ3Dバイオミメティックマイクロ流体ネットワーク。マイクロ流体ネットワークは、2000 kDaのFITC標識デキストランで灌流し、共焦点顕微鏡を経由して画像化しました。 Z-突起（A及びB）及び2つのネットワークの3Dレンダリング（C及びD）は密度、組織、およびインビボで脈管構造の全体的なアーキテクチャを再現微小流体ネットワークを生成する能力を示します。矢印（D）は 、デキストランを紹介するために作成した長方形の入口をマーク。スケールバーは50μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

我々は、流体Fを開始するために、二つの方法、圧力ヘッド、シリンジポンプを実装していますこれらの埋め込まれたマイクロ流体ネットワークにおける低いです。例えば、30〜30μmとすることにより、矩形チャンネルは圧力ヘッド7を介して駆動流体の流れで、micromolded PEGDAハイドロゲル（ 図2A）に2つの井戸を接続するために作製しました。マイクロチャネルを通って、右のウェルに流れを誘導された圧力水頭、よく左に生成されます。 図2A、テトラメチルローダミン（TRITC）の初期のフロントは標識では、70 kDaのデキストランは、タイムラプス顕微鏡を使用して、チャネルを通って移動が観察されました。その後、 図2（b）に、10μmの直径蛍光ポリスチレン球は、右のウェルに、チャネルを介して、よく左から流れました。入口でよくmicromolded内に存在する流体の体積によって制御された流れの持続時間、および入口との間に発生する静水圧勾配によって制御される流量ととよく出口、micromoldedヒドロゲル内の圧力ヘッド駆動流は、簡単な方法を提供し、流れのためにありますduction、外部ハウジングまたはシリンジポンプを必要としません。

figure-results-2
図2：Micromolded PEGDAヒドロゲル中の圧力ヘッド駆動流。 PEGDAは、埋め込まれたマイクロチャネルによって接続された2つのウェルを含有するヒドロゲルを形成するmicromoldedました。圧力ヘッドは、1つのウェルから30μmで30による長方形のチャネルを介してTRITC標識、70 kDaのデキストラン（A1-A3）の流れと10μmのポリスチレン球（B1〜B3）を開始するためにも左で生成されましたその他。スケールバーは50μmで表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

代替的に、マイクロ流体ネットワーク内で一定の流体の流れを生成するために、シリンジポンプ駆動F低は、シリンジポンプとのインタフェースのための入口および出口ポートと二マイクロ流体デバイスの内部にヒドロゲルを光重合することによって開始することができます。 図3Aに、市販の、予め製作マイクロ流体デバイスは、デバイス7の幅を横切って光重合ヒドロゲルの1 mmのバンドで示されています。レーザーベースの分解は、ヒドロゲル自立のために、ここで説明したのと同じプロトコルを使用して、収容されたヒドロゲル中のマイクロ流体チャネルとのネットワークを作製するために実装されました。シリンジポンプで生成流は、20ミクロンの直径の円筒形チャネルは、マイクロ流体デバイス内に収容されたヒドロゲルで作製された、図3Bに見ることができます。 5μL/ sの流量が印加されると、球は視野を移動に対しストリーキングによって証明されるように、この20ミクロンの直径のチャネルでは、個々の2ミクロン蛍光ポリスチレン球を容易に、流体流なし（ 図3B1）が解決されます（ 図3B2 </強いです>）。この同じアプローチは、周囲のヒドロゲル（ 図3C）にネットワークおよび拡散を介しTRITC標識した、65kDaのデキストランの流れを監視するために、2D、血管由来のネットワークを介して流れを誘導するために使用しました。

figure-results-3
図3：マイクロ流体ハウジング内PEGDAヒドロゲル重合中のシリンジポンプ駆動流。市販の、予め製作マイクロ流体装置（A）17×3.8のx 0.53ミリ（x、y、z）は、マイクロチャネルの家で示される光重合1×3.8のx 0.53ミリ（X、Y、Z）PEGDAヒドロゲルと黒い矢印。 20μmの直径の円筒形チャネルは、ヒドロゲルを介して分解された、および2ミクロンのポリスチレン球は、デバイス（B）を介してポンプ輸送しました。球は明らかに、流体の流れ（B1）せずに解決されていますが、5μL/ sの流量でスジとして表示されます（B2）。別の収容されたハイドロゲルでは、2Dの血管由来のネットワークを作製したとTRITC標識、65 kDaのデキストランは、ネットワーク（C）を介してポンピングしました。タイムラプス顕微鏡は、それがチャンネルを満たし、周囲のヒドロゲル中に拡散として蛍光デキストランをモニターするために使用しました。 （B）及び（C）の白矢印は流体の流れの方向を示しています。 （C）におけるキャリブレーションバーは、蛍光デキストランの強度を示します。スケールバーは、（B1）及び（B2）及び（C）が50μmで20ミクロンを表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

画像誘導、レーザーベースの分解のための仮想マスクの使用を可能にするために、顕微鏡ソフトウェアの標準機能をオーバーライドする上で重要な、顕微鏡マクロが設定し、慎重に操作しなければなりません。どのように顕微鏡マクロで顕微鏡のソフトウェアインタフェースは時々直感に反することができ、多くの努力が、この方法を開発するために、両方のプログラムで最適な設定を決定する際に投資されました。基本的なレーザー走査型共焦点顕微鏡の使用の一般的な理解は、特に「ステージ」と発見し、正しくレーザーベースの分解を試みる前に、x、y、zの次元でヒドロゲルを位置決めするための「フォーカス」ウィンドウで、お勧めします。また、入口流路の作製は、プロトコルに重要です。中断蛍光種は、成功したイメージングおよびネットワークの特性評価のためのマイクロ流体システムを入力することができなければなりません。このプロトコルは、特定のに適用されることに留意することが重要であり、レーザー -顕微鏡ソフトウェアおよび顕微鏡マクロの特定のバージョンを実行している特定のフェムト秒パルスレーザーを用いて構成された走査型共焦点顕微鏡、（特定の材料/機器のリストの詳細を参照してください）。私たちは顕微鏡マクロの新しいバージョンは、画像誘導レーザ制御のために必要な必要な制御と機能性を欠いていることを発見しました。他の顕微鏡プラットフォームとパルスレーザ光源を用いることができるが、このプロトコルは、このシステムに特に適用され、プラットフォーム、レーザ源、およびソフトウェア実装に応じて変更が必要となります。このプロトコルを通して、基本的な原理はまだただし、適用されます。

このプロトコルへの潜在的な変更は、ハイドロゲル組成物を変化させることを含みます。ここで、我々は（脇マイクロ流体ネットワークの世代からの目的のために）5重量％、3.4 kDaのPEGDAヒドロゲルが、レーザーベースの分解を利用すると、PEG化フィブリンを含む合成および天然ヒドロゲル、両方を分解するために実装されました21,22フィブリノゲン、絹タンパク質ヒドロゲル23、及びコラーゲン24。レーザーパワー、走査速度、Zスライス間の間隔、及び繰り返し回数の調整は、他のヒドロゲル製剤に微小流体ネットワークを製造するために最適なパラメータを決定するのに役立つであろう。

技術の一つ電流制限は、時間の実現可能な量に分解することができるヒドロゲルの全体のボリュームです。 37.7 NJ /μm2でのレーザフルエンスを使用した場合、ヒドロゲル内にオープンボイドやマイクロ流体の特徴を作成するには、レーザー滞留時間は8.96マイクロ秒/ピクセル（または0.021ミクロン/μsでのレーザスキャン速度）で、またはより上でなければなりません。 （ 図1に見られるように）これらの設定では、0.014 mm 3でボリューム内の血管を分解するために1.4時間がかかります。下記の4.48マイクロ秒/ピクセルまたはのレーザー滞留時間を用いて、供給されるエネルギーは、ここで使用されるヒドロゲル製剤の完全分解に十分ではありません。異なるヒドロゲルの実装組成物は、この制限を克服することができます。光に敏感なコンポーネント34-36または大規模な多断面21-24を持つハイドロゲルが含まれている光不安定性ゲルの使用は、より少ないエネルギーの利用を可能にし、より高速な劣化につながる良いオプションです。次元の制限に関しては、特徴は、ヒドロゲル7の深い1.5ミリメートルまでに製造されています。深度達成は、対物レンズの作動距離の関数であり、in vivoイメージングのための最適化された超長作動距離対物レンズを使用して増大させることができます。最小の測定チャンネル7は、20X（NA1.0）水浸対物レンズは、 図1に発生した最小のチャンネルのサイズと同等の8.9ミクロンの3.3ミクロンの幅と深さを持っていた使用して作成しました。他のラボが低いNA対物レンズ21,23,24を使用しているが、我々はより小さな機能を備えたマイクロ流体ネットワークが高く使用して作製することができることを期待します縮小作動距離を犠牲にしてER NA対物レンズ。最終的に、しかし、技術の分解能は、集束レーザービーム、レーザ走査特性、レーザによって供給されるエネルギーの量の点広がり関数の関数であり、材料のレーザ吸収特性が劣化します。

また、レーザ特性が（速度、フルエンス、仮想のマスクとの間の間隔、及び繰り返し数）は、ヒドロゲル特性（架橋密度、マクロマー/モノマーの分子量、重量パーセント、及びヒドロゲルの種類に基づいて最適化されなければならない：合成対タンパク質ベース）、これらのように本質的にレーザー、したがって、プロセスの最終的な解決との相互作用が変更されます。供給されるエネルギーも使用目的によって影響されるように目標を切り替えたとき、追加の最適化が必要です。関連する費用に対して、パルスレーザと顕微鏡へのアクセスが要求され、多くの異なるOBJEC一方ティブは、高いNAおよび（in vivoイメージングのための）長い作動距離を有するものは高価であり、使用することができます。

上記およびここに詳述したプロトコルを越えて、この技術を用いて生成されたマイクロ流体ネットワークはまた、内皮細胞の接着および管腔形成7を誘導するために細胞接着性ペプチドポストチャネル加工で官能化することができます。また、劣化したチャネルに先立ってバルク材料9のセル分解性ペプチド配列の組み込みは、ヒドロゲルへと貫通細胞遊走の研究のために可能性があります。 図2及び図 3~7に示されているように、ヒドロゲル内の微小流体ネットワークの連続的な流動化のために、ヒドロゲルは、より大きな流体装置又はハウジング内に光重合することができます。

血管性または血管新生自己集合8-12を介した血管網の発生がVAを誘導するために直接的なアプローチを提供します比較的大きなヒドロゲルボリューム全体にscularization。このアプローチは、灌流流体ネットワークをもたらすが、直接サイズ、ねじれ、密度、および全体的なネットワークアーキテクチャを制御することは困難です。この制限により、血管系における流れプロファイルとせん断速度は、実験間で異なる場合があります。また、微細加工技術13-16は、ネットワーク・アーキテクチャを直接制御を可能にするが、多くの場合、小さな、キャピラリーサイズのチャネルまたはin vivoでの血管のアーキテクチャで模倣密なネットワークの製造を生成することができないことによって制限されています。ここで説明レーザーベースのヒドロゲルの分解技術は、新たにマイクロ流体生成のために再利用されてきたが、それは同時に、密度、ねじれを再現3次元生体模倣マイクロ流体ネットワークの作成を可能にすることによって建築制御、既存の微細加工法の大きさに基づく制限の両方を克服しますサイズ範囲、および全体的なarchitecturin vivoでの血管系の電子。さらに、複数の流体ネットワークは、ネットワーク間のトランスポート7の研究を可能にする、単一のヒドロゲルで生成することができます。より密接にin vitroでの 生体内輸送過程の中で複製するように努めています組織工学アプリケーションでは、ここで概説高分解能ハイドロゲル包埋マイクロ流体ネットワークは非常に適しています。我々は、このプロトコルは、薬物スクリーニング装置として使用するためおよびインビトロ疾患モデルにおいて、より正確に模倣する組織構築物のインビボ輸送の開発に有用であろうことを予想しています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、共焦点顕微鏡法による支援に対して、デラウェアバイオテクノロジー研究所バイオイメージングセンターのジェフ・カプラン博士とマイケル・ムーア氏に感謝します。顕微鏡機器へのアクセスは、国立衛生研究所(NIH)の共有機器助成金(S10 RR0272773およびS10 OD016361)およびデラウェア州連邦研究開発助成金プログラム(16A00471)によってサポートされました。この研究は、NIH国立総合医科学研究所(P20GM103446)、米国がん協会(14-251-07-IRG)、デラウェア大学研究財団(14A00778)、テキサス州がん予防研究所(CPRIT)(RR140013)、およびNIH国立医学図書館(4 R00 LM011390-02)からのInstitutional Development Award(IDeA)からの助成金によって支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MATLABMathworksR2015aはプロトコルで "programming software" と名付けられました。アルゴリズムの詳細については出典 9 を参照してください
FIJI (Fiji is Just Image J)NIHversion 1.51anamed "image processing software" in protocols
LSM 780 Confocal MicroscopeZeissnamed "laser-scanning confocal microscope" in protocol; for laser-based hydrogelプロ
トコールで「顕微鏡ソフトウェア」と名付けZen 2010B SP1Zeissリリース バージョン 6.0
2010Zeissv16.0、ツァイス LSM-780 で使用 (Zen との組み合わせ)
Objective W Plan-Apochromat 20X/1.0 DIC D=0.17 M27 75 mmZeiss421452-9880-000で
カメレオンビジョンIIモードロックTi:Sレーザーコヒーレントは、プロトコルで「高出力パルスレーザー」と名付けられました
ナトリウムグマアルドリッチS5886-1KG
ヘープスシグマアルドリッチH3375-250G
トリエタノールアミン(TEOA)シグマアルドリッチ90279-100ML可燃性、皮膚と目の刺激性、ヒュームフードで作業
水酸化物Sigma-AldrichS5881-500G
150 mL真空ろ過カップ、0.2 µ社内で合成された PES 膜VWR10040-460
PEGDA合成方法のソース33を参照してください; アルゴンの下に保存
トーマスGoldkamp37728
Flexmark 90 PFWはさみ金FLEXconFLX000620二重コーティングテープモデル
SCプロッター(粘着カッター)USCutterSC631E20
ミリメートルの穴MatTek株式会社P60-20-F-NON
高輝度イルミネーター(白色光源)Fiber-Lite4715MS-12WB10
パワーメーターニューポート1916-R白色光源使用時 524nmでパワーを検出
スリムプロファイルワンド検出器ニューポート918D-STパワーメーター用
シルガード 184 シリコーンエラストマーキットダウ コーニング3097358-1004PDMS金型の製造に使用。方法についてはソース7を参照
TMPSA-Functionalized #1.5 Coverslips, 40 mm Roundsyntheated in house
、デキストラン、フルオレセイン、2,000,000 MW、アニオン性、リジン固定可能なライフテクノロジーD7137は、代替のタグ付きデキストランを使用することができます。2,000 kDaは、5% 3.4 kDa PEGDA ハイドロゲル
1 mL シリンジ、Luer-LokBD309628
に容易に拡散しません。Acrodiscシリングフィルター、0.2 µm Supor Membrane, Low Protein BindingPallPN 4602
スティッキースライド VI0.4 Ibidi80601ハイドロゲルの収容に使用できるマイクロ流体デバイス
られた で使用、プロトコルで「顕微鏡マクロ」と名付けられた ZeissLSM-780 で使用、プロトコールで "microscope macro" と名付けられた で使用使用塩化シナトリウムエオシン Y 二ナトリウム塩 シグマ - アルドリッチ E6003-25G 1-ビニル-2-ピロリジノン (NVP) シグマ - アルドリッチ V3409-5G アルゴンの下に保存 ; 発がん性; ヒュームフード 3M ダブル コーティング テープ、9500PC、6.0 ミルで作業のハンドリングのための裏地 SCプロッター(粘着カッター)は、 は

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baish, J. W., Stylianopoulos, T., et al. Scaling rules for diffusive drug delivery in tumor and normal tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (5), 1799-1803 (2011).
  2. Bhatia, S. N., Ingber, D. E. Microfluidic organs-on-chips. Nature Biotechnol. 32 (8), 760-772 (2014).
  3. Esch, E. W., Bahinski, A., Huh, D. Organs-on-chips at the frontiers of drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 14 (4), 248-260 (2015).
  4. Ghaemmaghami, A. M., Hancock, M. J., Harrington, H., Kaji, H., Khademhosseini, A. Biomimetic tissues on a chip for drug discovery. Drug Discov. Today. 17 (3-4), 173-181 (2012).
  5. Jeon, J. S., Bersini, S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (1), 214-219 (2015).
  6. Pisano, M., Triacca, V., Barbee, K. A., Swartz, M. A. An in vitro model of the tumor-lymphatic microenvironment with simultaneous transendothelial and luminal flows reveals mechanisms of flow enhanced invasion. Integr. Biol. 7 (5), 525-533 (2015).
  7. Heintz, K. A., Bregenzer, M. E., Mantle, J. L., Lee, K. H., West, J. L., Slater, J. H. Fabrication of 3D Biomimetic Microfluidic Networks in Hydrogels. Adv. Healthc. Mater. , (2016).
  8. Cuchiara, M. P., Gould, D. J., McHale, M. K., Dickinson, M. E., West, J. L. Integration of Self-Assembled Microvascular Networks with Microfabricated PEG-Based Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 22 (21), 4511-4518 (2012).
  9. Culver, J. C., Hoffmann, J. C., Poché, R. A., Slater, J. H., West, J. L., Dickinson, M. E. Three-Dimensional Biomimetic Patterning in Hydrogels to Guide Cellular Organization. Adv. Mater. 24 (17), 2344-2348 (2012).
  10. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab Chip. 13 (8), 1489(2013).
  11. Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Hydrogels with Immobilized EphrinA1 for Therapeutic Angiogenesis. Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).
  12. Zisch, A. H., Lutolf, M. P., et al. Cell-demanded release of VEGF from synthetic, biointeractive cell-ingrowth matrices for vascularized tissue growth. FASEB J. , (2003).
  13. He, J., Zhu, L., Liu, Y., Li, D., Jin, Z. Sequential assembly of 3D perfusable microfluidic hydrogels. J. Mater. Sci. Mater. Med. 25 (11), 2491-2500 (2014).
  14. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nat. Mater. 2 (4), 265-271 (2003).
  15. Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional Printing of 3D Microvascular Networks. Adv. Mater. 23 (24), H178-H183 (2011).
  16. Kolesky, D. B., Truby, R. L., Gladman, A. S., Busbee, T. A., Homan, K. A., Lewis, J. A. 3D Bioprinting of Vascularized, Heterogeneous Cell-Laden Tissue Constructs. Adv. Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).
  17. Zervantonakis, I. K., Hughes-Alford, S. K., Charest, J. L., Condeelis, J. S., Gertler, F. B., Kamm, R. D. Three-dimensional microfluidic model for tumor cell intravasation and endothelial barrier function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (34), 13515-13520 (2012).
  18. Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv. Drug Deliv. Rev. , (2015).
  19. Dawson, T. H. Scaling laws for capillary vessels of mammals at rest and in exercise. Proc. R. Soc. Long. [Biol.]. 270 (1516), 755-763 (2003).
  20. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Appl. Phys. B. 81 (8), 1015-1047 (2005).
  21. Sarig-Nadir, O., Livnat, N., Zajdman, R., Shoham, S., Seliktar, D. Laser Photoablation of Guidance Microchannels into Hydrogels Directs Cell Growth in Three Dimensions. Biophys. J. 96 (11), 4743-4752 (2009).
  22. Three-dimensional guidance of DRG neurite outgrowth using multi-photon photo-ablation. Livnat, N., Sarig-Nadir, O., Seliktar, D., Shoham, S. 2009 4th International IEEE/EMBS Conference on Neural Engineering, , 116-119 (2009).
  23. Applegate, M. B., Coburn, J., et al. Laser-based three-dimensional multiscale micropatterning of biocompatible hydrogels for customized tissue engineering scaffolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (39), 12052-12057 (2015).
  24. Ilina, O., Bakker, G. J., Vasaturo, A., Hoffman, R. M., Friedl, P. Two-photon laser-generated microtracks in 3D collagen lattices: principles of MMP-dependent and -independent collective cancer cell invasion. PB. 8 (2), (2011).
  25. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J. Pharm. Sci. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  26. Choe, Y., Mayerich, D., et al. Specimen Preparation, Imaging, and Analysis Protocols for Knife-edge Scanning Microscopy. JoVE. (58), (2011).
  27. Mayerich, D., Kwon, J., Sung, C., Abbott, L., Keyser, J., Choe, Y. Fast macro-scale transmission imaging of microvascular networks using KESM. Biomed. Opt. Express. 2 (10), 2888-2896 (2011).
  28. Chung, J. R., Sung, C., et al. Multiscale Exploration of Mouse Brain Microstructures Using the Knife-Edge Scanning Microscope Brain Atlas. Front. Neuroinform. 5, (2011).
  29. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  30. Shukla, A., Slater, J. H., Culver, J. C., Dickinson, M. E., West, J. L. Biomimetic Surface Patterning Promotes Mesenchymal Stem Cell Differentiation. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2015).
  31. Slater, J. H., Culver, J. C., et al. Recapitulation and Modulation of the Cellular Architecture of a User-Chosen Cell of Interest Using Cell-Derived, Biomimetic Patterning. ACS Nano. 9 (6), 6128-6138 (2015).
  32. Slater, J. H., West, J. L. Fabrication of Multifaceted, Micropatterned Surfaces and Image-Guided Patterning Using Laser Scanning Lithography. Methods Cell Biol. 119, 193-217 (2014).
  33. DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration. J. Control. Release. 109 (1-3), 139-148 (2005).
  34. DeForest, C. A., Anseth, K. S. Cytocompatible click-based hydrogels with dynamically-tunable properties through orthogonal photoconjugation and photocleavage reactions. Nat. Chem. 3 (12), 925-931 (2011).
  35. Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. Photodegradable Hydrogels for Dynamic Tuning of Physical and Chemical Properties. Science. 324 (5923), 59-63 (2009).
  36. Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Dyamenahalli, K. U., Anseth, K. S. Controlled two-photon photodegradation of PEG hydrogels to study and manipulate subcellular interactions on soft materials. Soft Matter. 6 (20), 5100-5108 (2010).

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