Method Article

単一細胞レベルでのキャビテーション気泡（複数可） - 細胞相互作用し、得られた生体効果を調査するための表面パターニングとマイクロ流体システム

DOI:

10.3791/55106

⸱

January 10th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Mechanical Engineering and Materials Science, Duke University, 2Huacells Corp

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

マイクロ流体チップを作製し、タンデムバブル生成用の金ドットと、その近くのシングルセルパターニング用のフィブロネクチン被覆島を生成しました。得られた流れ場は、粒子画像速度測定によって特徴付けられ、細胞膜ポレーション、膜変形、細胞内カルシウム応答など、さまざまな生体効果の研究に使用されました。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本稿では、まず、正確にタンデム気泡と明確に定義された位置及び形状に近いパターニング個々の細胞の発生を制御する同一のガラス基板上の金のドットとフィブロネクチンで被覆された領域と、マイクロ流体チップの製造手順を説明します。我々は、数マイクロ秒の時間遅延を有する金のドットの組を照射する2つのパルスレーザを使用して、タンデム気泡の発生を示します。我々は、高速撮像により気泡バブル相互作用とジェットの形成を視覚化し、粒子画像速度測定（PIV）を用いて得られた流れ場を特徴付けます。最後に、我々は、巨大分子の取り込み、添付のインテグリン結合ビーズの変位によって決まる局所的な膜の変形、及びレシオメトリックイメージングからの細胞内カルシウム応答を有する細胞膜の穿孔を含む、単一細胞分析のために、この技術のいくつかのアプリケーションを提示します。我々の結果は、高速かつ指向吐出流量がプロであることを示し近接して増殖させた細胞の表面上に高度に局在化せん断応力を課すことができるタンデムバブル相互作用によって生さ。また、別の生体効果タンデム気泡セルからスタンドオフ距離を調整することにより、吐出流の強さを変化させることにより誘導することができます。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞異質は、遺伝子、タンパク質、および代謝物の確率論的表現から生じる、大きな細胞集団内に存在し、細胞の適応と進化の1を可能にするために、生物学において基本的な原理として機能することを認識が高まっています。したがって、個々の細胞との相互作用の機能を理解するために集団ベースのバルク測定を使用することは、しばしば不正確で信頼できません。単一細胞分析のための新しい技術を開発することは、したがって、生物学的および薬理学的研究に高い関心のある、より良い幹細胞生物学および癌療法2-4の主要なシグナル伝達経路およびプロセスを理解するために、例えば、使用することができます。近年では、マイクロ流体プラットフォームの出現は大幅に位置付け、処理、および個々の細胞からの応答の観測は、新規の分析戦略5を用いて行われてきた単一細胞分析を、容易にしました。

キャビテーションは、高強度で癌の治療を含む生物医学的用途の多様な範囲の中で重要な役割は、衝撃波砕石術（SWL）7、薬物または遺伝子送達によって、腎臓結石の非侵襲的なフラグメンテーションを超音波（HIFU）6を集中果たしていますソノポレーション8、および流体力学的バブルキャビテーション9,10によって、細胞または組織の最近報告された破壊によって。それにもかかわらず、キャビテーション気泡（複数可）の動的プロ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.微細加工

注：すべての微細加工の手順は、クリーンルーム内で行われています。クロムマスクは、前の微細加工に設計図2を参照します。

figure-protocol-1
図2：マイクロ流体チップ内のチャネル設計と作業単位の寸法の概略図。 a）は、マスク整列PDMSマイクロチャネル（緑）のデザインとガラス基板（青と赤）上のパターン。作業ユニット・アレイの代表セクションのマスクデザインのb）の拡大画像。セルパターン（青）及び金のドットの組（赤）を示すつの作業単位のc）の概略。すべての長さスケールは、右下に表示されます。 LARを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のGERバージョン。

  1. 金ドットパターニング

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業に記載のマイクロ流体プラットフォームは、バブルバブルの相互作用を調査すると、単一細胞レベルでのキャビテーションによって誘発される生体効果の多様を分析するために使用することができます。ここで、我々は我々の実験システムで実行することができる実験研究とバイオアッセイの多様性を実証するためにいくつかの例を提示します。まずジェット形成、得られた流れ場の可視化、およびジェット速度（ 図5a）の計算と並行気泡の一時的な相互作用を例示します。私たちは、タンデムバブルによって誘発される局所的な細胞膜の変形（ 図5b）、PI取り込み（ 図5c）とのピンポイントの膜ポレーション、および細胞内カルシウム応答（ 図5d）の後、現在の例ではなります。このような細胞の生存及びアポトーシスアッセイなどの他の例は、文献22に見出すことができます。

図5aは、高速.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

単一細胞分析は、生細胞イメージングとの組み合わせで、非常にこのような表現型の発達、免疫応答23のような個々の細胞でしばしば動的変数プロセスの我々の理解を高めています。皿またはフラスコ中で通常の細胞培養とは対照的に、マイクロ流体システムは、リアルタイムで、ダウン単一細胞レベルに、微小環境の正確な制御を可能にします。したがって、マイクロ流体技術の進歩及び技術は、主に、単一細胞分析のスループットおよび再現性を改善しています。ソフトリソグラフィ及び表面パターンを統合することにより、マイクロ流体システムは、さらに、時空間的に可変の刺激の複雑なパターンへの単一の細胞の応答の詳細な分析を容易にするように設計することができます。例えば、一過性の化学的または機械的な手がかりが正常にそれらの生物学的または機械的な応答が自動的に記録しながら、単一の細胞に送達し、2を分析されています4。この一般的な傾向にもかかわらず、細胞レベルでのキャビテーションによって誘発される生体効果を分析するマイクロ流体の適用は非常に限られていました。最も顕著なのは、それだけマイクロピラー11に捕捉された懸濁液中の個々の.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

デューク大学のクリーンルーム施設SMIFの使用に感謝したいと思います。また、ジェット速度の測定に協力してくださったHao Qiang氏にも感謝します。著者らは、この研究で使用された島津製作所HPV-Xカメラを提供してくれたHadland ImagingのTodd Rumbaugh氏に感謝します。この研究は、助成金5R03EB017886-02および4R37DK052985-20を通じてNIHによって部分的に資金提供されました。

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
試薬/材料
75 mm x 38 mm プレーン顕微鏡スライドCorning2947-75X38
AcetoneSigma Aldrich, Co.320110ACS試薬、≥
イソプロピルアルコールシグマ・アルドリッチ(株)W292907≥99.7%、FCC、FG
硫酸シグマアルドリッチ株式会社320501ACS試薬、95.0-98.0%
過酸化水素Sigma Aldrich, Co.21676330 wt.% in H2O
プライマー P-20MicrochemMCC Primer 80/20
NFR フォトレジストJSRNFR016D2
PhotomaskPhotoplotstoreN/A4x4 ダイレクトライトマスク
MF-319 現像液 Shipley(Rohm and Haas)Microposit MF-319
1165 Photoresist RemoverDow Chemical, Co.DEM-100180731-メチル-2-ピロリジノン基づく
S1813フォトレジストShipley(ロームアンドハース)S1813
PLL-g-PEGSuSoSPLL(20)-g[3.5]-PEG(2)
HEPESサーモフィッシャーサイエンティフィック15630080
パラフィンフィルムHACH251764
SU-2025フォトレジストMicrochemSU-2025
PDMSダウ コーニング184 SIL ELAST KIT 0.5KG
マイクロボア チューブサンゴバン PPL Corp.S-54-HL
メタルピンニューイングランドスモールチューブNE-1300-01カットチューブ(ストレート)、0.025インチ外径 x 0.017インチID x 0.50インチLong
HeLa細胞Duke Cell Culture Facility(307-CCL-2) HeLa, p.148
DPBS (1x) bufferThermoFisher Scientific14190144
DMEM culture mediumThermoFisher Scientific11995065
Fibronectin Bovine Protein, PlasmaThermoFisher Scientific33010018
0.25% Trypsin-EDTA (1x)ThermoFisherサイエンティフィック25200056
ヨウ化プロピジウムサーモフィッシャーサイエンティフィックP21493
カルボン酸マイクロスフェア1.00 μmPolysciences, Inc08226-15
カルボン酸マイクロスフェア 2.00 μmPolysciences, Inc18327-10
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride)ThermoFisher Scientific22980
Sulfo-NHSSulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)24510
Peptite-2000Advanced BioMatrix5020-5MG
FITC Annexin VThermoFisher ScientificA13199
ふら-2、AMサーモフィッシャーサイエンティフィックF1221
DMSOSigma Aldrich, Co.D2650
F-127invitrogenP68660.2 µmろ過(水溶液10%)
還元血清培地 サーモフィッシャーサイエンティフィック11058021
名前会社カタログ番号コメント
Equipment
PlasmasherEmitechK-1050XO2/Arプラズマアッシングフォトレジスト・その他有機材料
マスクアライナーSUSS MicroTec Karl Suss MA6/BA6
Eビーム蒸発器CHA IndustriesCHA Industries Solution E-Beam
RIETrion Technology トリオンテクノロジー ファントムII(酸化物/窒化物/ポリマー)
エッチング ステレオスコープAmScopeアメリカンスコープ SM-4TZ-FRL実体顕微鏡
シリンジポンプChemyx IncNanoJet
細胞培養インキュベーターNuAireAutoFlow NU-8500 ウォータージャケット CO2 インキュベーター
生物学的安全キャビネットNuAireNU-425-400
ウォーターバスVWR1122s
遠心分離機IECセントラCL2
顕微鏡ツァイスアクシオオブザーバーZ1
Nd:YAGレーザー (レーザー1)ニューウェーブリサーチテンペスト
Nd:YAGレーザー (レーザー2)New Wave ResearchOrion
遅延発生器Berkeley Nucleonics BNC 565-8c
フラッシュランプDyna-LiteML1000 ファイバー結合フラッシュチューブ
高速カメラDRS Hadland Imacon 200
ハイスピード  カメラ島津HPV-X
ハイスピードカメラVision ResearchPhantom V7.3
PIV ソフトウェアLaVisionDaVis 7.2
カメラZeissAxioCam MRc 5
ソフトウェアZeissAxioVision
PTI システム堀場製作所 S/N:1705 RAM-X
EasyRatioソフトウェア堀場製作所Easy Ratio Pro 2version 2.3.125.86
63回; 客観的ZeissLD Plan Neofluar
99.5% 製作所

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, D., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
  2. Weaver, W. M., et al. Advances in high-throughput single-cell microtechnologies. Curr Opin Biotechnol. 25, 114-123 (2014).
  3. Gossett,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microfluidic SystemSurface PatterningCavitation BubbleTandem BubblesSingle Cell AnalysisHigh Speed ImagingParticle Image VelocimetryCell Membrane PorationIntracellular Calcium ResponseGold Dot Patterning

Related Articles