方法論記事

異種非含有条件下での3次元培養における治療間葉系幹/間質細胞の生産と管理（MSC）スフェロイドプライム

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DOI：

10.3791/55126

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2017年3月18日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mary Hardin-Baylor, 2Department of Pediatrics, University of Texas Medical Branch, 3Multi-Organ Support Technology Task Area, U.S. Army Institute of Surgical Research, 4Internal Medicine, Texas A&M University Health Science Center

この記事について

サマリー

間葉系幹細胞/間質細胞(MSC)の治療可能性は十分に文書化されていますが、患者のために細胞を準備する最善の方法は依然として議論の余地があります。ここでは、実験的および臨床的な応用のために、ゼノフリー条件下でプライミングされたMSCの治療用球状凝集体または「スフェロイド」を効率的に生成および投与するためのプロトコルを伝達します。

要約

間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）は、生体工学や再生医療に大きな約束を保持します。 MSCは組織培養プラスチックへの強い付着を介して複数の成体組織から単離し、次いで、さらに最も一般的にウシ胎児血清（FBS）を使用して、 インビトロで増殖することができます。 FBSは、MSCは、免疫原性になる可能性がありますので、MSC培養物におけるその存在は、細胞の臨床的および実験的なアプリケーションの両方を制限します。したがって、MSC培養のために化学的に定義された異種非含有（XF）メディアを用いた研究は非常に価値があります。 MSCの多くの有益な効果は、主に腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（TSG6）及びプロスタグランジンE2（PGE2）などの免疫調節因子の分泌を介して、炎症及び免疫を調節するそれらの能力に起因しています。しかし、MSCは、これらの要因を生成するために活性化を必要とMSCの効果は、多くの場合、一過性であるため、大きな関心は、事前活性化細胞PRIOの方法を発見するために浮上していますそれらの使用rは、このように生体内での活性化のためのタイムラグを解消します。ここでは、3次元（3D）培養液で効率的に活性化するためのプロトコルやプライムMSCを提示します 化学的に定義されたXFの条件下で生体内でのこれらの予め活性化MSCを投与します。具体的には、まずXF培地を用いて球状MSCマイクロ組織または懸滴の「スフェロイド 'を生成し、球及び馴化培地（CM）は、様々な用途のために収穫することができる方法を示すための方法を説明します。第二に、我々は、遺伝子発現の画面を説明し、 インビトロでの機能アッセイは、迅速に細胞の抗炎症性及び抗癌の可能性を強調し、スフェロイドにおけるMSCの活性化のレベルを評価します。第三に、我々は、in vivo効力試験のためのマウス腹腔内にそのままMSCスフェロイドを注入する新規な方法を説明します。全体的に、プロトコルは、本明細書中で化学的に定義されたXF詐欺の下で予め活性化MSCを取得する主要な課題を克服しますditionsとは、治療のためのMSCスフェロイドを管理するための柔軟なシステムを提供します。

概要

間葉系幹細胞/ストローマ細胞（MSC）は、様々な再生医療のアプローチのための大きな可能性を示しています。 MSCは、最初は、骨髄の間質成分として単離したが、以降、脂肪組織1、2、3を含む多数の他の成体組織から得られました。興味深いことに、メイン単離方法は、ウシ胎児血清（FBS）の存在下で組織培養プラスチックにしっかりと付着するMSCの顕著な特性を包含する。この伝統的な分離技術は、2次元（2D）培養中のMSCの簡単かつ急速な拡大を可能にする一方で、それはまた、非常に人工的であり、重要な細胞特性4の潜在的な損失につながるネイティブ3次元（3D）環境の重要性を無視し、5 、6。したがって、3次元培養におけるMSCの研究では、どの従来の2D培養液より生理的であり、MSCの特性を「減少/失われた」の検索で浮上しています。また、大きな関心は、異種非含有（XFに）MSC培養および活性化のための化学的に定義された条件を特定し、ひいては臨床応用のための細胞がより容易にするために上昇しています。

多くの研究は、生体材料に、球状凝集体またはスフェロイドとして両方のMSCの3D培養を実証公開されています。 MSCのスフェロイド培養物は、前臨床または臨床試験における治療のための細胞の投与後の生体内での MSCの挙動を理解する方法として見られたのに対し、生体材料中のMSCは、最初に、細胞を播種した足場で損傷した組織を置き換えるために組織工学的アプローチのために設計されました4、5、7。興味深いことに、MSCのフォームスフェロイドは自発的に組織培養プラスチックへの付着は認められていないとき8、9、10。伝統的に、細胞凝集は、スピナーフラスコ法または液体オーバーレイ技術、腫瘍微小環境を模倣しようとする努力において、癌生物学において最初に使用される方法によって容易にしました。より最近では、追加の方法は、細胞へのプラスチック接着4、5、6を防止するために特定の化学薬品で予めコーティングした培養皿に細胞凝集を示すこと浮上しています。 MSCスフェロイドを生成するための最も単純で経済的な方法の一つは、多くの場合、胚性幹細胞から胚様体を生成するために使用された技術、懸滴培養それらです。ドロップ培養技術をぶら下げて、組織培養プラスチックへの細胞接着は、組織培養皿の蓋の下側に媒体の液滴で細胞を懸濁させ、重力が細胞aggregを促進させることによって防止されますドロップの頂点でエーション。スフェロイドの大きさを容易に制御することがハンギングドロップ培養は、特に容易にする、細胞濃度または滴体積を変えることによって操作することができます。

MSCの3D培養に関する初期の研究では、対応する2D 6、8、9と比較して、3Dでの細胞の特性のラジカル違いを実証しました。同時に、レポートは、 インビボでのMSCの有益な効果は、微小環境の合図によって活性化され、反応して、抗炎症性および免疫調節11因子生成するためになる能力に頼っていることを実証しました。興味深いことに、そのようなプロスタグランジンE2（PGE2）などのこれらの因子の多くは、腫瘍壊死因子刺激遺伝子6（TSG6）、および肝細胞増殖因子（HGF）のための道を開く従来の2DのMSCよりMSCスフェロイドによってはるかに大量に生産されましたのアイデア細胞8、12、13を活性化するために、3D培養物を使用して。また、3次元培養における遺伝子活性化は、マウス12への注入後に少なくとも部分的に、細胞活性化の、メカニズムを再現するように見えました。 インビボでの伝統的なMSCの効果は、多くの場合、遅延、過渡、および「ヒットして実行」と記載することができるされているように、実験での使用の前にMSCを活性化することによって、細胞の効果を延長し、より目立つことができます。過去数年の間に、MSCスフェロイドを用いて重要な機能的研究は、これらが炎症反応を抑制し、そのようなスフェロイドをプライミングしたMSC 2の魅力的な形を作る、マクロファージ、樹状細胞、好中球、およびT細胞などのエフェクター細胞に影響を与えることによって、in vivoで免疫を調節することができることが実証されています、3。また、intなどの抗癌分子の産生erleukin-24（IL-24）および腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（TRAIL）は、MSCを単層にMSCの相対的な3次元培養で標的癌治療8、10、14のために利用することができる現象が増加します。

組織培養プラスチックの使用だけでなく、FBSのみならず、必要な従来のMSC培養物として、臨床使用のためにMSCのスフェロイドをより容易にする別のハードルを克服しなければなりませんでした。この障害に取り組むために、我々は最近、特定の下MSCスフェロイドの形成は、化学的にXFの条件を定義し、得られたMSCのスフェロイドをFBS 14との条件で生成されたスフェロイドのような抗炎症同じと抗癌分子を生成するために活性化されたことが確立さを示しました。ここでは、これらの知見は、XFを使用して3D培養物で予め活性化MSCの生成を実証するいくつかの詳細なプロトコールに提示されていますメディア。また、プロトコルは共にマウスに完全な球状体を送達するための実用的な方法で、それらの抗炎症性、免疫調節性及び抗癌効果に関しては、MSCの活性化レベルを評価するための効果的な方法を説明し、その提示されています。

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プロトコル

1. MSCの単離と拡大

  1. 調製および成体幹細胞の分布（のためのセンターからの早期継代MSCを得るhttp://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ）15などの冷凍バイアル。また、冷凍バイアルなどの日常のプロトコル14およびストア次の骨髄吸引からMSCを分離します。
  2. 15から20パーセントのプレミアムを補充した最小必須培地アルファ（αMEM）はFBS、2mM L-グルタミン、および1×ペニシリン - ストレプトマイシンを選択している完全培地（CCM）を、準備します。濾過により培地を滅菌します。
  3. 150 mmの細胞培養皿にCCMを30mlを入れ、5％CO 2を含む加湿インキュベーター中で37℃で30分間皿をインキュベートします。
  4. 37℃の水浴中で2分間、約10 6 MSCを含む凍結バイアルをインキュベートします。
  5. 5 mlの血清学的ピペットを用いて培養皿にバイアルの内容物を移し、残存する細胞を捕捉するために皿中1〜mLのCCMでバイアルを数回洗浄します。適切なインキュベーターに皿一晩置きます。
  6. 注意深く室温のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で2回培養を洗浄し、予め温めておいた0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液3mlでMSCを取り外します。支隊は通常インキュベーターで約3〜4分かかります。
  7. 37℃に予熱した6 mlのCCMと皿にトリプシンを中和し、50mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移します。細胞収率を最大化するためにPBSの洗浄液と組み合わせます。
  8. 室温で10分間、細胞（450×gで）を遠心分離し、上清を吸引します。
  9. CCMの小容量で細胞を再懸濁し、血球計およびトリパンブルーを用いて生細胞を数えます。
  10. 100細胞/ cm 2で150 mmディッシュの適切な数をシード暖かいCCMの30ミリリットルで、約70から80までパーセントのコンフルエントになるまで培養をインキュベート、通常は7日。
  11. トリプシン/ EDTAを用いて上記のように細胞を採取し、適切な培地で単一の円錐チューブにすべてのセルを結合します。遠心分離機は、再び細胞数に対して同じ少量の培地に細胞を再懸濁します。標準CCM（FBS含有）またはXF中1（XFM-1）とし、ヒト血清アルブミン（HSA、13せずに両方のXF培地-2（XFM-2）と呼ばれる、ここで、種々の市販のXFメディア製剤を使用mg / mlで）補足。

XFの条件の下で3-Dハンギングドロップ培養における活性化MSCスフェロイドの作製

  1. 、約25,000細胞のスフェロイドを生成する714個の細胞でCCM、XFM-1、XFM-1 + HSA（13 mg / mlで）、XFM-2、またはXFM-2 + HSA（13 mg / mlで）に収穫したMSCを希釈するために、 /μlの。
  2. 上への細胞のピペット35μL/滴培養皿の蓋を反転さ150ミリメートルの下。複数の液滴は容易にマルチチャンネルピペットを使用してピペットできます。
    注：より大きな又はより小さな球状体が望まれる場合、適切に細胞濃度または滴体積（25-45μl）を変更します。
  3. 皿のベースに室温PBSの20ミリリットルを転送し、1の連続と安定した動きでドロップ頂点が下を向くようにすることを、滴を含む、蓋を反転。培養皿の底に慎重に蓋を置きます。
  4. 適切な球のアセンブリを可能にするために、それを乱すことなく3日間インキュベーターに皿を転送します。
  5. 72時間後、慎重に蓋を除去し、液滴が、再び、上向きになるように、それを反転させて回転楕円体の収穫を開始。
  6. 角度は約10から20°に蓋とは、セルリフターを用いてプレートの端に、スフェロイドを含む、液滴を押してください。
  7. 1,000μlの管を15mLのコニカルチューブ中球と媒体を移送TTE。プレートを洗浄し、スフェロイドの最大の回復を確実にするために、室温PBSと同じチップを用いてピペットを使用してください。
  8. リアルタイムPCRアッセイ（プロトコル3）のために、室温で5分間、450×gで球体懸濁液を遠心分離し、上清を吸引します。 PBSでスフェロイドを洗浄し、両方の遠心分離および吸引の手順を繰り返します。動物（プロトコル8）への送達のために、球は、遠心分離することなく、チューブ（〜3-4分）の底に定着することができます。

抗炎症及び抗癌マーカーの3リアルタイムPCR

  1. PBSで洗浄し、遠心分離した単層のMSC（プロトコル1）とMSCスフェロイド（プロトコル2）からのDNAフリーのトータルRNAを単離するために、ホモジナイザー列を持つRNA抽出キットおよびRNaseフリーのDNaseセットを使用してください。
  2. βメルカプトエタノールを含むRLT緩衝液（1：100）で溶解別々の15ミリリットルの各条件から少なくとも10万の単層MSCおよび20スフェロイドコニカルチューブ。
  3. トランス1.5ミリリットルRNaseフリーのチューブに完全に混合溶解物をFERと回転楕円体の溶解を助けるために、冷凍庫（-80℃）のために少なくとも3時間に配置します。
  4. 、氷上で細胞溶解物を解凍簡単にボルテックスし、市販の哺乳動物の全RNA単離キットを用いてRNAを単離するための製造元の指示に従ってください。
  5. 定量化し、分光光度計を使用して単離されたRNAの品質を評価します。
  6. リアルタイムPCRのためのcDNAを生成するための製造元の指示に従って大容量のcDNA逆転写キットまたは同等のものを使用してください。
  7. 氷上でcDNAサンプル、商業的に設計されたリアルタイムPCRプライマー/プローブ（遺伝子発現アッセイ）、およびPCRマスターミックスを置きます。 GAPDH（対照）、PTGS2（COX-2、抗炎症）のためのプライマー/プローブを使用して、TNFAIP6（抗炎症TSG6）、TRAIL（抗癌）、およびIL-24（抗癌）。
  8. 遺伝子発現アッセイおよび高速Univeための製造元の指示に従って、リアルタイムPCR反応を準備RSALマスターミックス。
  9. 実験の文書を生成し、実行を実行するためのリアルタイムPCR機器のためのガイドラインに従ってください。
  10. ベースライン8、14などの内因性制御と単層のMSCとしてGAPDHを用いた遺伝子発現の相対的変化（相対量、RQ）を計算することにより、ΔΔCT法を使用してデータを分析します。

4.免疫調節のアッセイのためのCMの収集と抗がんの可能性

  1. しかし、セルリフターやピペットを用いて、15ミリリットルコニカルチューブに上記のように、これはCMを希釈しますようにPBSで皿の蓋を洗っていない、スフェロイドとCMを収穫。
  2. 慎重にピペットで無細胞上清を収集し、室温で5分間、450×gで遠心分離し、1.5 mlチューブに上清を移します。
  3. 慎重にCLを収集し、室温で5〜10分間万×gで遠心分離ピペットでCMをarified、および（-80°C）の冷凍庫での保存のための新しい1.5 mlチューブにCMを移します。複数のアッセイのためにそれを使用する際に凍結前にCMのアリコートを準備します。
    注：前下流アッセイを行うために、PGE2濃度は、CMの抗炎症能力の良好な指標は、製造業者の指示に従って市販のELISAキットを用いて決定することができます。 TSG6濃度は、公表されたプロトコル14を使用して決定することができます。

5.マクロファージアッセイは、MSC-CMの抗炎症の可能性を評価します

  1. L-アラニル-L-グルタミンを含有FBS及び1×ペニシリン - ストレプトマイシンを選択し、10％のプレミアムを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）から成るマクロファージ媒体を準備します。フィルター滅菌培地を。
  2. 約10 6 J774マウスマクロファージの凍結バイアルを入手し、37℃の水浴中で2分間バイアルをインキュベートします。
    3. マクロファージ媒体、及び200から300×gで、室温で5分間遠心分離機の9ミリリットルを追加し、15ミリリットルコニカルチューブにバイアルの内容を転送します。
  3. 吸引した上清は、マクロファージ培地1mlにマクロファージを中断し、マクロファージ培地30mlを含む150ミリメートルのペトリ皿にマクロファージを移します。
  4. 2日ごとに培地を変更して、約70から80パーセントのコンフルエントになるまでインキュベーター中で細胞をインキュベートします。
    注：マクロファージは、このように培地交換で細胞を紛失しないよう注意が払われるべきである、シャーレに強固に付着しません。
  5. ピペットで細胞上にマクロファージ媒体を噴霧することにより、マクロファージを収穫。 200〜300×gで、室温で5分間、50mLのコニカルチューブと遠心分離機に細胞を移します。
  6. 上清を吸引除去し、血球計で細胞数のためのマクロファージ少量の培地に細胞を懸濁。マクロファージ私と一緒に200,000細胞/ mlに濃度を調整しますdium。
  7. マクロファージアッセイ用にセットアップを開始するには、12ウェルプレートのウェルにマクロファージ培地480μlを添加します。
  8. 非刺激対照ウェルにマクロファージ培地20μlを添加して、20μlの非馴化または培地をMSC馴化、実験ウェルに、上記で調製しました。プレートを叩いてウェル中の培地を混ぜます。
  9. 非刺激マクロファージ対照ウェルにマクロファージ細胞懸濁液の500μlのを転送します。
  10. 0.1ミリグラムの1,000 / mlのリポポリサッカライド（LPS）、室温で5〜10分間インキュベートする：500-1：1を加えて残りのマクロファージを刺激します。
  11. エアコン非またはMSC馴化培地でウェルに刺激されたマクロファージの500μlのを転送します。着実にプレートを数回揺動によってウェルを混ぜます。
  12. 16-18時間インキュベーターにプレートを転送します。
  13. 室温で5分間、500×gでマクロファージ馴化培地と遠心分離機を収穫。
  14. 転送製造業者の指示に従って市販のELISAキットによる腫瘍壊死因子-α（TNF-α）およびインターロイキン10（IL-10）は、コンテンツのための新しいチューブアッセイに上清。

スフェロイド-CMの免疫調節可能性を評価するための6脾細胞アッセイ

  1. 10％熱不活化FBS、1×ペニシリン - ストレプトマイシン、及び2-メルカプトエタノールを補充したローズウェルパーク記念研究所（RPMI）-1640培地で構成されて完全な脾細胞培地を準備します。フィルター滅菌培地を。
  2. 脾臓の上腹部の左側に用意切開部を介して安楽死させ、雄のBALB / cマウスから収穫脾臓、約前面の中間に脚14を後肢。脾臓細胞14を分離するために70μmのセルストレーナーに脾臓を転送します。
  3. 滅菌シャーレusinに70μmのストレーナーを通して脾臓を押すことにより、脾臓細胞/リンパ球を単離します2〜3ミリリットルシリンジ14からプランジャのグラム柔らかいゴム/プラスチック終わり。脾臓を解離するために研削円運動を使用してください。
  4. 冷PBSで細胞ストレーナーを数回洗浄し、50mlコニカルチューブにペトリ皿から細胞を移します。 10分間4℃で冷PBSと遠心分離（500×gで）でチューブを埋めます。
  5. 上清を吸引し、5〜10 mlをインキュベートすることによって赤血球から5〜10分間（脾臓あたり）赤血球溶解液を細胞をオフにします。
  6. 500×gで5〜10分間、4℃でチューブと遠心分離機に冷PBSを加えることによって、溶解を停止します。
  7. 完全脾細胞培地中で単離された細胞を一時停止し、40μmのストレーナーで濾過し、血球計数器を用いて細胞数を計測します。 10 6細胞/ mlの最終細胞濃度を達成するために、細胞懸濁液に脾細胞培地を追加
    注：この方法は、典型的にはマウスの脾臓あたり約3×10 7脾細胞が得られます。
  8. 5分間の2μg/ mlの抗CD3e抗体で脾細胞の適切な数を刺激します。
    注：必要な脾細胞の量は、（ステップ6.9を参照）治験責任医師によって決定されるような実験条件の数によって異なります。すべての実験サンプルのために/だけでなく、10 6脾臓細胞が必要とされています。
  9. 転送10 6脾細胞（刺激または非刺激）1の最終希釈でウェルに12ウェルプレートのウェルに非馴化（コントロール）を追加したり、MSC-CM：10-1：20。
  10. 室温で5分間、500×gで24時間遠心分離後の脾細胞のCMを収穫。
  11. 製造業者の説明書に従って市販のELISAキットにより、インターフェロンγ（IFN-γ）のコンテンツを新しいチューブおよびアッセイに上清を移します。

スフェロイド-CMの抗癌の可能性を評価する7.前立腺癌アッセイ

  1. 10を補充したRPMI-1640培地で完全RPMI増殖培地を準備％FBS、1×ペニシリン - ストレプトマイシン。
  2. LNCaP前立腺癌細胞の凍結バイアルを得て、37℃の水浴中で2分間バイアルをインキュベートします。
  3. 電動式ピペッターと5ミリリットル血清学的ピペットを用いて完全RPMI増殖培地の30ミリリットルを含む培養皿にバイアルの内容を転送します。皿から培地でバイアルを数回洗浄し、インキュベーターに皿を置きます。
  4. 細胞がコンフルエントに達する直前に、室温PBSで2回文化を洗い、予め温めておいた0.25％トリプシン/ EDTA溶液3mlでLNCaP細胞を切り離します。
  5. 完全RPMI増殖培地で皿でトリプシンを中和し、50mlコニカルチューブ内に洗浄液とともに細胞を移します。
  6. 室温で10分間、450×gで細胞を遠心分離し、上清を吸引します。
  7. 完全RPMI増殖培地の小さなボリュームに細胞を再懸濁し、血球計数器を用いてがん細胞をカウントします。
  8. はエアコン非またはスフェロイド-CMの25％を含有する完全RPMI増殖培地120μlの中に5,000細胞/ウェルで96ウェル皿にLNCaP細胞を転送します。 72時間インキュベーターでインキュベートします。
  9. 細胞増殖アッセイキットを用いて細胞増殖アッセイを行うために、ウェルから培地を吸引し、少なくとも3時間、冷凍庫（-80℃）中にプレートを移します。
    1. プレートを解凍し、180ミリモルのNaCl、1mMのEDTA、および0.2 mg / mlでのRNase Aを含有する細胞溶解試薬100μlを加えることにより、各ウェル中の細胞を溶解
    2. 標準曲線のために、LNCaP細胞の溶解既知量の上記のように。
    3. 1時間後、1を含む1×細胞溶解緩衝液100μlを追加：細胞増殖アッセイ試薬100希釈し、細胞量を決定するために、各ウェルの蛍光を測定します。

無傷スフェロイドの8腹腔内送達

  1. （プロトコル2）を再懸濁さt上記のように回転楕円体のMSCを準備彼は、XFの条件を維持するために、0.2〜0.5％HSAを補充した滅菌ハンクス平衡塩溶液（HBSS）中球。溶液中のHSAは、注入中にプラスチックに球付着を防止するのに役立ちます。
  2. 15ミリリットルコニカルチューブに40から120スフェロイドを移し、チューブに6ミリリットルHBSS / HSAを追加することによって、細胞を洗浄。球が下降するための3-4分を許可します。各動物のスフェロイドの独立したコニカルチューブを準備します。また、必要に応じて（下記の8.19を参照）追加の回転楕円体の保持を決定するアッセイのためのスフェロイドのチューブ（以下8.18を参照）、転写後の治療因子の産生を準備します。
  3. 、上清を吸引除去し、無菌のHBSS 100-200μlのスフェロイドをオーバーレイは0.2から0.5パーセントHSAを補充し、チューブを氷上に置きます。
  4. 簡潔には、誘導チャンバ内の約2分のピンチつま先の反射が消失するまで、100％酸素中2％イソフルランで動物を麻酔。
  5. BSL-2キャビネット、背ASPEの内側に動物を配置しますノーズコーンを介して1.5％イソフルラン/酸素混合物の連続的な流れで、（腹側を上に）ダウンCT。
  6. 防腐剤のような70％アルコールで下のマウスの腹部をきれいにしてください。
  7. 20 Gの静脈内（IV）カテーテルのキャップを外し、カテーテル小剣アセンブリと腹腔内注射を行います。注入を行うために、マウスの皮膚と別のものを保持するために片手を使用してください。正中線に向かって指して、針の先端に屈曲し、膝関節や陰部を結ぶ人工ラインのほぼ中央に注入点を見つけます。
    注：カテーテルスチレットアセンブリは、通常の針よりも高い抵抗を有し、そのためのケアは、内臓への損傷につながる可能性がある、あまりにも深い腹部に針を注入しないように注意しなければなりません。皮膚の浸透そしてその後、筋肉/腹膜カテーテル留置中に感じることができます。
  8. 静かにカテーテルスチレットアセンブリから金属スティレット/針を取り除きます。 CHEC血液、尿や糞のための小剣をkおよびそれを捨てます。針に血液が内部器官（複数可）の穿刺を示しています。
  9. 流体の流れを可能にするために、注射時の直立位置にあるプラスチック製のカテーテルを保持します。
  10. 100-200μlの先端にピペットを用いて、カテーテルを通して滅菌HBSS / HSAの約100μLを注入することによって、プラスチック製のカテーテルの適切な配置を確認してください。気密シールを形成するカテーテルシリンジアダプタ内部のピペットチップの先端を置きます。ゆっくりと腹腔内の流体を注入します。
    注：適切に配置カテーテル内の流体が自由にカテーテルのわずかな調整で腹膜腔の内側に流れます。不適切なカテーテルの留置（皮下または内腸、または針の先端は、腎臓などの腹膜臓器を負傷した場合）は、抵抗を増加し、流れを減少します。皮下配置は、皮膚の下に明らかな「バブル」の形成をもたらすであろう。
  11. トンを収集彼は、200μlのピペットチップを使用して、HBSS / HSAの100から200μlを（ステップ8.3）で調製したスフェロイドを、MSC、および上記のようにカテーテルを介して腹腔内に球体（40〜120球）のボリューム全体を転送します。
  12. 任意の残留スフェロイドを収集し、腹腔内にそれらを注入するために、上記と同じチップを用いてHBSS / HSA100μlので球を含むチューブを洗浄します。
  13. （オプション）は、カテーテルを洗浄するために腹腔内にHBSS / HSAの追加の100μLを注入します。
  14. カテーテルの上に消毒に浸したガーゼパッドを置き、ゆっくりと腹腔からカテーテルを除去し、それを捨てます。
  15. ゆっくりスフェロイドの均一な分布を確実にするために、指で腹膜腔をマッサージ。
  16. 動物は厳重な管理の下で回復し、注射部位からの出血のために見てみましょう。
  17. 残りのスフェロイドのためのカテーテルと15ミリリットルチューブを点検します。のいくつかの球を観察するようにするのが普通ですカテーテル/チューブ。
    注：MSCスフェロイドの送達のために記載された技術は、正常動物または損傷モデルの様々な使用のために採用することができます。この技術は、正常マウス角膜損傷及び内毒素血症モデルにおける、ならびにザイモサン誘発性腹膜炎モデル8にスフェロイドを注入するために使用されています。
  18. （オプション）保持スフェロイドの数を定量化するために、DNAベースの細胞数の定量キット/試薬を使用しています。 15ミリリットルチューブの上に使用されるカテーテルを保持し、激しくバック15ミリリットルチューブに残っている球を強制するためにカテーテルを介してHBSS / HSAを分配します。
    1. 遠心分離を室温で5分間、500×gで15mlチューブ、上清を吸引します。冷凍庫（-80℃）のために少なくとも3時間に回転楕円体のペレットを含むチューブを転送します。
    2. チューブを解凍し、180ミリモルのNaCl、1mMのEDTA、および0.2 mg / mlでのRNase Aを含有する細胞溶解試薬を500μlを添加することにより球体を溶解
    3. 制御、FREのため上記のように（単一注射用に調製スフェロイドの数に好ましく相当）スフェロイドの既知量をエズと溶解。
    4. キットからの細胞増殖アッセイ試薬の1:50希釈液を含有する1×細胞溶解緩衝液100μlを1時間後に、96ウェルマイクロプレートに、二重に、細胞溶解物の100μlのを転送し、各ウェルに加えます。 10分後、対照試料との実験試料（複数可）を比較することにより、注入されなかった球の数を決定するために、各ウェルの蛍光を測定します。
  19. 転送球によって産生されるPGE2とTSG6の濃度を測定することにより、注射（オプション）のために準備スフェロイドの活性化レベルを評価します。移送2％FBS及び1×ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した1または2ミリリットルαMEM含む12ウェルまたは6ウェルプレートに、上記のようにカテーテルを通して40~120球、。 6時間インキュベーターでプレートを置きます。
    1. からメディアを転送井戸1.5または15ミリリットルのチューブに6時間後、室温で5分間、450×gでチューブを遠心します。
    2. 室温で5〜10分間万×gでピペットと遠心分離機を使用して、新しい1.5 mlチューブに、無細胞上清を移します。
    3. 製造元の指示に従って市販のELISAキットを使用して、PGE2濃度（CMの抗炎症の可能性の良い指標）のための新しい1.5 mlチューブ、アッセイに明らかにしたCM（上清）を転送します。 TSG6濃度は、公表されたプロトコル14を使用して決定することができます。

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結果

現在の研究では、ハンギングドロップ培養は、コンパクトな球状のミクロ組織またはXF条件下で活性化されたMSCの「スフェロイド」を生成するために使用しました。 図1の治験ロードマップは、MSCは、スフェロイド、またはCMが球由来の治療因子を装填した後、自己集合72時間懸滴中に懸濁させたときにスフェロイドにに奨励されていることを示して、収集され、潜在的の両方で利用することができます研究と臨床応用。球産生のために必要とされる多数のセルは、1cm 2当たり100〜200セル、典型的には、低密度でMSCを播種することにより、一週間以内に取得し、その後約80％コンフルエント（ 図2になるまで6-7日間、細胞を増殖することができ）。細胞増殖動態は、日々の生存細胞を計数することによって決定さ、堅牢な拡大期（日3-7）1-2日の短い誘導期（ 図2Cを<以下のことが示されました/強いです>）。継代2または3のMSCは、典型的には、CCMで培養百万凍結保存細胞の...

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ディスカッション

いくつかの研究及び臨床用途に使用するための最適なMSCは非常に彼らの利益を最大化するために活性化され、好ましくは例えばFBS等の異種培地成分からの潜在的な抗原の送達を最小限にするために、化学的に定義されたXF条件下で調製されるべきです。ここに記載されたプロトコルでは、1の方法を示している）2）3）、それらの抗に関しては回転楕円体のMSCの活性化レベルを評価し、XF条件下でのMSCの3D活性化を達成するため、スフェロイドを形成することによって、3D培養におけるMSCを活性化します炎症、免疫調節、および抗がんの可能性、および4）マウスに、完全なスフェロイドなどの活性化MSCを提供します。

MSCは、骨髄および脂肪組織を含む多数の成体組織からプラスチック接着によって単離することができる多能性幹細胞です。 MSCは容易に表面マーカーの異なる組を表す、比較的高い（10~20％）FBS濃度の下で組織培養プラスチック上で増殖され、そして脂肪生成、骨形成、および軟骨形成系譜

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、国立衛生研究所からの助成金P40RR17447とテキサス州癌予防研究所からの賞RP150637によって部分的に資金提供されました。このプロジェクトへのご支援をいただいたDarwin J. Prockop博士に感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
MEM-α(最小限の必須ミディアムアルファ)ThermoFisher/Gibco12561049; 12561056;MSC成長培地(CCM)
FBS(ウシ胎児血清)、プレミアムセレクトAtlanta BiologicalsS11595の調製のための最小限の必須培地12561072。S11510;S11550;S11595-24全種類の細胞用完全培養培地の成分
L-グルタミンThermoFisher/Gibco25030081; 25030149; 25030164種類の細胞用の完全培養培地の成分
ペニシリン/ストレプトマイシンThermoFisher/Gibco15070063全タイプの細胞用完全培養培地の成分
滅菌フィルターユニット、0.22 & マイクロ;m PESメンブレンMilliporeSigmaSCGPU01RE;SCGPU02RE;SCGPU05RE;SCGPU10RE;SCGPU11RE培地滅菌
150 mm 細胞培養ディッシュNuncD8554 SIGMA細胞培養
Thermo Forma water-jacketed CO2加湿インキュベーターThermo FisherModel 3110培養細胞のインキュベーション
早期継代MCSs成体幹細胞の調製と分配のためのセンター テキサスA&M Health Science Center College of Medicine スコット&再生医療研究所MSCの2Dおよび3D培養の白色NA調製 MSCウォーター
バスVWR89501-468温培地 37°C;C
ピペットエッペンドルフ492000904手動リキッドハンドリング
ピペットエイドドラモンド サイエンティカンパニー 4-000-300ハンドリング セレオロジーピペット
Costar 滅菌血清ピペット (5、10、25、50 ml)コーニング4487; 4101; 4251; 4490リキッドハンドリング
PBS (リン酸緩衝生理食塩水), pH 7.4ThermoFisher/Gibco10010023; 10010072;10010031;10010049細胞培養処理
0.25%トリプシン/EDTA溶液ThermoFisher/Gibco25200056; 25200072; 25200114接着細胞の持ち上げと細胞凝集体の分散
15 ml コニカルチューブCorning/BD Falcon352097細胞遠心分離
50 ml コニカルチューブCorning/BD Falcon352098細胞遠心分離機
Eppendor 冷蔵遠心分離機Eppendorf/Fisher ScientificModel 5810R細胞遠心
血球計算盤Fisher Scientific26716細胞計数
トリパンブルーSigma-AldrichT8154 血球計算計での細胞計数中の SIGMA 死細胞排除
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1)ThermoFisher/GibcoA1067501ヒト間葉系幹細胞の増殖と拡大のために特別に配合されたゼノフリー培地
定義されたゼノフリーMSC培地-2(XFM-2)幹細胞技術5420ヒト間葉系幹細胞
HSA(ヒト血清アルブミン)ジェミニ800-120ゼノフリーMSC培地
の成分 rHSA(組換えヒト血清アルブミン)Sigma-AldrichA9731 ゼノフリーMSC培地のSIGMAコンポーネント
トータルRNA単離ミニキットQiagen74104トータルRNA抽出
QiashredderQiagen79654トータルRNA抽出前のサンプル均質化
RNAseフリーDNaseセット Qiagen79254全RNA抽出中のオンカラムDNA除去
β-メルカプトエタノール シグマ・アルドリッチM6250 RLTバッファー中のRNAsesのALDRICH阻害
VortexVWR97043-562ミキシングサンプル
分光光度計BioradNARNAの濃度と品質
大容量cDNA逆転写キットサーモフィッシャー/アプライドバイオシステム全RNAのcDNAへの転写4368814
遺伝子発現アッセイサーモフィッシャー/アプライドバイオシステムリアルタイムPCR用のプライマー/プローブの組み合わせを変化
高速ユニバーサルPCRマスターミックスThermoFisher/Applied Biosystems4352042; 4364103; 4366073; 4367846リアルタイムPCR反応用マスターミックス
リアルタイムPCRシステム (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System)ABI PrizmNAリアルタイムPCR
1.5 ml 遠心分離管Eppendorf22364111細胞の遠心分離、サンプル収集および保存
(-80 °C) 冷凍庫サーモフィッシャーモデル サーモフォーマ 8695サンプル保存
PGE2 (プロスタグランジン E2) ELISA キットR&D系KGE004B試料
DMEM(Dulbecco'ThermoFisher/Gibco10566-016; 10566-024;10566-032マクロファージ培地
J774 マウスマクロファージATCCTIB-67マウスマクロファージ細胞株
12ウェルプレートCorning3513in vitro マクロファージ刺激
LPS(リポ多糖)Sigma-aldrichL4130in vitro マクロファージ刺激
マウス TNF-a ELISA キットR&D SystemsMTA00Bカイン濃度の推定
D SystemsM1000Bサンプル中のサイトカイン濃度の推定
RPMI-1640 培地ThermoFisher/Gibco11875-085脾細胞培養培地
BALB/c マウスジャクソン研究所651in vivo スフェロイド送達; 脾臓細胞の調製
抗マウス CD3e 機能グレード 精製eBioscience145-2C11in vitro脾細胞刺激
70 μmストレーナー Corning352350脾細胞調製
赤血球溶解液 (1x)Affymetrix eBioscience00-4333脾臓細胞単離中の赤血球の除去
マウス IFN-γ(インターフェロンガンマ)ELISAキットR&D SystemsMIF 00中のサイトカイン濃度の推定
 ATCCCRL-1740細胞株に対する 3D MSC の効果の研究 in vitro
>DNA ベースの細胞増殖アッセイキットThermoFisherC7026DNA 含有量に基づく細胞数測定
NaClSigma-AldrichS5150溶解試薬
の成分 EDTA (エチレンジアミン四酢酸)ThermoFisherFERR1021カルシウムキレート剤、DNAの測定のための溶解試薬
Rnase AQiagen19101RNA分解
フィルターベースのマルチモードマイクロプレートリーダーBMGテクノロジーNAマイクロプレートアッセイ(ELISA、細胞定量、など)
HBSS(ハンクス平衡塩溶液)、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッドを含まないThermoFisher/Gibco14175079in vivo注射前のMSCスフェロイドの蘇生
イソフルランMWI獣医in vivo注射のための麻酔502017
酸素、圧縮ガスPraxairNAイソフルランで使用するため
サーモフォーマ BSL-2キャビネットサーモフィッシャーモデル1385滅菌細胞培養
安全性I.V.カテーテル/ニードルスティレット、 20 G、1インチテルモSR*FNP2025内へのシュペロイドの送達
滅菌マイクロピペットチップエッペンドルフは液体/細胞の取り扱い
すべての加フィック ズ させます サンプルマウスIL-10(インターロイキン10)ELISAキットR&のサイトによるサンプルLNCaP前立腺癌細胞 がんの成分 供給 腹腔が異なります

参考文献

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