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方法論記事

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル

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DOI:

10.3791/55128

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2016年12月1日

 ,  ,  , 
1Center for Metabolic and Degenerative Diseases, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine, Programs in Human and Molecular Genetics and Neuroscience, The Graduate School of Biomedical Sciences at Houston, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Department of Natural Sciences, University of Houston - Downtown, 3Department of Neurobiology and Anatomy, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

この記事について

サマリー

大人ショウジョウバエの脳は神経回路、高次脳機能、および複雑な疾患を研究するための貴重なシステムです。小さなハエの頭から全脳組織を分析するための効率的な方法は、脳ベースの研究を促進します。ここでは、よく保存された形態を有する成人の脳の簡単な、ワンステップ解剖プロトコルを記述します。

要約

、人間の脳変性疾患をモデル化し、成人の脳における神経回路網をマップし、高次脳機能の分子・細胞基盤を研究するためにショウジョウバエを使用することに関心が高まっています。よく保存された形態を有する成人の脳の全体のマウントの準備は、全脳ベースの研究のために重要であるが、技術的に困難と時間がかかることがあります。その後の処理工程を容易にするために、身体の残りの部分に結合して、無傷の脳を維持しながら、このプロトコルは、10秒未満で大人のフライヘッドの簡単に学ぶ、ワンステップ解剖のアプローチを説明します。手順は、通常、後撮像工程を妨害する可能性が脳に関連した目や気管組織の大部分を除去するのに役立ちますし、また解剖鉗子の品質にあまり需要を配置します。さらに、我々は、Bの両面を撮像するために重要であるカバーガラス上に取り付けられた脳試料の便利な反転を可能にする簡単な方法を説明します同様の信号強度と品質の雨。プロトコルの例として、我々はWTの大人の脳でドーパミン作動性（DA）ニューロンの分析を提示（1118ワット ）飛びます。解剖法の高い有効性は、 ショウジョウバエの大規模な成人の脳ベースの研究のために特に有用です。

概要

一般的にミバエとして知られているモデル生物ショウジョウバエは 、長い間そのエレガントな遺伝子ツール、短い生殖回、および高度に保存された分子および細胞経路のために評価されています。ミバエが正常に基本的なシグナル伝達経路、多細胞生物のパターン形成メカニズムだけでなく、神経発達のメカニズム、機能、および疾患1,2を分析するために採用されています。細胞標識およびイメージング技術の最近の進歩により、ショウジョウバエの脳は、神経回路の微細なマッピングで、そのような学習と記憶、および概日リズム1,3などの高次脳機能の分子および細胞基盤を解剖に特に強力になっています4,5,6,7,8。

ショウジョウバエシステムの1つの特定の利点は、通常の化合物または共焦点顕微鏡を使用して脳の全マウント調製および検査を可能にする、その比較的小さいサイズです。ティsの機能は、このように研究対象の全体像と全体内でのその正確なジオメトリの両方を提供し、全脳組織との関連で、細胞および細胞下レベルで、神経回路、または単一ニューロンの詳細な解剖学的および機能解析を可能にします脳。しかし、脳のかなり小型のサイズを考えると、それはまた、効率的な大人のハエで保護外骨格ヘッドケースのうち、無傷の脳組織を解剖における技術的な課題を提示しています。種々の効果的で比較的単純な切開方法は、通常、適切な脳9のヘッドケースの除去および目を含む関連した組織、気管、及び脂肪、10慎重伴い、段階的れ、詳細に記載されている。これらの顕微解剖法多くの場合、簡単に破損することができ、微細よく整列ヒントを鉗子に頼って、切開鉗子の品質にかなり厳しい要求を配置します。また、解剖脳は、多くの場合、separatあるとして体の他の部分から編、脳は簡単に、それらの小さなサイズと処理バッファでの透明性のその後の染色および洗浄プロセスの間に失われることがあります。ここでは、胴体に取り付けられた解剖頭脳を保ち、成人の脳のために、比較的単純かつ容易に習得できるワンステップ解剖プロトコルを記述します。解剖のプロセスは、多くの場合、簡単にそのような目や気管などの脳関連組織のほとんどを離れてクリアし、良質の解剖鉗子の需要が減少します。

蛍光化合物の顕微鏡や共焦点顕微鏡下で脳を撮像する場合に加え、離れ蛍光光源からである脳の側は、しばしば、ホールマウント脳の厚さに弱い信号の少ない鮮明な画像を生成します。ここで、我々はまた、同様の信号intensiと脳の両側の好都合なイメージングを可能にする、脳試料を容易に反転することができ、簡単な取付方法を説明しますTYと品質。

概念実証の成人の脳を研究するために、この方法の適用については、我々はさらに1118ハエワットの脳におけるDAニューロンの存在を調べました。多くの場合、多くのショウジョウバエの研究で、トランスジェニックハエおよび野生型コントロールを生成するための親株として使用されている遺伝子型。

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プロトコル

脳解剖と免疫染色に使用1.ソリューション

  1. 119のNaCl、26.2ミリモルのNaHCO 3、2.5のKCl、1 mMののNaH 2 PO 4、1.3のMgCl 2、および10 mMグルコース：大人は、人工脳脊髄液（aCSFの）で脳を飛ぶ解剖。使用前に、10、5％CO 2/95％O 2とのガスaCSFの- 2.5 mMのCaCl 2を15分とスパイク。 0.22μmのメンブレンフィルターを通して濾過することによりaCSFの溶液を滅菌します。
    注：ストアaCSFの4℃での細菌汚染を防止します。解剖した脳の最終的な結像品質上の2つの解剖ソリューションの影響の詳細な比較が行われていないが、フライ脳はまた、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液中で切開することができます。
  2. 通常、等分し、-20℃で保存されている固定液として1×PBSで調製した4％パラホルムアルデヒド（PFA）を使用します。
    CautioN：PFAは、有毒で腐食性であり、取り扱いに注意を要します。
  3. 解剖脳の免疫蛍光染色の際に、脳から、最後の洗浄工程の後にPFAをすすぐために1×PBSを使用してください。 10×PBS原液（1.37 MのNaCl、27mMのKClを、100 mMののNa 2 HPO 4、及び18mMのKH 2 PO 4）から1×PBSを準備します。
  4. 解剖脳の免疫蛍光染色の際に後続のすべての洗浄工程のための1×PBS（1×PBT）で0.3％のTween-20を使用してください。

大人のフライヘッズの2顕微解剖

注：解剖手順は図1に示されています。

  1. CO 2と大人のハエを麻酔。 5秒 - 鉗子を使用して、フライと簡単にピックアップ3を70％エタノールに浸漬することによって、そのキューティクルを脱蝋。これはaCSFのか、1X PBS郭清溶液に浸漬したときに気泡がフライキューティクルに付着しないことが保証されます。
  2. 下手でブロックされることはありません角度で光源と顕微鏡を解剖、フライ（1.2X倍率）のクリアな視界を達成するために、対物レンズを設定します。動物を固定し、 図1（a）に示すように 、その腹部は、上向きと冷たい解剖溶液にフライを浸漬する非優位の手で鉗子を使用してください。
  3. （ 図1Aの矢印で示される）フライの腹部に小さな力を発揮しながら、解剖板に対する170°の角度- 160で鉗子を保管してください。このステップは、ハエを固定化し、15によって後方にヘッドを移動するためにそれを強制します - 25°上向きに口吻を拡張しながら。プロセスでは、キューティクルの柔らかく、半透明の領域は、口吻の下に、明らかになるはずです。倍率を増やして、この領域に焦点面を調整します。
    注：あまりにもしっかりと鉗子を保持するが、安定化させるのに十分ではなく、単にしっかりしないでくださいフライ。あまりにも多くの力は内部の臓器が溶液中に破裂する原因となります。
  4. 持ち手からの圧力が解放されたとき、鉗子が開いて春になりますように、鉗子の先端に軽度の抵抗力が生成されます、その先端が閉じているように、解剖鉗子を押すように利き手を使用してください。 図1（b）に示すように 、フライを保持鉗子に対して垂直に鉗子を配置します。
    1. ピアース図1Bの赤い矢印で示すように口吻の下キューティクルの柔らかく、半透明領域を介して切開鉗子の閉じた先端、。あまりにも深く、それが脳に触れることを鉗子に浸透しないことが重要です。適切な脳が見えるようになるはずです。非支配手でハエの安定的な把握を維持します。
  5. 迅速にしかし着実、トンを離れて引き裂くために、独自の力で解剖鉗子の先端を解放し、このリリースの勢いに依存しています彼は外骨格フライヘッドを囲みます。適切な無傷の脳は解放鉗子先端（ 図1Cに示す外側に赤い矢印として示す）の勢いを導くために仮想線に従ってください（すぐに図1Cの一番下の鉗子の先端上記白組織）見えるようになるはずです。これは、静かに外骨格を削除し、脳から脳が関係している眼と気管のほとんどになります。適切なタイミングと力が外骨格は、研究者の経験に依存することになる開くために適用されます。
    注：これは、解剖時に最も重要なステップです。露出した脳を残すことは体の他の部分に付着したままながら、外骨格を削除するには、鉗子口の勢いから生成された天然の力に頼ることが重要です。
  6. 慎重にそのような白い繊維構造として表示され、気管などの残骸付属組織を除去するために、利き手でピンセットを使用しremainingが脳に取り付けられています。適切な脳を引っ張ったり、傷つけないように注意してください。

脳の3免疫蛍光染色

  1. 60分 - 40のための4％PFAの約1 mL中にそれらの関連torsosと解剖脳サンプルを修正しました。
    注：この、その後の手順については、適切に溶液中の試料を混合するニューテーター上のサンプルを用いて、チューブまたはプレートを保ちます。
  2. ソリューションをピペットで3回上下1×PBS 1mLですすいでください。離れて脳を吸引しないように注意してください。
  3. 5分ごとに1×PBTで5回洗浄します。インキュベーションの間にニューテーター上のサンプルを保管してください。
  4. 適切な希釈Oで/ N 4℃で一次抗体とインキュベートします。
  5. 翌日、一次抗体を除去し、1×PBTでサンプルを5回洗浄します。各洗浄の間に1×PBT溶液に10分 - 5のためのサンプルを残します。インキュベーションの間にニューテーター上のサンプルを保管してください。
  6. 洗浄をインキュベート提案した希釈およびインキュベーション時間と適切な二次抗体中のサンプル。
  7. 各洗浄の間に10分間のインキュベーションで1×PBTでサンプルを6回洗浄します。
    このステップでは、試料から非特異的に結合した二次抗体を除去するために重要です。
  8. 30分間、1×PBT溶液中の1mg / mlの4 '、6'-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）の10,000希釈：1でインキュベートします。 DAPIがDNAのAT領域に結合し、脳の全体的な形態を明らかにするために使用することができるDNA色素です。
  9. 1×PBSで3回洗浄します。
  10. 転送解剖皿にサンプル、および鉗子を使用して解剖皿の中の体から脳を分離します。
  11. 染色および洗浄工程の後、両者の間にカバースリップで脳をマウントし、マウントスライドの上にカバースリップを配置。脳の両側が同様の信号強度を用いて画像化することができるように、このように、脳試料を容易に反転することができます。
    注：代わりに直接取り付けスライド上のカバースリップ上で脳をマウントすると、自由に、サンプルの向きの反転を可能にします。実装プロセスは、以下でより詳細に説明します。
    1. マウントスライドの上に18×18ミリメートルカバースリップを置きます。ブレード付きピペットチップの開口部を広げ、18×18ミリメートルのカバーガラス上に1×PBS溶液中で脳を転送するためにそれを使用。
    2. 抗フェードマウンティング培地の40μL（0.2％（99.5中w / v）のn-プロピル没食子酸 - 別の20を、カバースリップの中央に脳を置き、微細ピペットチップで脳の周りの液体を除去し、その後追加脳％以上のACSグレードのグリセロール）。
      注：追加された封入剤の量を調べた脳の数によって異なります。
    3. 外側に粘性マウンティング培地をずらしながら優しく頭を広げ。それはと接触するまで、第1片側からスライドを下げることによって、脳の上に第18のx 18ミリメートルのカバーガラスを配置取付スリップの表面は、その後ゆっくりと気泡と脳との接触を最小限にするために反対側を下げます。
      注意：マウンティング培地と脳の体積が2カバースリップを分離するのに十分なスペースを提供しなければならないように、2つのカバースリップの間にスペーサーを使用する必要はありません。
    4. スライドが落ち着くことを可能にします。実験室の組織とスリップの側面から出てくる過剰な液体を除去します。
    5. 輸送中に取り付けスライドから脱落取り付けられた頭脳を持つカバースリップを防止するために、取り付けスライドにカバースリップを添付し、テープの小片を使用します。
      注：脳をスライドの間に取り付けられたスライドを密閉するために、任意のシーラントを使用することなく、蛍光シグナルの有意な損失なしにすぐに画像形成された、または最大1週間4℃で保存することができます。染色された脳の長期保存のために、2スリップの側はwを封止することができますi番目のマニキュアとステンド脳は時間をかけてそれらの信号を失うかもしれませんが、-20℃の冷凍庫に保存されています。これは推奨されません。
  12. 画像に脳を適切な化合物の蛍光顕微鏡や共焦点顕微鏡を使用してください。
    1. まず、客観的に近い脳の側から画像を取得してから、慎重に真ん中に挟まれたサンプルを持ってカバースリップを反転。このステップは、同じ脳の反対側の画像を取得促進します。
    2. ペア前方内側側（PAM）クラスター領域におけるこのようなDAニューロンなどの脳の画像より小さな領域、（例に脳全体（ 図2の例）と対物レンズ40倍の画像に直立化合物の蛍光顕微鏡および20X対物レンズを使用してください図3で）。

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結果

上記のように図1は 、成人の脳の解剖のための主な手順を示している2、3 3日齢のWTの代表画像です（遺伝子型：1118ワット ） の数値 。大人は、チロシンヒドロキシラーゼ（THに対する抗体で共染色した脳を、飛びます、 図2の赤で着色し、 図3）の白、マーカーは、一般的に、すべての分化したニューロンのためのすべての細胞核とELAVタンパク質に対する抗体、マーカーを標識するためにDNA色素DAPIに加えて、DAニューロン11を標識するために使用します一緒に脳の全体的な構造を明らかにした（緑色に着色）フライ、インチ

1で200希釈およびラット抗ELAV抗体： 図2

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ディスカッション

人間の脳疾患、神経回路、および高次脳機能を研究するために大人ショウジョウバエの脳を使用して、関心の高まりと、大のために特に重要であるホールマウント分析し、無傷ハエの脳を得るために、簡単かつ迅速な方法を開発する必要があります脳ベースの画面を拡大縮小。我々の方法は、主に、関連組織からクリアされるよく保存形態で（多くの場合、経験を持つ10秒未満で）フライ頭を解剖するためのシンプルで簡単に学ぶアプローチを提供します。解剖脳がまだフライ体の残りの部分に結合されているように、彼らは通常、すぐに試料管の底に沈むと洗浄および染色工程の間に認識し、収集するのは簡単です。これは、大幅に小さな物理的な大きさの脳サンプルを処理する際に顕著な問題になる可能性があり、サンプルの損失を最小限に抑えることができます。この問題は、大規模な研究のために特に重要であることができます。脳は簡単に本体から取り外すことができます染色工程が終了した後、取り付け前。

解剖時には、正確にフライを配置フライヘッドから外骨格を削除するときに、適切な角度を維持し、穏やかに各ステップを実行する際に適切な力を発揮することが...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは、プロジェクトへの巨大なサポートのために氏のENEメフメットさん、キアラ・アンドラーデ、さんピラール・ロドリゲス、クリス・クォック、およびさんダンナガーフィルを認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
w*; パーク&デルタ;21/TM3, P{GAL4-Kr.C}DC2, P{UAS-GFP.S65T}DC10, Sb1Bloomington Drosophila Stock Center51652Balancer was switched to TM6B
PBac{WH}parkf01950Exelixis at Harvard Medical Schoolf01950Balancer was switched to TM6C
NaClFisher ScientificS640-500
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) フィッシャーサイエンティフィ02-003-990
塩化カリウム (KCl)フィッシャーサイエンティフィックBP366-500
リン酸ナトリウム、一塩基性一水和物 (NaHCO<サブ>3)フィッシャーサイエンティフィ02-004-198
塩化マグネシウム (MgCl<サブ>2)フィッシャーサイエンティフィック02-003-265
D-ソルビトールシグマ-アルドリッチS1876-500Gは、グルコース
カルシウム二水和物(CaCl2)Sigma-AldrichC5670-500G
EMDミリポアを置き換えます デュラポアPVDFメンブレンフィルター:親水性:0.22&マイクロ;m 細孔径フィッシャー・サイエンティフィGVWP14250
ホルマリン溶液、10% (組織学的)フィッシャー・サイエンティフィSF98-20
リン酸カリウム、二塩基性、粉末、超高純度バイオ試薬フィッシャー・サイエンティフィ02-003-823
Tween-20フィッシャー・サイエンティフィBP337-500
エクセルタ 精密ピンセット17-456-055プロトコルは、非常に細かい点を必要としない。
抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体Pel-Freez BiologicalsP40101
Rat-Elav-7E8A10 anti-elavThe Developmental Studies Hybridoma BankClone 7E8A10
ヤギ抗ラットIgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor 647 コンジュゲートThermoFisher ScientificA-21247
ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体, Alexa Fluor 594 コンジュゲートThermoFisherScientificA-11037
DAPI溶液(1 mg / mL)ThermoFisher Scientific62248
食子酸プロピル粉末Sigma-AldrichP3130-100G
グリセロールACS試薬、≥99.5%Sigma-AldrichG7893-500ML
Zeiss Axioimager Z1ZeissQuote
Zeiss Apotome.2ZeissQuote
Zen lite softwareQuote
ック ック 塩化ック ック ック ック 没

参考文献

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