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Summary

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Abstract

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

Introduction

適応応答は、細菌の生存のために重要です。検出し、環境変化に対応するためには、細菌は、二成分情報伝達として知られている刺激応答システムを使用しています。典型的な2成分系では^1,2は 、ヒスチジンキナーゼは、同族の刺激を検出し、その保存されたヒスチジン残基を自己リン酸化し、その後、応答調節タンパク質のレシーバ・ドメインに保存されたアスパラギン残基にリン酸を転送します。 ³このイベントは、下流の効果を刺激するレスポンスレギュレーターの活性の変化を誘発します。 ^{4,5したがって} 、細菌は、センスおよびローカル環境の変化に適応することができます。いくつかの二成分シグナリングシステムは、この原型から逸脱します。いくつかのケースでは、ヒスチジンキナーゼの感覚ドメインに直接感覚入力を検出し、タンパク質 – タンパク質相互作用を介してキナーゼ活性を修飾するスタンドアロンのタンパク質です。しかし^8、ファンド^{– 6}amentalプロセスおよびシステムの全体的な役割は変わりません。二成分シグナル伝達は、細菌の生存に必須であるユビキタス刺激応答システムであって、ヒスチジンキナーゼは、シグナルの伝達に重要な役割を果たしています。 ⁹

細菌の生物学へのヒスチジンキナーゼの重要性にもかかわらず、彼らは特徴付けが乏しいまま。これは、ホスホの固有の不安定性、および自己リン酸化を測定するための実用的な方法が不足しているためです。ホスホはホスホセリン、ホスホスレオニン、およびホスホチロシンよりも不安定です。 ^10はこのように、一般にセリン/スレオニン/ Tyrのキナーゼを分析するために使用されている技術は、ヒスチジンキナーゼには適用されません。ヒスチジンキナーゼを研究するためのインビトロアッセイにおいて ^、11は、主^に SDS-PAGEオートラジオグラフィーに限られていました。 ^12,13この方法では^、[γ-32 P] -ATPをキナーゼとインキュベートし、キナーゼのリン酸化がPOLによって分析されますyacrylamideゲル電気泳動（PAGE）は、ゲルのオートラジオグラフィーを行いました。この方法は、キナーゼの自己リン酸化、ならびにキナーゼからの応答レギュレーターのリン酸転移をモニターするために使用することができます。しかし、この方法では、顕著な欠点があります。ページベースのアッセイは、ロースループットおよび時間がかかります。このような制限は、タンパク質を特徴付けるし、その動態パラメータを確認に資するではありません。最近公開されたヒスチジンキナーゼを研究するための別の方法は、自己リン酸化を検出するためにホスホ抗体を利用します。 ¹⁴この方法は、検出のために使用した測定方法に応じて、1-ホスホおよび3-ホスホとを区別するという利点を有しているが、この方法は、大きなダイナミックレンジまたは検出の高い上限を提供しない場合があります。したがって、これらの重要なタンパク質を研究するために使用することができるより速く、より少ない労力であり、より高感度のアッセイが必要とされています。

ここでは、説明すると、dインビトロでの精製の細菌ヒスチジンキナーゼの自己リン酸化を定量化するために使用することができる慎重に開発され、ニトロセルロース結合アッセイをemonstrate。このアッセイは、より高いスループットおよびPAGEベースのアッセイよりも時間がかかります。この方法はまた、検出と大きなダイナミックレンジの高い上限を提供していますホスホ定量化のためのチェレンコフ放射を利用します。アッセイは、ヒスチジンキナーゼの動力学的パラメーターを決定するために用いることができます。

Protocol

注意：このプロトコルは、放射性物質の使用および取り扱いに適切なトレーニングを必要とします。ベータ放射線遮蔽を含め、このアッセイを行う際に必要な個人用保護具を使用してください。廃棄物の大量の実験の洗浄段階中に生成される放射性廃棄物は、慎重に取り扱わなければなりません。廃棄物は、このような簡単に倒したりこぼしされることはありません大きなバケツや瓶などの直立コンテナに格納されていることを確認してください。実験が終了したら、慎重に適切に放射性廃棄物容器をマークしするすべての廃液を転送します。注意してすべての材料を処理し、汚染のワークスペースを監視するために近くのガイガーカウンターを保持します。 注：このプロトコルは、私たちのグループから、以前に報告されたアッセイの改訂版です。 H 3 PO 4で15ホスホ安定性は、この方法を使用する前に、任意の特徴付けられていないヒスチジンキナーゼのためにテストする必要があります。ホスホST機能試験は、以前に記載されています。 15キナーゼが含まれている必要があります含まれていないネガティブコントロール。これは、各サンプルからのバックグラウンド信号を減算し、[γ-32 P] -ATPを十分膜から洗浄されることを確実にするために必要です。 試薬および材料の作製このアッセイを使用する前に、細菌培養物からヒスチジンキナーゼを精製します。 このアッセイの開発のための腸炎ビブリオ （EB101、ATCC 17802）からヒスチジンキナーゼ（遺伝子ID 1189383）を精製します。 NdeIおよびXhoI制限部位を用いて発現ベクターpET-23aHis-TEVにキナーゼのクローンを作成し、Vp1876のD499Aを構築変異体を生成する部位特異的変異誘発を実施しています。 大腸菌 BL21（DE3）pLysS中にプラスミドを形質転換し、37℃でTB培地中で細胞を成長させます。アンピシリン（100μg/ mL）とクロラムフェニコール（34μg/ mL）で補足文化、そして攪拌しながら成長しますOD 0.6の600（250回転）。 25μMの最終濃度までIPTGでタンパク質発現を誘導し、そして16℃で一晩培養物を成長させます。細胞の残骸（18000 XG）を除去するために遠心分離（5,000×gで）、超音波処理により溶解し、遠心分離により細胞を回収します。 Ni-NTAアガロースを用いて、His標識キナーゼを精製します。 SDS-PAGEにより純度を確認します。各タンパク質について精製を最適化し、このアッセイを使用する前に純度を確認。 25mMのH 3 PO 4の洗浄溶液を準備します。蒸留脱イオン水1Lに、25mMの最終濃度までH 3 PO 4を加えます。この溶液のpHは約2.0です。氷上で25mMのH 3 PO 4を配置します 。 キナーゼ反応を停止するために使用される325 mMのH 3 PO 4、の13Xストック溶液を調製します。この溶液のpHは約1.5です。氷の上に325 mMのH 3 PO 4を配置します 。 注：H 3 PO 4 </sub> 25 mMの最終濃度で十分に反応をクエンチし、また、ニトロセルロース膜に結合するヒスチジンに結合していない放射標識リン酸塩を遮断するのに役立ちます。 160 mMトリス塩酸pH8.0の、600のKCl、16mMのMgCl 2を、40％グリセロールを含む4×反応緩衝原液を準備します。 確立されたタンパク質濃度法（ブラッドフォード、UV可視、 等 ）によってヒスチジンキナーゼの濃度を定量します。 16,17 4倍の所望の最終濃度である濃度のヒスチジンキナーゼ溶液を調製します。十分な信号を得るためには、反応中の最終タンパク質濃度は、理想的には少なくとも5μMでなければなりません。 実験のための非標識比：適切な4倍の非標識ATPの濃度と標識と4倍の放射性標識[γ-32 P] -ATP溶液を調製します。 注：このミックスに含まれるべきである[γ-32 P] -ATPの量はどのくらいに依存しています[^7; – 32 P] -ATPは、最終的に各反応のためにスポットされます。反応あたり5μCiの – 私たちは、0.1の間の範囲の最終濃度で十分な信号を取得しています。非標識ATP比与えられた実験における全ての反応のために一定に保つこと：標識をすることが重要です。すべての濃度全体の非標識ATP比を一定：複数のATP濃度が所望されるとき、これがよく、標識を保つように連続希釈液を、なされるべきです。最終ATP濃度は、典型的には10μM、少なくとも1 mMの範囲、そして各濃度を信頼性のある運動データを取得するために三連でアッセイされるべきです。 96ウェルドットブロット装置ニトロセルロース膜（孔径0.2μm）の8センチメートル×12センチの部分をカットします。 膜は、装置が密封され、全てのウェルが完全に膜で覆われるように収まることを保証し、ドットブロット装置における位置ニトロ、。正しく組み立てられた場合、真空APPLとき、空気の漏れがあってはなりませんIED。 ろ液を収集するには、二次側アームフラスコに装置を接続します。バルブステムから、装置が快適二フラスコを傾けずに使用することができるように、適切なチューブを接続します。 アスピレーター/真空源に二次サイドアームフラスコを接続します。 装置が完全に装置に真空を適用することにより、密閉されていることをテストします。装置が正しく組み立てられている場合は、強い真空がすべてのウェル中に存在するであろう。すべての配管接続は、密封を確実にするためにパラフィルムやサランラップでラップすることができます。 必要に応じて、1つのウェルに、真空、反応バッファーのピペット100μLをテストします。真空がよく通って、膜上にすべての液体を引き出すのに十分強くなければなりません。 全てのサンプルがメンブレン上にスポットする準備が整うまで、真空をオフにします。 2.反応の開始と消光反応成分の混合前のinitiへエーション、4倍のストック溶液として4つのすべての反応成分の準備：反応バッファー（1.4節を参照）、ヒスチジンキナーゼ（1.5）、[γ-32 P] -ATP（1.6）、およびのddH 2 Oを反応緩衝液、ヒスチジンキナーゼ、およびのddH 2 Oを等量混ぜ、これらの反応成分は、短時間（10分）、室温で平衡状態にします。 注：最終反応容積は、実験は、時間依存性、酵素依存性、または基質依存性であるかどうかに依存しています。複数のアリコートを同じ反応から採取し、所望の時点で急冷されているように、時間依存の反応は、大きくなければなりません。反応容量は、所望の時点の数に依存します。アッセイは、反応の30μLを含有するニトロセルロース膜上の各スポットのために最適化されています。 10時間のポイントが必要な場合このように、反応容量が少なくとも300μLでなければなりません（高いボリュームは、次のような330μLは、任意のピペット操作エラーが発生した場合に好ましいであろう）。酵素と基質に依存する実験は、小さい反応容量を必要とします。このニトロセルロース膜上にスポットされ、最終的な体積であるように、これらの実験のための反応容量は、30μLのように小さくすることができます。 反応を開始するために、反応の[γ-32 P] -ATP液の1ボリュームを追加し、ピペッティングにより混合します。タイマーで経過反応時間を追跡し、反応が所望の時間進行させます。 、反応をクエンチ反応を氷冷325 mMのH 3 PO 4の総反応容量の1/13を追加し、ピペッティングにより混合すること。また、325 mMのH 3 PO 4への反応のアリコートを追加します。 注：H 3 PO 4の最終濃度が十分に反応を停止するために25mMのでなければなりません。例えば、30μLの反応に2.5μLの325 mMのH 3 PO 4を追加、または<30μL反応2.5μLの325 mMのH 3 POを追加サブ> 4。反応物の最終pHは約4.0です。 H 3 PO 4のこの濃度は、テストの結果、ホスホを劣化させることなく、このバッファ内のキナーゼ反応をクエンチすることが確認されています。 例えば、7.5μL[γ-32 P] -ATPとの反応を開始する7.5μL4×反応緩衝液、7.5μL4倍のヒスチジンキナーゼ、および7.5μLのddH 2 Oを混ぜます。 2.5μLの325 mMのH 3 PO 4で反応をクエンチ。 全ての反応が終了するまで、直ちに氷上で急冷反応を置きます。 注：効率を最大化するために、すべての反応が開始されるまで、および所望の反応時間が経過した後に全てが急冷されるまで、一つの反応ごとに15または20秒を開始するために、一つの反応毎に15または20秒を停止ことが望ましいです。初めてのアッセイを使用している人のために、より長い間隔がより管理することができます。 3.スポッティングoをニトロセルロース上のF急冷反応 96ウェルドットブロット装置に真空を開始します二次容器に事前に組み立てられ、96ウェルドットブロット装置（セクション1.7）を配置します。装置および膜は、使用後に放射性であるように、装置が簡単で分解するためにこのコンテナは十分大きくなければなりません。 96ウェルドットブロット装置に真空を適用します。 装置が真空下にあると、注意深く各ウェルにおけるニトロセルロース膜上に直接クエンチ反応をピペット。全ての反応は、膜上にロードされるまで繰り返します。ニトロセルロースの結合容量が（74 – 110μgの/ cm 2）を、正しくロードされたときに、ほぼ全てのキナーゼは、膜に結合すると仮定することができるスポットするヒスチジンキナーゼの量よりも大きいです。 注：使用する装置に応じて、注意がニトロセルロースを穿刺しないように注意する必要があります。反応の全てが目と接触したことを観察電子ニトロセルロース。いくつかまたは反応のすべてが順調の壁に固執し、ニトロセルロースに届かないことが容易です。 氷冷25mMのH 3 PO 4の100μLでウェルを洗浄します。これは、すべての反応の完全なロードを確保し、膜に到達するために十分に閉じ込められている可能性のある反応容積をできるようになります。ボリューム全体が膜を通って流れることを可能にします。 装置を分解し、ニトロセルロース膜に転写 慎重に真空を遮断する前に、装置を分解。装置およびニトロセルロース膜の両方が、この時点で放射性であることを助言すること。この時点で第2の容器から任意の装置構成要素を削除しないでください。 ピンセットで、慎重に約200mLの25mMの氷冷H 3 PO 4の容器に装置からニトロセルロース膜を転送します。洗浄はラディであるように、このコンテナに蓋を置きoactive。このとき、真空を遮断することができます。 4.ニトロセルロース処理ニトロセルロース洗浄ロッカー上の洗浄膜を有する容器を置きます。膜は静かに20分間揺らしすることができます。 20分後、 慎重に一時的廃棄物貯蔵のために使用される大型バケットに用いる洗浄液をデカントします。膜およびリピートに氷冷した25mMのH 3 PO 4の200ミリリットルを追加します。 注：少なくとも3 20分間の洗浄は、膜からのバックグラウンド[γ-32 P] -ATP信号を除去するために必要です。 3回目の洗浄後、ガイガーカウンターで放射線のために使用される洗浄液をテストします。上記のように無信号が洗浄溶液中に存在しなくなるまで、膜を洗浄し続けます。 ニトロセルロース乾燥膜が十分に洗浄した後、短時間空気乾燥さ膜を可能にします。これは、典型的には5分以下かかります。ストレージ蛍光スクリーンへ5.暴露注：このセクションはオプションです。蛍光面に膜を公開することは、膜上の各スポットでの放射性標識されたキナーゼの強度の可視化を可能にすることで有益です。これらのスポットの相対強度は、各スポットでのリン酸化ヒスチジンキナーゼの量に正比例します。強度は、画像処理ソフトウェアを用いて定量することができ、これらの結果はさらに、セクション7から生成されたものと比較することができ、このステップは、品質管理を可能にします。このスキャンで見られる異常はシンチレーション計数から得られた不規則な結果を説明するかもしれません。 蛍光体スクリーンの準備ストレージ蛍光スクリーンに膜を公開する前に、少なくとも5分間、白色光に蛍光面を露出させます。これは、画面によって保持することができる任意の残像が消去されることを保証します。 画面がきれいであることを確認してくださいそして、ドライ。必要に応じて、そっとスクリーンメーカーによって承認された蛍光体スクリーン洗浄液でスクリーンを清掃し、乾燥を拭きます。 ニトロセルロース膜の調製慎重に蛍光体スクリーンにダメージを与えるから残留水分を防ぐために、薄いプラスチックラップで乾燥したニトロセルロース膜を包みます。シワや気泡がないことを確認します。 蛍光体スクリーンへの暴露 、記憶蛍光体スクリーンカセットに包まれたニトロセルロース膜を配置した膜上にスクリーンフェースダウンを置き、カセットを閉じます。カセットを開けたり、露光中の膜シフトが二重または画像流れが捕捉されるようになりますように、蛍光体スクリーンをスキャンする時間になるまで、膜を移動しないでください。 限り、蛍光体スクリーンメーカーが示唆するように、少なくとも4時間露出させ、または。 露光が完了すると、蛍光スクリーンを走査し、蛍光スキャナを用いて画像をキャプチャします。 シンチレーション計数のためにニトロセルロースメンブレンの準備6. ポンソーS染色と脱色簡潔にはポンソーS染色溶液中でニトロセルロース膜浸漬（0.1％ポンソーSを（W / V）の5％酢酸中）1 – 2分。脱色の前に染色で膜全体を濡らします。 膜から過剰ポンソーSをデカント。 ヒスチジンキナーゼからのスポットのみが染色されるまでのddH 2 Oで膜を洗浄します。全てのスポットは、タンパク質の検出可能な量が含まれている場合は、この手順にのみ動作することに注意してください。 注：この手順は、キナーゼは、ニトロセルロースに結合していることを確認する必要がある、とそのタンパク質負荷があってもすべてのスポット全体です。また、斑点のキナーゼが簡単膜から切り出すことができるようになります。 スポットを切り出しますはさみを使用して、ニトロセルロース膜上の各スポットを切り出します。完全にALONを切断する必要がありませんグラム染色されたスポットの縁。膜を十分に洗浄した場合、原因を切り出しスポットの様々な大きさの背景には、無視することができるであろう。各反応のためのスポット全体をカットすることだけが重要です。 鉗子を使用して、慎重にシンチレーションバイアルに各スポットを転送します。 32 Pは、チェレンコフ放射によって容易に検出可能であるようになしシンチレーションカクテルは必要ありません。 注：別の方法として、スポットが先鋭化コルクボーラーを使用して切り出すことができます。コルクボーラーでニトロセルロースから各スポットを外し、ピンとシンチレーションバイアルに押し込みます。この方法では、膜は、さらに、放射線被曝を最小限に抑え、タッチする必要はありません。 [γ-32 P] -ATP液のCPM /ピコモルの決定 1センチメートルニトロセルロースの×1センチメートルの正方形の上に[γ-32 P] -ATP溶液（1.5節）のスポットいくつかの希釈。簡単に言えば空気乾燥。 鉗子を使用して、慎重にシンチレーションにそれぞれの正方形を転送バイアル。いいえシンチレーションカクテルは必要ありません。これらのサンプルはATP溶液のCPM / pmolのを決定するための標準曲線を作成するために使用されます。 7.シンチレーション計数シンチレーションカウンターカセットにすべてのシンチレーションバイアルをロードします。シンチレーションカウンターにカセットをロードします。 各バイアルのためのCPMを測定するためにシンチレーション計数プログラムを実行します。これらのデータは、（セクション6.3からの）放射性標識ATPミックスCPM / pmolのと共に、各スポット中に存在するリン酸化ヒスチジンキナーゼの量、及び自己リン酸化の、従って速度を計算するために使用することができます。 18,19

Representative Results

代表的なデータセットは、蛍光イメージャー（ 図1）ニトロセルロース膜を、ポンソーS染色（ 図2）、およびシンチレーション計数データ（ 図3）で撮影した画像の特徴を生成しました。 図3Aは、ラインウィーバー・バークプロット中の酵素反応速度定数を示しています。これらの結果は、グラム陰性種腸炎ビ…

Discussion

我々が説明したニトロセルロース結合アッセイは、ヒスチジンキナーゼを特徴付ける以前に使用されている方法に比べて多くの利点を有しています。従来のSDS / PAGEに基づくオートラジオグラフィーと比較して、我々の方法は、より高いスループットおよびより少ない時間がかかります。ニトロセルロース膜は、SDSゲルよりも取り扱いが容易であり、かつ固定される必要はありません。タンパ…

Materials

Phosphoric acid	VWR	AAAA18067-AP	For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base	RPI	T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride	RPI	P41000-2500.0	For kinase reaction buffer
Magnesium chloride	RPI	M24000-500.0	For kinase reaction buffer
Glycerol	RPI	G22020-4000.0	For kinase reaction buffer
5'-ATP	Promega	E6011	Kinase substrate
[&gamma;-<sup>32</sup>P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC&nbsp;	6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus	Bio-rad	1706545	For spotting reactions
Nitrocellulose	Whatman	32-10401396-PK	For spotting reactions
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	For staining nitrocellulose