この原稿は、単一細胞レベルおよび蛍光標識された神経細胞の興奮で、ニューロンの構造的接続性を記述するために子宮内エレクトロポレーション（IUE） で使用するプロトコルを提供します。組織学は、樹状突起および軸索突起を特徴付けるために使用されます。急性スライスにおける全細胞記録は、興奮性を調査するために使用されます。
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この記事について
サマリー
要約
神経系は、異なる神経細胞の種類の巨大な範囲で構成されています。これらのニューロンの亜集団は、軸索の接続の他の特徴、それらの異なる樹枝状の形態、それらの特定のパターン、およびそれらの選択的な焼成反応の間、ことを特徴とします。開発中の分化のこれらの側面を担当する分子・細胞メカニズムはまだよく理解されていません。
ここでは、標識に結合されたプロトコルを記述し、皮質ニューロンの構造的な接続性と興奮性を特徴づけます。 子宮内エレクトロポレーション（IUE）プロトコルの変更は、ニューロンのまばらな人口の標識化を可能にします。これは、順番に、個々のニューロンの樹状突起と軸索の識別と追跡、正確な軸索突起の層状場所の特性評価、および形態計測分析を可能にします。 IUEはまた、興奮性の変化を調べるために使用することができ野生型（WT）またはエレクトロポレーションの脳の急性スライスからホールセル記録とそれを組み合わせることにより、遺伝的に改変された神経細胞。これら2つの技術が構造的および機能的接続性の及び開発中に神経細胞の多様性を制御する分子機構のカップリングのより良い理解に貢献しています。これらの発生プロセスは、軸索の配線、ニューロンの機能的多様性、および認知障害の生物学上重要な意味を持ちます。
概要
樹状突起と軸索構造の開発が大脳皮質を含め、神経系における回路調節の重要な側面です。これは、多様な神経細胞亜集団の選択的な配線の間に重要な役割を果たしています。最近の報告数は、接続に加えて、神経細胞の分子多様性は、焼成の非常に特異的な様式の買収により反射され、ことが示されています。しかし、開発中に明確なニューロンのサブタイプの興奮性と接続性を決定するメカニズムだけでなく、コーディネートの程度は、まだよく、2は 1を理解されています。
生体内 loss-がと機能獲得型に特異的な遺伝子および回路の開発における彼らの影響力の発現レベルとの間の関係の研究を可能に分析します。 子宮内エレクトロポレーションでは （IUE）が広く研究するために使用される技術であり、それらの接続の全体的なパターンを研究するための特定のニューロン集団における目的の遺伝子の機能と。しかし、生きたマウスでは皮質層における軸索と樹状突起の形態学的特性を決定するために、まばらニューロンを標識することが不可欠です。 IUEと組み合わせたCre組換えシステムは、識別された皮質の薄層の個々の細胞によって放出された突起を解決するために、十分に低い密度でニューロンのまばらな集団をマークするために使用することができます。この方法は、電気穿孔脳....
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プロトコル
全ての動物手順は、（PROEX 14分の118; PROEX 15分の331）国内および欧州の法律を遵守して、マドリード動物実験委員会のコミュニティに承認されました。手順中に無菌状態を維持します。
1. 子宮内エレクトロポレーション
注：IUEためのこのプロトコルは、以前5、6、7を公表されている他のものから適合されています。本稿では、単一ニューロン8と標準GFPレポータープラスミドを使用して、別の実験での電気生理学的特性の形態の研究を可能にするレポーター戦略の修正を加えて、E15.5胚のIUEためのプロトコルについて説明します。
- DNAの調製
- 製造元の指示に従ってエンドトキシンを含まない単離キットを使用して、DNAプラスミドを準備し、1×Pでそれらを希釈hosphate緩衝生理食塩水（PBS）。
- 単一セルの標識のために、以下の構築物および最終濃度を使用して手術当たりのDNA混合物の10μL（胚あたり1μL）を調製：プラスミド対照として、蛍光タンパク質レポーター（ 例えば、CAG-DsRed2の
- 製造元の指示に従ってエンドトキシンを含まない単離キットを使用して、DNAプラスミドを準備し、1×Pでそれらを希釈hosphate緩衝生理食塩水（PBS）。
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結果
詳細にと開発を通じて神経細胞の形態学的変化を特徴づけるために、まばらニューロンを標識することが不可欠です。この酵素を取り入れるだけのニューロンがGFP（ 図1A）を発現するようのCreリコンビナーゼ希釈システムは、神経細胞のまばらな集団において、目的の遺伝子の発現を可能にします。この戦略を使用して、層II-IIIが標的とE15.5でIUEによって標識されています。 1μg/μLでCAG-DsRed2のは、コントロールとして同時エレクトロポレーションであり、生きている動物に正のエレクトロポレーションの脳を識別します。重要なことには、抗GFP抗体で染色した後、信号は、それらの樹状突起の形態及び軸索（ 図1D及びE）の明確な可視化を可能にするのに十分に強いです。
IUEと電気後、細胞全体の記録から得られたパラメータの分析は、同時ために使用されさまざまな条件.......
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ディスカッション
このプロトコルは、それらの接続とその興奮性を分析するために、C75BL / 6マウスの体性感覚皮質の神経細胞を標識する方法を詳細に説明しています。既存の方法に関しては、そのようなニューロンあたり軸索分岐の数、それらの正確な地形、およびそれらの解剖学的部位として、接続の識別側面を可視化します。電極の位置を変化させることにより、このような帯状皮質（電極と脳との間の同じ角度を維持したが、磁極の向きを変更する）または海馬5のような他の神経細胞集団を、標的、および同様に行うことができます希望の戦略に応じて、個々のニューロンまたはより広範な集団を標識実験、。すべてではない集団が等しくアクセスまたは同等に選択的に標識されているようしかし、これには限界があります。例えば、海馬では、選択的に遅く生まれCA1領域のニューロンが、EAを標的とすることが可能ですRLYエレクトロポレーションは、内側と外側の錐体細胞の不均一な集団をマーク。大脳皮質では、ニューロンは、IUE中に妊娠日連続的に生まれ、そのようにしている皮質層が影響を受けているかを決定します。以前IUEを実行すると、より深い神経細胞を標的とする（
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開示事項
著者らは、利害の衝突を宣言しません。
謝辞
私たちは、その優れた技術支援のためと編集のためのLAヴァイスにR.・グティエレスとA.モラレスに感謝しています。 CGBはスペインMINISTERIOデCiencia電子Innovación（MICINN）、FPI-BES-2012から056011によって資金を供給されています。この作品はM.ナバレテにBBVA財団とSAF2014-58598-JIN（MINECO）からの助成金によっておよびラモンAreces財団と助成金SAF2014-52119-Rおよび（MINECOから）BFU2014-55738-REDTへの助成金によって賄われていましたM.ニエト。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 | |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 | |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 | |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 | |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | |
| Carprofen (Rimadyl) | ファイザー社 | 1615 ESP | |
| イソフルラン (IsoFlo) | アボット (エステベ) | 1385 ESP | |
| ケタミン (イマルジーン) | メリアル | 2528-ESP | |
| キシラジン (Xilagesic) | カリエ | 0682-ESP | |
| ポビドン ヨウ素 | メダ | 694109.6 | |
| 眼軟膏 (リポラック) | アンジェリーニ | 65.277 | |
| ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 | |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Sigma -Aldrich | P4333 | |
| メス ハンドル # 3 - 12 cm | ファイン サイエンス ツール | 10003-12 | |
| メス ブレード # 10 | ファイン サイエンス ツール | 10010-00 | |
| アドソン鉗子-鋸歯状 - ストレート 12 cm | ファイン サイエンス ツール | 1106-12 | |
| 硬化ファインハサミ - ストレート 11 cm | ファイン サイエンス ツール | 14090-11 | |
| はさみ メゼンバウム ネルソン湾曲 L=14.5 cm | テレフレックス | PO143281 | |
| 細い湾曲した先端 - スタイル 7 デュモクセル | デュモン | 0303-7-PO | |
| デュモン #5 鉗子-イノックス | ファイン サイエンス ツール | 11251-20 | |
| マチュー ニードル ホルダー - 鋸歯状 | ファインScience Tools | 12010-14 | |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL | |
| 9 mm オートクリップ | MikRon Precision, Inc. | ||
| 縫合糸 - Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 | |
| 電気カミソリ | パナソニック | ER 240 | |
| ホウケイ酸ガラスキャピラリー (100 mm, 1.0/0.58 外径/内径) | ワールド精密機器 | 1B100F-4 | |
| キャリブレーション済みマイクロキャピラリーピペット用アスピレーターチューブアセンブリ | Sigma -Aldrich | A5177-5EA | |
| ガーゼ (アポサン) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 | |
| 綿棒 (スターコット) | アルバサ | ニー | |
| ドル 25 g (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 | |
| ショ糖 | シグマ -アルドリッチ | S0389 | |
| パラホルムアルデヒド | シグマ -アルドリッチ | 158127 | |
| OCT 化合物 | さくら | 4583 | |
| 組織培養皿100 x 20 mm | Falcon | 353003 | |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 | |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| ウシ胎児血清 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 10270106 | |
| トリトン X-100 | シグマ・アルドリッチ | X100-500ML | |
| エレクトロポレーター ECM 830 | BTX ハーバード 装置 | 45-0002 | |
| 白金電極 650P 7 mm | ネパジェネ | CUY650P7 | |
| 顕微鏡 蛍光イメージング用 - MZ10F | ライカ | - | |
| VIP 3000 イソフルオラン気化器 | |||
| レーザースキャンシステム | ライカ | - | |
| アクシオーバート 200 顕微鏡 | ツァイス | - | |
| クライオスタット - CM 1950 | ライカ | - | |
| P-97 マイクロピュラー | サッター機器会社 | P-97 | |
| パッチクランプ解析ソフト (p-Clamp Clampfit 10.3) | 分子デバイス | - | |
| アクイジションソフトウェア (MultiClamp 700B Amplifier) | 電動 | ||
| サッターインストゥルメント | MP-225 | ||
| エアテーブル | ニューポート | - | |
| ミニチュア蠕動ポンプ | WPI | - |
参考文献
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheri....
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再版と許可
