透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法

Summary

多くのタンパク質は、膜表面に付着するとその機能を果たします。ナノディスク膜上の外因性タンパク質の結合は、透過型電子顕微鏡によって間接的に画像化することができます。我々は、ネガティブ染色のリンスホタングステン酸ナトリウムによって誘発されるナノディスクの特徴的なスタッキング(rouleau)が、外部タンパク質の結合によって防止されることを示す。

Abstract

モノトピックタンパク質は、膜表面に付着したときにその機能を発揮し、そのような相互作用は特定の脂質組成と機能を果たすのに十分な面積の利用可能性に依存します。ナノディスクは、制御されたサイズと脂質含有量の膜表面を提供するために使用されます。結合した外因性タンパク質がない場合、透過型電子顕微鏡(TEM)で側面から見ると、リンタングステン酸ナトリウムで染色されたナノディスクはコインの束として現れます。したがって、このプロトコルは、意図的にスタッキングを促進するように設計されています。したがって、スタッキングの防止は、膜結合タンパク質がナノディスクに結合すると解釈できます。さらに、タンパク質-ナノディスク複合体のTEM画像を標準的な単粒子法で処理し、高分解能のクライオ電子顕微鏡研究の基礎として低分解能の構造を得ることができます。さらに、ナノディスクは、TEMまたは非変性ゲル電気泳動のいずれかに適したサンプルを提供します。この方法を説明するために、ナノディスク上の5−リポキシゲナーゼのCa²⁺誘導結合を示す。

Introduction

医学研究では、多くの注意が脂質相互作用の様々な関与、内因性または外因性のいずれかの、膜タンパク質に焦点を当てています。脂質相互作用タンパク質を操作するような洗剤、amphipols ^1、または小さいタンパク質²などの脂質への代替を選択する、または可溶性および活性タンパク質を保持する膜の代用品を見つけるのいずれかが含まれます。リポ膜代替物は、リポソームおよびナノディスク^{（ND）3、4を}含みます。

ナノディスクは、天然に血液中に発生する高密度リポタンパク質（HDL）のタンパク質部分、アポA-1を操作することによって開発され、ネイティブに近い膜のプラットフォームです。アポA-1は、短い両親媒性αヘリックスの243残基長鎖状であり、無脂質可溶性コンホメーションを持っています。 in vitroでの脂質の存在下で、タンパク質アポA-1の2つのコピーが自発的にhydrを取り囲むように並べ替えるとき脂質二重層のパッチ⁵のophobicアシル鎖部分。アポA-1の操作されたバージョンは、一般的に、膜足場タンパク質（MSP）と呼ばれ、数は増加し、プラスミドとして、または精製されたタンパク質として市販されています。

Protocol

ナノディスクの調製

1. 膜足場タンパク質^8、35の発現および精製
   1. フラスコ中の大腸菌 BL21（DE3）T1R pRARE2株にHisタグMSP1E3D1を発現します。 37℃で50μg/ mlのカナマイシンを補充したLB培地で50 mLの一晩スターター培養を準備します。 50μg/ mLのカナマイシンを補充した素晴らしいブロス培地の2 Lで一晩スターター培養物を希釈します。
   2. 600ナノメートル（OD _600）での光学密度が約3 18℃で3時間、0.5 mmのタンパク質発現イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を誘導に達するまで37℃で細胞を増殖させます。
   3. 溶解バッファー（; 100mMのNaCl、10％グリセロール、100mMのトリス-HCl、pH8.0）に調製します。使用直前に1 mMのTCEPを追加します。
   4. 18℃での誘導の3時間後、4,500×gで10分間の遠心分離により細胞を回収4°C。 、上清を捨て採取した細胞を比較検討し、細胞のグラム当たりの溶解緩衝液を2mLの割合で溶解緩衝液中で再懸濁それら。
   5. 80％の振幅で3分間（ON 4秒、4秒OFF繰り返し率）、パルス超音波処理によって溶解細胞。
   6. 49,000×gで、4℃で20....

Results

私たちが提案する方法はmonotopic膜タンパク質が結合するための膜表面を提供するために、ナノディスクの作成に依存します。ナノディスクの脂質二重層に埋め込まない膜貫通タンパク質が存在しないように、ナノディスクは、ここでは「空のナノディスク」（ 図2A）と表記されています。これらは、2 MSP1E3D1の足場タンパク質とPOPC ⁸の約260分子の組成物のために256キロダルトンの計算分子量を有します。このタンパク質の使用：再構成のための脂質比、一つの大きなピーク（ 図2A）は、ゲルろ過中に溶出しました。 9mLの（ 図2A）付近のピーク画分を一つのバンド（ 図2B、レーン1）を示す、青ネイティブゲル電気泳動⁴⁹により検査しました。バンドが計算された256 kDaのよりもやや大きいサイズに対応するが、TEM像で測定されたナノディスクの直径はに対.......

Discussion

空のナノディスクの再構成、タンパク質ナノディスク複合体の調製、およびこれらの複合体のTEMについて陰性染色：この方法は、3つの部分に分離することができます。各部分は技術の限界、重要なステップ、および有用な修飾に関する個別に対処されることになります。

空のナノディスクの再構成。ナノディスクの製造と使用における重要なステップと制限。

空のナノディスクの製造のためには、MSP対脂質比を最適化することが必須です。最も一般的なMSP及び（洗剤としてコール酸を使用して）、脂質については、最適な比率のための提案が文献に見出すことができる（ 例えば、125 -現在のプロトコルで使用されるMSP1E3D1 ^8、51あたり130 POPC）。公開された比と比較して得られた差異は、タンパク質濃度の決意、Lの効率のための方法に依存してもよいですIPID洗剤で溶媒和、および溶液からの界面活性剤除去の方法。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
透過型電子顕微鏡:JEOL2100F	日本電子
CCDカメラ	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH(ドイツ
グローディスチャーシャ	Baltec
TEM grid:400メッシュ	TAAB	GM016/C
サイズ排除クロマトグラフィー:Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
プラスミド:MSP1E3D1	Addgene	20066
バクテリア:BL21DE3	NEB	C2527H
バクテリア:BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
精製マトリックス:ATPアガロース	Sigma Aldrich	A2767
精製マトリックス:HisTrap HP-5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
脂質:POPC	Avanti極性脂質	850457C	クロロホルム中 25 mg/mL
疎水性ビーズ:バイオビーズ、SM-2 樹脂	バイオ・ラッド	1523920
13 mm シリンジ フィルター:0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
染色剤: リンタングステン酸ナトリウム 三塩基性水和物	Sigma Aldrich	31648
2-メルカプトエタノール	Sigma Aldrich	M3148-250ML
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Bio-Rad	161-0301
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
洗剤: チョル酸ナトリウム水和物	Sigma Aldrich	C6445-10G
チョル酸			500 mM チョル酸ナトリウム。ミリQ水に再懸濁し、-20°Cで保存します。
脂質ストック			50 mM POPC, 100 mM cholate ナトリウム, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl. 4 °C;Cは一週間。または ストア-80°窒素で溶液をパージした後、1ヶ月間C。
MSP標準バッファー			20 mM Tris-HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、0.5 mM EDTA. 4°Cで保存。
非脱繊性電気泳動アノードバッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BN2001	50 mM ビストリス、50 mM トリシン、pH 6.8
非脱繊性電気泳動カソードバッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BN2002	50 mM ビストリス、50 mM トリシン、pH 6.8、0.002% クーマシー G-250
非脱繊性電気泳動 4x サンプルローディングバッファー	サーモフィッシャーサイエンティフィック	BN2003	50 mM Bis-Tris、pH 7.2、6 N HCl、50 mM NaCl、10% (w/v) グリセロール、0.001% Ponceau S
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer			社内レシピ: 25 mM Tris-HCl、pH 6.8, 200 mM グリシン、0.1% (w/v) SDS
Denaturaing Electrophoresis 5x Sample loading Buffer			社内レシピ: 0.05% (w/v) ブロモフェノールブルー、0.2 M Tris-HCl、pH 6.8、20% (v/v) グリセロール、 10% (w/v) SDS、10 mM 2-メルカプトエタノール
Terrific ブロス			トリプトン - 12.0 g、酵母抽出物 - 24.0 g、100 mL 0.17 M KH2PO4 および 0.72 M K2HPO4、 グリセロール-4 mL. トリプトン、酵母抽出物およびグリセロールを900 mLまで調製し、別々にオートクレーブ保存した。KH2PO4とK2HPO4を調製し、別々にオートクレーブしました。メディウムを使用する前に両方を混合しました。