海面とサンプル分析にMicroplasticsサンプリングのためのプロトコル

Summary

海面上microplasticsサンプリング、粒子のmicroplasticおよび化学的同定の分離：プロトコルは、以下のための方法論について説明します。このプロトコルは、海洋ごみにMSFD技術サブグループによって公開されmicroplastics監視のための勧告に沿ったものです。

Abstract

海洋環境におけるマイクロプラスチック汚染は、過去10年間でますます注目を浴びてきた科学的なトピックです。科学出版物の大部分は、海面のマイクロプラスチック汚染を扱っています。以下のプロトコルでは、マイクロプラスチック粒子のサンプリング、サンプル調製、分離、化学的同定の方法論を説明しています。船の側面に取り付けられた「Aフレーム」に固定されたマンタネットをサンプリングに使用しました。網のタラの端に引っかかったマイクロプラスチック粒子は、目視による識別と実体顕微鏡の使用により、サンプルから分離されました。粒子のサイズは画像解析プログラムを使用して分析され、ATR-FTIRおよびマイクロFTIR分光法を使用して化学構造が分析されました。記載されているプロトコルは、Marine Strategy Framework Directive(MSFD)のMarine Litterに関する技術サブグループが発表したマイクロプラスチックモニタリングの推奨事項に沿ったものです。このプロトコルとビデオガイドは、世界中のマイクロプラスチックモニタリングに取り組む研究者の研究をサポートします。

Introduction

プラスチック生産の絶え間ない増加と、それに続く^{海洋環境への}廃棄と蓄積により、現代社会への懸念が高まっています。仮にマクロプラスチックごみが海に流入しなくなったとしても、海中に存在するプラスチックごみが分断されることで、マイクロプラスチック汚染は拡大し続ける^{ことになります2}。マイクロプラスチック汚染研究の大部分は、海洋および淡水の生態系で実施され、主に海面汚染に対処しました³。

マイクロプラスチックという用語は、サイズ⁴で5mm未満のプラスチック粒子を指します。この用語は、サイズ(数ミクロンから数ミリメートル)、色、形状(非常に異なる形状のフラグメントから長い繊維まで)が異なる可能性のある粒子の不均一な混合物を表します。マイクロプラスチック粒子は、一次起源または二次起源のものであり得る⁵。主な起源のマイクロプラスチックは、化粧品業界(ピリング、クリームなど)で使用される小さな粒子として、または他のプラスチック製品(プラスチック業界で使用されるプラスチックペレットなど)の前駆体として化学業界で使用される小さな粒子として製造されます。二次起源のマイクロプラスチックは、光、熱、酸素、水、生物によって誘発される物理的および化学的プロセスにより、環境中のより大きなプラスチック片が劣化することによって発生します⁶。2015年には、より大きなプラスチックごみ、洗浄剤、医薬品、繊維製品の4種類のマイクロプラスチック発生源が定義されました⁶。より大きなプラスチックごみの主な発生源(80%)は、陸上にあると仮定されています⁷。化粧品、医薬品、繊維製品からのマイクロプラスチックは、下水や雨水を通じて水生態系に入ります⁶。水の生態系で最も頻繁に見られるマイクロプラスチック粒子は、より大きなプラスチックごみや繊維からの断片^です8。

マイクロプラスチックは環境にいくつかの悪影響を及ぼします。その小さなサイズは、海洋生物^9、10による摂取を通じて食物網に入ることを可能にします。摂取された粒子は、物理的な損傷を引き起こしたり、動物の消化器系を塞いだりする可能性があります¹¹。粒子は、残留性有機汚染物質(POP)の担体である可能性もあります。それらの疎水性表面と、大きな表面積と小さな体積の好ましい比率により、POPsはマイクロプラスチックに吸着することができます¹²。それらを摂取する動物の環境または消化器系では、POPsおよび他のプラスチック添加剤がマイクロプラスチック粒子から浸出することができる¹³。

以前の研究では、水柱から底質まで、海洋環境³にマイクロプラスチックが遍在していることが報告されていました。マイクロプラスチック汚染の脅威は、EUの海洋戦略枠組み指令によってすでに特定されており、その結果、マイクロプラスチックの強制的な監視が推奨されました¹⁴。したがって、海洋ごみに関するEU技術サブグループ(TSG-ML)は、ヨーロッパ海域におけるマイクロプラスチックのモニタリングに関する推奨事項を作成しました¹⁵。したがって、マイクロプラスチックのサンプリングに関するビデオガイドラインは、世界中の比較モニタリングと一貫した管理プロセスをサポートしているため、非常に重要です。

このプロトコルは、アドリア海におけるマイクロプラスチック汚染の最初のモニタリングのためにDeFishGearプロジェクト内で開発されました。TSG-ML¹⁵による文書「ヨーロッパ海域における海洋ごみのモニタリングに関するガイダンス」からの推奨事項が考慮されました。このプロトコルでは、海面でのマイクロプラスチックのサンプリング、サンプルからのマイクロプラスチックの分離、およびマイクロプラスチック粒子の化学分析の方法論を説明し、粒子がプラスチック材料からのものであることを確認し、プラスチックの種類を特定します。サンプリングは、穏やかな水域でのサンプリングに最適な機器であるマンタネットを使用して行われました¹⁶。サンプルからのマイクロプラスチックの分離は、実体顕微鏡を使用した目視識別によって行われました。単離された粒子は、後にフーリエ変換赤外(FTIR)分光法とマイクロFTIR分光法を使用して化学的に同定されました。

Protocol

海面上microplasticsの1サンプリング

1. スピネーカーブームや線やカラビナを使っ»Aフレーム«を使用して、容器の側面からマンタネットを展開します。
2. ウェイクゾーン内部の乱流の影響を受けて集水を防ぐために - （ボートから4メートルの距離。約3）ウェイクゾーンのうち、マンタネットを展開します。
3. データシートの最初のGPS座標と初期時間を書き留めます。
4. 約の速度で1直線方向に移動を開始。 2から3ノット30分と時間計測を開始します。
5. 30分後、ボートを停止し、提供されたデータシートに、ルート（最も正しい方法は、GPS座標からの長さを計算することである）と平均船速の長さを、最終的なGPS座標を書き留めてからマンタネットを持ち上げます水。
6. ボートWAから水中ポンプや水を使用して、海水で完全にネットの外側からマンタネットをすすぎますターリザーバ。タラの最後にネットに付着した全て​​の粒子を濃縮するために、タラ端にマンタの口から方向にすすいでください。
   注意：汚染を防止するために、ネットの開口部を通ってサンプルを洗浄しないでください。
7. 安全なタラの端を削除して、タラのサンプルが300μmメッシュサイズのふるい以下を通じて終わるふるいです。
8. 外部から徹底的にタラの端をすすぎ、篩を通してサンプルの残りを注ぎます。もはやタラエンドの内側の任意の粒子が存在しなくなるまで、この手順を繰り返します。
9. ふるいの一部に篩上のすべての材料を集中。
10. 漏斗を使用して、70％エタノールを用いてガラス瓶またはプラスチック瓶にふるいを洗浄。
11. 、ボトルを閉じて紙タオルで拭くと蓋にラベルを付け、防水マーカーでサンプル名と日付瓶の外に（あなたはまた、損失の可能性を避けるために、ジャーに帆紙に鉛筆で書かれた第二の標識を置くべきですの瓶に消去されたラベルに起因するサンプル名）。クールボックスにラベルされたペットボトルを転送します。
    一般的なサンプリング条件への注意：波が高すぎるとネットが海面上に安定していないので、風速は、2つ以上のビューフォートであってはなりません。トロール中に一定の速度で安定直線コースを維持することが重要です。マンタネット開口部の半分は、サンプリング中に沈めなければなりません。サンプリングの所要時間は30分であるべきである（天然素材の大量がある場合には、例えばプランクトンブルームを、サンプリングの期間は短くすることができます）。プラスチック製のツールや容器の使用は避けてください。ロープや試料の汚染を防止するための容器とマンタネットの接触、合成服（例えばフリース）を避けます。ネットを展開し、キャプチャ中マンタネットやボートの船体に損傷を与えないよう十分に注意してください。

海面サンプルからmicroplasticsの2分離

1. サンプルが含まれていない場合25ミリメートルよりも大きく、清潔であるように思われるすべての項目は、ステップ3に直接続けます。
2. ふるい（≤300ミクロンメッシュサイズ）を介してサンプルを注いで、視覚的な識別とピンセットを使用して、サンプルからサイズ> 5ミリメートル（マクロとメゾリター）のすべての天然または人工ごみのオブジェクトを削除します。それに付着した任意のmicroplasticゴミを除去するために蒸留水で注意深く各除去オブジェクトをすすぐように注意してください。別々の容器内のすべての自然と人工ごみのオブジェクトを格納します。デシケーター（またはオープンエアではなく、閉じたシャーレ内）ですべての自然と人工ごみオブジェクトを乾燥し、それらの重量を量ります。ごみのアイテム¹⁶のカテゴリのマスターリストに従ってすべてのごみオブジェクト> 25ミリメートル（マクロごみ）を特定します。
3. すべてのより大きな物体を除去した後、噴出ボトルや水道水を使用して、ふるいの一部にすべての残りの部分を集中。表示Funnの助けを借りて、70％エタノールの最小量を使用してガラス容器に試料を注ぎますエル。
   注：このステップでは、70％エタノールを使用することは、サンプルを保持するために重要です。また、サンプルの目視検査工程において、エタノールは、したがって、見つけることが容易になる生物とカラフルなプラスチックを変色するのに役立ちます。
4. サンプル（サブサンプル）の少量を取り、ガラスペトリ皿にそれを注ぎます。実体顕微鏡を用いてサンプルを分析する（20 - 80倍ズーム）とmicroplastic粒子を検索します。
5. 各microplastic粒子は、表1に記載されているカテゴリのいずれかに分類し、カテゴリ名の付いたペトリ皿または他のガラスバイアルに入れなければなりません。ペトリ皿は、常時閉鎖される必要があります。
   注：サンプルから分離microplasticsは保守的であると分析のために以下の粒子よりもむしろ選択した場合。粒子の実際の化学構造はまだ後に決定されます。 microplasticsが立ち往生し、したがって、より大きな項目の下に隠すことができるように、すべての側面から、より大きなオブジェクトを分析するようにしてください。また、ペトリ皿の片側に、すでに分析オブジェクトを移動することが有益であり得ます。
6. 機器（マイクロメータスライドまたは画像解析ソフトウェアで校正眼の定規）を測定して、顕微鏡下でペトリ皿を置き、各粒子のサイズを測定（最長対角線を測定）、フィラメントを除いて、その色を注意してください。各サブサンプルは、別の人によって見直されるべきです。ガラスの壁に付着した全て​​の粒子がペトリ皿に洗浄されるように、サンプルを含有するガラス容器を洗うように注意してください。
7. 別々に分析スケールの使用により、各カテゴリのmicroplastic粒子を計量。 Microplastic粒子は、計量前に乾燥する必要があります。閉じたペトリ皿をデシケーターに入れることができ、またはサンプルが（粒子と閉じたペトリ皿の重量が一定になる）粒子は、乾燥になるまで、閉じたシャーレ中で乾燥したままにすることができます。
8. マイクロゴミを識別します。 microplasticsの検索でサンプルを分析すると、その点を考慮してください。他の人が見つけることがトリッキーかもしれないが、いくつかの粒子は（色、形、大きさ）を簡単に表示されます。以下のサンプルでmicroplastic粒子を識別するいくつかの機能は以下のとおりです。たとえば、無細胞構造、不均一、シャープ、曲がったエッジを、均一な厚さ、独特の色（青、緑、黄色、など）。

microplastics 3.化学識別

1. ATR-FTIR分光法
   1. 分析の前にアルコールと柔らかい布で検出システムを清掃してください。
   2. バックグラウンドスペクトルを記録します。試料ホルダーにサンプルを置き、スペクトルを収集します。データベース内のスペクトルを有する得られたスペクトルの自動比較を用いて得られたATR- FTIRスペクトルを特定します。
2. ミクロATR-FTIR分光法
   1. 分析の前にアルコールと柔らかい布で検出システムを清掃してください。
   2. ガラスフィルター上にサンプルを置きます。注：他のフィルタは、私たちすることができますエドが、そのポリマーの性質は、特性評価を妨げる可能性があります。
   3. 自動スキャンテーブル上のサンプルでフィルターを置き、サンプルを見つけるためにジョイスティックを使用しています。
   4. 光学像を記録し、サンプルを特徴づけされる領域（20ミクロンによって例えば20）をマークします。
   5. バックグラウンドスペクトルを記録します。
   6. 試料ホルダーにサンプルを置き、所定の場所でのスペクトルを収集します。
   7. データベース内のスペクトルを有する得られたスペクトルの自動比較を用いて得られたマイクロATR-FTIRスペクトルを特定します。

Results

記載されたプロトコルの最初の結果は、それらの視覚的特徴（表1）に応じて6つのカテゴリに分類さmicroplastic粒子です。最初のカテゴリ、及び通常は最も豊富なものは、フラグメント（図1）です。彼らは鋭い曲がったエッジや不規則な形状の、厚い、剛性です。それらは、異なるさまざまな色であることができます。第2のカテゴリーは、フィルム（図2）です。彼らはまた、不規則な形で現れるが、フラグメントと比較して、それらが薄く、柔軟で、通常は透明です。第三のカテゴリーは、通常、プラスチック業界から発信、ペレット（図3）です。彼らは、不規則な、丸い形状であり、直径5ミリメートルの周りに、サイズが通常より大きい。彼らは通常片側に平坦であり、様々な色のものとすることができます。第四のカテゴリには、顆粒（図4）です。ペレットと比較して、それらは、直径1mmの周りに、定期的な丸い形状と通常小さいサイズを有します。彼らは自然な色で表示されます（白、ベージュ、ブラウン）。第五カテゴリフィラメント（図5）です。彼らは、次の断片に、microplastic粒子の最も豊富なタイプです。彼らは、異なる厚さと色で、短くても長くすることができます。最後のカテゴリは、発泡体（図6）です。彼らは最も頻繁に発泡スチロールの大きな粒子から来ます。彼らは柔らかく、不規則な形状と色は黄色に白です。

microplasticsサンプリングとサンプル分析の主な結果は、サンプルあたりmicroplastic粒子の数です。これらのデータは、キロ²あたりさらに標準化することができます。正規化のために使用される式は次のとおりです。

サンプル/サンプリング面積当たりmicroplastic粒子、

サンプリング領域はマンタネット（;図7、表2、3）の開口部の幅でサンプリング距離を乗じて算出されます。また、粒子は、IMを用いて分析することができます年齢解析ソフトウェア。結果は、各粒子（表4）の最大長さと面積を含みます。画像解析および図8bの前に図8aショー粒子は、各粒子を測定し、番号付けされた画像解析の終了後です。最後に、サンプル当たりの粒子の合計または最高可能な数の化学分析をお勧めします。このスペクトルは、ソフトウェアライブラリ（図10）からのスペクトルと比較され、図9に示すように、フーリエ変換赤外分光法を選択された粒子のスペクトルを変換使用すると、取得されます。所定の粒子がプラスチックであるかどうか、および化学構造からプラスチックの種類を示している場合、最終的な結果が表示されます。

1	断片
2	映画
3	ペレット
4	顆粒
5	フィラメント
6	フォームの

表1：microplastic粒子のカテゴリ。

図1：カテゴリからの粒子の例：フラグメント。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：フィルム：カテゴリからの粒子の例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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図3：カテゴリからの粒子の例：ペレット。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：カテゴリからの粒子の例：顆粒。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：カテゴリからの粒子の例：フィラメント。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6：フォーム：カテゴリからの粒子の例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

サンプリング距離[キロ]	2
マンタ幅[キロ]	0.0006
サンプリングエリア[キロ2]	0.0012

表2： ^{平方キロメートル}当たりmicroplastic粒子の計算に使用調査からのデータの例 。

	いいえ	なし/キロ2
断片	301	250833
フィルム	45	37500
ペレット	15	12500
顆粒	8	6667
フォーム	33	27500
フィラメント	223	185833

表3：6グループに分類データがカウントされ、調査からの結果の例とキロ ² あたりの正規化 （なし-粒子の数）。

図7：Pの視覚的な分類後の代表的な結果の例記事（なし - 粒子の数）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

インデックスリージョン	エリア[mm²の]	最大長さ[mm]
1	8.010	5.506
2	10.517	5.628
3	12.185	5.429
4	3.367	3.367
5	2.475	2.155
6	1.809	2.943
7	6.604	5.238
8	5.779	4.037
9	4.472	3.791
10	16.907	5.355
11	7.246	3.733
12	7.867	4.622
13	6.411	5.056
14	3.281	3.070
15	12.937	5.554
16	6.709	3.716

表4の画像解析結果の例面積さ[mm ^2]、各粒子の最大長さ[mm]を測定します。

図8の画像の例は、前に）取得と、b）画像解析ソフトウェアを有する粒子の画像解析後。ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55161/55161fig8large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図9：顕著なピークとその波長の選択された粒子で測定したスペクトルの例^[-1]。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図10：ATR-FTIRスペクトルライブラリから最も一致するまで選択された粒子から取得したスペクトルの比較の例。 このFの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。igure。

Discussion

マンタネットによる海面上Microplasticsサンプリングは、海面上microplasticsのサンプリングのために広く用いられている方法であるが、現在までに統一方法論は存在しませんでした。大量の水は、マンタネットを通して濾過することができ、したがってmicroplasticsの関連数を捕捉する可能性が高く、その結果を信頼できるものと認識されています。異なる試料間の結果の比較は、正規化によって保証されています。私たちのケースでは、濃度はネット開口部の横幅によってトロール距離を乗じてサンプリングされた領域に関連していました。別のオプションは、正味の開口部に固定された流量計を使用することです。その横方向翼を持つマンタネットが海面上に非常に安定であり、したがって、波にホッピングが最小であるため、流量計の使用が可能です。流量計は、ろ過水の量を記録し、このようにサンプリングされた水¹⁶の体積あたりの結果の正規化を可能にします。

最も頻繁に使用されるマンタネットは300μm程度のメッシュサイズを有しており、3です - 4.5メートル長いです。これらの寸法は、ネットの目詰まりを回避し、できるだけ大きく水の量をサンプリングできるように最適化しました。トローリング速度は2の間であることが推奨されます - 3ノットが、それは波の高さ、風速や海流に依存しています。マンタネットがサンプリング中に監督の下で全体の時間であり、それはホッピング開始した場合、トローリング速度を減少させなければならないことが非常に重要です。トロール時間は約30分であることをお勧めしますが、セストン濃度に依存しています。セストンは時々マンタネットを詰まらせることが起こる可能性があります。この場合、トローリングは、そうでなければmicroplastic粒子が失われることができ、ネットが損傷を受けることができ、すぐに停止する必要があります。マンタネットは、ほとんどの場合、容器の側面から固定されています。マンタネットはウェイクゾーンの外に確かにあるが、これはまた、最も適したオプションです。いくつかの調査ではマンタネットは船尾から修正されました^17、18が、その場合、あなたはネットはウェイクゾーンの外であることを確認する必要があります。容器に起因する乱流のゾーンは、容器の大きさから、ボート^19、20の速度から変化するのでトロールは、サンプリングのために設定されている距離は、個別に決定されるべきです。

海面サンプルからmicroplastic粒子の分離は、ほとんどの場合、視覚的な識別²¹でちょうど行われます。粒子は、1mm未満の実体顕微鏡の使用を必要にして1 mMより大きな粒子は、肉眼で容易に識別することができます。実体顕微鏡の偏光を使用して、プラスチック製のものと非プラスチック粒子を混乱する可能性を低減することを推奨します。プラスチック粒子の誤認の可能性が小さい粒子と高くなります。したがって粒子> 0.5mmでのみ実体顕微鏡を用いて、視覚的に^21を識別することができます。 0.5 mMより小さな粒子のために付加的な、より正確な方法が必要例えばマイクロATR-FTIR分光²¹です。

試料からmicroplastics分離のプロセス中に浮遊フィラメントとサンプルの汚染の可能性が非常に高いです。このため、作業テーブルの上に開いたままにペトリ皿を制御することを強く潜在的な汚染物質、浮遊粒子の同定のために推奨されています。すなわち、データの品質が強く依存する：1）サンプル¹⁶のサンプル、2）品質と実体顕微鏡の倍率、および有機物の3）量で働く人の精度。視覚識別した後、それを強く材料⁸の化学的同定のために利用可能な技術の一つでソートされた粒子を分析することをお勧めします。

いくつかの方法は、FTIR分光法及びラマン分光法が最もfrequenである間、ポリマー同定のために存在しますTLY ^22を使用^していました。 FTIRとラマン分光法は、相補的な技術であり、その精度は似ています。我々のプロトコルでは、FTIRと「減衰全反射率」と顕微赤外分光法（ATR）が提示されています。彼らは使用が簡単であり、彼らは迅速かつ正確な結果を有効にします。プラスチックポリマーは、このようにIRがmicroplastics ²¹の同定のための最適な手法を分光すること、明確なバンドパターンを持つ高度に特異的な赤外線（IR）スペクトルを有しています。特徴的なIRスペクトル²²を測定することができる試料と相互作用する場合、IR放射のエネルギーは、分子の特定の振動を励起します。 FTIR分光法はまた、このような酸化²³や劣化²⁴のレベルの強度などの粒子、に関する追加情報を提供することができます。 ATR-FTIRは、より大きな粒子（> 0.5のmm）との化学的同定のために適しているが、ミクロATR-FTIR分光法は、粒子＆＃の化学構造に関する情報を提供することができます60 0.5 mmであり、それは顕微鏡および赤外線分光器の機能を兼ね備えています。

FTIRマイクロFTIR分光法を使用する前に、microplastic粒子は水が強く、それらがバイオフィルムおよび/またはIRスペクトルに影響を与えることができる他の有機及び無機の付着物で覆われている場合、IR放射^22、および精製を吸収するため、以前に、乾燥されなければなりません。サンプルを精製するための最も非侵襲的な方法は、攪拌し、新鮮な水²⁵で洗浄することによってです。これが十分でない場合、次いで、30％過酸化水素の使用が推奨されます。他のすべての方法はmicroplastic粒子上に負の効果を持つことができる（例えば、超音波洗浄は、さらに粒子を破ることができる、強い酸性またはアルカリ性溶液は、いくつかのプラスチックポリマーなどを損傷する可能性があり）、したがって、その使用は推奨されません。より有望なプラスチック優しい精製工程などの順次酵素消化の使用です。精製異なる技術的な酵素を用いて（例えばリパーゼ、mylase、プロテイナーゼ、キチナーゼ、セルラーゼ、プロテイナーゼK）が正常プランクトンの生体マトリックスの低減に適用し、このようにFTIR分光測定²²中行列アーチファクトを最小にするために有益な技術であることが証明されています。

視覚的な識別と選択された粒子の化学的同定によりmicroplasticsの分離は、両方の非常に時間のかかるプロセスです。この作品は、プラスチック粒子を認識する際に、だけでなく、生物学的な問題を認識していないだけで、実体顕微鏡での経験を持ち、正確かつ患者者によって行われなければなりません。でも経験のある人はキチンや珪藻断片²²から明確にすべての潜在的microplastic粒子を区別することはできません。したがって、視覚的ソートの誤り率を20％から^{26 70％21}の範囲であり、粒子サイズの減少とともに増加します。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
このプロトコルでは、特定の機器や試薬は使用されませんでした。