電気生理学的研究のための成体マウスの網膜の水平スライスの調製

サマリー

私たちは、網膜の表面に平行に切片化の面で大人の哺乳類の網膜の水平スライス標本を開発しました。 nonradially指向の網膜神経細胞の樹状のフィールドは、パッチクランプおよびイメージング技術と信号処理の研究を可能にする、切り捨てられませんでした。

要約

垂直スライス標本はよく大人の哺乳類の網膜内の回路および信号伝送を研究するために設立されています。これらの製剤で切片の面は、光受容体と双極細胞のような半径方向に配向ニューロンの研究に最適です、網膜表面に対して垂直です。しかし、水平細胞、広視野アマクリン細胞、および神経節細胞の大きな樹状アーバは、これらの細胞中で著しく減少シナプス活性を残して、ほとんどが切り捨てられます。神経節細胞と変位アマクリン細胞は網膜の全体に取り付けられた準備に研究することができるのに対し、内顆粒層に位置する水平細胞とアマクリン細胞がわずかしか全体の網膜組織内の電極のためにアクセスできます。

最大のアクセシビリティとシナプス完全性を達成するために、我々は、マウス網膜の水平スライス標本を開発し、感光体と水平の間のシナプスでの信号伝達を研究しました細胞。水平方向の切片は、水平細胞の樹状突起に無傷で機能的なコーンシナプス入力のための前提条件として、電極の標的化のための水平細胞体の（1）簡単かつ明確な視覚識別、および拡張水平細胞の樹状のフィールド（2）保存を可能にします。

水平スライスからの水平細胞は暗所でトニックシナプス活性を示し、そして、彼らは内向き電流と減少したシナプス活性の低下と光の点滅を短時間に応答しました。免疫細胞化学的証拠は水平細胞の樹状フィールド内のほぼすべてのコーンはその周辺の樹状突起とシナプスを確立することを示しています。水平スライス標本は、したがって、水平方向に拡張網膜神経細胞の生理学的特性ならびに選択されたシナプス全体の感覚信号伝送との統合を研究するのに適しています。

概要

視覚情報は、感光体活性化の動的な時空間的パターンとして符号化され、光受容体および二次ニューロン間のリボンシナプスは、視覚情報の下流の転送を決定します。哺乳動物の網膜の垂直スライス標本、 すなわち光受容体と双極細胞との間、および双極細胞、およびアマクリン細胞^{1、2、3、4、}いくつかのタイプの間で、垂直の経路の信号処理を研究するための非常に貴重なツールです。

しかし、垂直切片は常にシナプスの連絡先のかなりの損失につながる、多くの網膜神経細胞の樹状突起分野の厳しい切り捨てが発生します。特に、網膜の外側に、水平細胞は、それらの横に広がる拡張樹状のフィールドと軸索末端システム⁵に影響を受けます。垂直でスライス標本、水平細胞の樹状突起の円錐感光体端末の数百のシナプス入力は、このように、いくつかの疎コンタクトに低減されます。これは、個々のシナプスの特性を研究するためには十分かもしれないが、それは決してないが、感光体リボンシナプスの同期化された活性化の基礎となる信号処理機能を表します。

したがって、我々は、無傷で機能的....

プロトコル

すべての手順は、ドイツ連邦共和国によって発行された動物実験のためのガイドラインに従って行いました。

注：網膜組織は、この手順の延長部分の間に酸素を欠いていることになりますので、すべてのステップができるだけ速く行われるべきです。マウスは、解剖の前に少なくとも3時間暗順応でなければなりません。網膜の光適応を回避するために、準備とスライスは、暗赤色灯の下で行われるべきです。

メディアやその他の化学物質の作製

1. エイムズ「中^6を準備^します。解剖後、すべての回でエイムズ「中に網膜組織を浸します。
   1. エイムズ「中の2.2グラムと蒸留水250ミリリットルで298ミリグラムのHEPESを溶解させます。 HEPESの濃度は5 mMのだろう。すべての粒子が溶解するまで穏やかに撹拌します。
   2. カーボゲンを用いて室温でバブルエイムズ「中（95％酸素、5％の車少なくとも5分間、ボン二酸化）。溶液へのガラスパスツールピペットで供給カーボゲン。ガス調整器の出口に適切なチューブを介して、パスツールピペットを接続します。
   3. 溶液に、475 mgのナトリウム - 炭酸水素を追加します。バブリング後の重炭酸塩の添加は、炭酸カルシウムの沈殿を防止します。

結果

マウス網膜の水平スライスでは、水平細胞体は簡単に多角形の細胞体（ 図1A）から出てくるいくつかの主要な樹状突起とのユニークな形態に応じて特定することができました。スライスの表面近くに位置する水平細胞体は、パッチクランプ電極のための日常的にアクセス可能でした。録音時には、細胞が密接に無傷のマウス網膜^8（ 図1B）の軸索保有水平細胞の形態と類似していた彼らの複雑な樹状樹枝状分岐を、明らかにし、蛍光色素を充填しました。フルオレセイン結合ピーナッツ凝集素とコーン茎の標識はコーン茎と水平細胞の樹状突起（ 図1C）との間の密接な空間的な関係を示しました。いくつかの例外を除いて、水平細胞の樹状のフィールド内のすべてのコーン茎は、樹状突起により接触させました。

ENT "FO：キープtogether.withinページ=" 1 ">コーンと水平細胞間の接触は、パッチクランプ記録は、水平.......

ディスカッション

垂直スライスとは対照的に、水平細胞とアマクリン細胞のような半径方向に配向ニューロンの樹状突起形態がよく保存されています。全網膜製剤と比較して、これらの細胞型は、微小電極のために容易にアクセス可能であり、両方の電気及びイメージング技術によって研究することができます。ここでは、網膜の外側に焦点を当てました。しかしながら、同様のアプローチは、特に、内網膜¹⁰のアマクリン細胞について報告されています。

水平スライス標本の特性は、機能的研究のためのいくつかの意味を持ちます。錐体光受容体とシナプス後水平細胞間のシナプス結合の数は、無傷の網膜からほとんど区別できませんでした。シナプスの連絡先は、暗闇の中で神経伝達物質の強壮剤の放出を示す、機能的でした。シナプスは、明/暗の遷移などの内因性刺激するか、外部の双極刺激によって活性化することができました。

技術の1つの重要なステップは、組織を損傷することなく、できるだけ速く行われるべきである網膜自体の単離であります。また、.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
エイムズミディア	シグマ	A1420
炭酸ナトリウム	シグマ	S5761
ペ	スシグマ	H3375
ボゲン	エアリキード
アガロース	シグマ	A9045
35mmペトリ皿(プラスチック)	Nuncサーモフィッシャー	150318
ガラスペトリ皿	ケモリン	50-1470-40
イソフルラン	調剤 大学病院
ビブラトーム 注射器 ブレード	バイオシステム	39053250
ビブラトーム	ライカ マイクロシステム	VT1200
バイブロチェック	ライカ
マイクロ波
ウォーターバス
鉗子
20G針
春はさみ
湾曲メスの刃実
体顕微鏡
パスツールピペット
ガラスパスツールピペット

ム重ヘカルプラスチック