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方法論記事

非侵襲的

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DOI:

10.3791/55180

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2017年5月8日

 ,  ,  ,  , 
1Werner Siemens Imaging Center, Department of Preclinical Imaging and Radiopharmacy, Eberhard Karls University of Tübingen, 2Department of Nuclear Medicine, Eberhard Karls University of Tübingen, 3Department of Dermatology, Eberhard Karls University of Tübingen

この記事について

サマリー

この論文は、炎症の二つの異なる実験モデルにおいて、キーマトリックスメタロプロテアーゼのインビボ活性を視覚化するために活性化光イメージングプローブを用いた蛍光イメージングの応用について説明します。

要約

この論文では、炎症の2つの異なるマウスモデル：慢性関節リウマチ（RA）および接触（慢性関節リウマチ） におけるin vivo蛍光イメージング（OI） を介して 、活性化可能な蛍光プローブによるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）活性を画像化するための非侵襲的方法を記載する。過敏反応（CHR）モデル。近赤外（NIR）ウィンドウ（650〜950nm）の波長を持つ光は、650nm未満の波長に比べて、より深い組織浸透と最小限の信号吸収を可能にします。蛍光OIを用いることの主な利点は、異なる動物モデルで安価で、迅速かつ容易に実施できることである。

活性化可能な蛍光プローブは、それらの不活性化状態では光学的にサイレントであるが、プロテアーゼによって活性化されると高度に蛍光性になる。活性化されたMMPは、組織破壊をもたらし、遅延型過敏症反応（DTHR）（例えば、RAおよびCHR）における疾患の進行にとって重要な役割を果たす。さらに、MMPは、キー軟骨および骨の分解のためのプロテアーゼおよび炎症性サイトカインに応答して、マクロファージ、線維芽細胞や軟骨細胞によって誘導されます。ここでは、MMP-2のようなキーのMMPによって活性化されたプローブ、-3、-9および-13を使用して、同様に6日間の疾患誘導後RAおよび対照マウスにおけるMMP活性の近赤外蛍光OIのための撮影プロトコルを記述する急性（1Xチャレンジ）と健康の耳に比べ右耳の慢性（5倍の挑戦）CHRを持つマウスのように。

概要

関節リウマチ（RA）または尋常性乾癬などの自己免疫疾患は、遅延型過敏症反応（DTHR）として分類される。 RAは、びらん性滑膜炎および関節破壊によって特徴付けられる一般的な自己免疫疾患である。炎症細胞の浸潤と増殖、炎症細胞の発現の増加がパンヌス形成、軟骨および骨破壊をもたらすことを実証している2。マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMPs）によるコラーゲンなどの細胞外マトリックス分子の切断は、組織の変換や血管新生に不可欠であり、組織の破壊を引き起こす。 5、6接触過敏反応（CHR）は、酸化的バーストをもたらす好中球の凝集によって特徴付けられる。 RAと同様に、CHRのMMPはインボルブ慢性炎症を確立するために、組織変換、細胞移動および血管新生に供される。

RAを調べるために、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（GPI） - 血清注入マウスモデルを使用した。 GPIに対する抗体を含有するトランスジェニックK / BxNマウスの血清をナイーブBALB / cマウスに注射した後、GPI血清注入後6日目に最大24時間以内にリウマチ性炎症が発生し始めた（1.1参照）。慢性CHRを分析するために、C57BL / 6マウスを腹部のトリニトロクロロベンゼン（TNCB）で感作した。右耳に感作後1週間目から5回までチャレンジした（1.1および1.2も参照）。

非侵襲的小動物OIは、前臨床研究で主に使用されている蛍光、化学発光および生物発光シグナルの生体内調査に基づく技術である。得られた半定量的データは、分子健康な器官および組織におけるウラル機構ならびに罹患実験動物モデル、及び縦フォローアップ測定値（ 例えば 、インビボでの治療的応答プロファイルを評価するため）を可能にします。縦断的研究の大きな利点は、同じ動物ではなく、時点ごとに異なるマウスを用いて、いくつかの時点でフォローアップ試験で測定することができるように、動物の数が減少することです。 OIの解像度は、臓器の詳細な機能イメージングおよび実験動物におけるさらに小さな組織構造を可能にします。

狭い透過スペクトルを持つ特定の励起および発光フィルタの使用、遮光「暗箱」と-70℃に多くの装置で冷却された敏感な電荷結合素子（CCD）カメラ、によって散乱された光に対する保護、蛍光シグナルの高度に特異的かつ高感度な測定が可能となります。

excitation-と蛍光剤を使用し、近赤外蛍光ウィンドウの発光スペクトル（650から950 nm）は、信号対雑音比を大幅に向上させることができます。近赤外蛍光ウィンドウはヘモグロビン及び水による信号の比較的低い吸収ならびに低バックグラウンド自己蛍光によって特徴付けられます。 9これは、小動物の組織で最大2センチ侵入深さを可能にします。 OI-プローブが直接（蛍光標識抗体による）目標に対処することができるか、（プロテアーゼにより）標的組織中で活性化することができます。活性化OIプローブを伴う別のドメインへの分子内励起エネルギーを伝達消光部分、に蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）にそれらの不活性化形態の光学的にサイレントです。染料は（例えばプロテアーゼによって）切断された場合にエネルギーはもはや分子内に移し、蛍光シグナルがOIによって検出することができるではありません。これは、高specificitとOIプローブの設計を可能に明確な生物学的プロセスと優れた信号対雑音比が得られます。

以下のプロトコルは、動物の調製、in vivoでの MMP-2、-3、-9および-13活性および炎症の2つの実験モデル（RA、CHR）を画像化するための活性化可能OIプローブを用いたOI測定を詳細に説明する。

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プロトコル

本書に記載されているすべての手順は、実験動物のケアと使用のガイドラインと国際基準に従い、ドイツのテュービンゲン国家委員会の動物福祉倫理委員会によって承認されました。 8〜12週齢のBALB / cおよびC57BL / 6マウスを12時間：12時間明/暗サイクルに保ち、IVCおよび22±1℃の標準環境条件で2〜5の群で水および食べ物は自由にアクセスできます 。

材料準備

  1. 注射直前にそれぞれのデータシートに従って近赤外蛍光イメージングのためのOI色素を希釈する。 インビボで MMPを測定するための活性化可能なOI色素（680nmでの励起を伴う市販のプローブ）は、1.5mLの1×PBS中で20nmolの濃度で使用する準備ができている。使用する前に、溶液を静かに振り混ぜるかボルテックスする。 OI染料は、光から保護されている場合、最大6ヶ月間2〜8℃で保存することができます。
  2. 静脈内 （IV）注射は、静脈カテーテルを準備します。 0.9％生理食塩水で満たされた20 U（0.5 mL）をインスリンシリンジ（50mLのヘパリンの10個の噴射単位を含有する）、およびポリエチレンカテーテルに取り付けられた30ゲージの針を使用します。 OI染料のマウスあたり2 nmolのの推奨用量を注入します。

関節リウマチや慢性接触過敏反応の2誘導

  1. 関節リウマチ：
    1. RAを誘導するために1×PBS（200μL）で1：グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（GPI）1に対する抗体（AB）を含む（K / BXNマウス10から得られた）血清の100μLに希釈します。 -80°Cで希釈した血清を保管してください。 RAの誘導のための詳細な手順はMonach らによって記載されています。 8。
    2. RAを誘導するために、その尾により穏やかに各マウスを持ち上げ、Tの0日目に希釈した血清を腹腔内（IP）の200μLを注入彼は実験します。注射後、マウスをそのケージに直接戻す。
    3. オプションで、AB注射の前に各足首の足首の直径を測定し、「関節炎スコア」を定義する（ 図1A ）。機械的測定装置（マイクロメーター）を用いてGPI血清後6日目まで毎日足首腫脹の測定を継続する。
    4. RAマウスの尾静脈に生体内 MMP活性を測定するために、活性化可能なOI色素を注入する（ステップ1.1~1.2） GPI血清注射後5日目およびコントロールマウスの尾静脈に注射した。尾静脈注射の24時間後に光学イメージング実験を行う。
  2. 接触過敏反応：
    1. C57BL / 6マウスの感作のために、アセトン/オイルの4：1混合物に溶解した5％TNCB溶液を調製する。
    2. 100％酸素（1.5L /分）で気化した1.5％イソフルランを用いてC57BL / 6マウスを麻酔する。マウスを麻酔したら、それを自己狂犬病 （1.5体積％のイソフルランチューブに接続した切断5mLのポリエチレンシリンジ）で麻酔を維持する。麻酔をかけた動物に獣医用軟膏を塗布し、麻酔下で眼の乾燥を防ぎます。
    3. 小さな動物の毛のトリマーを使用して慎重に（2×2 cm）腹部を剃る。動物の中で非特異的な蛍光シグナルを引き起こし、研究結果に影響を与える可能性があるため、皮膚を傷つけないでください。
    4. 動物を感作するために100μLピペットを使用して、剃毛した腹部領域で5％TNCB溶液80μLをゆっくりと適用する。角膜の損傷を避けるために、マウスの目が寝具に接触しないように注意しながら、ケージに軽く戻してください。
    5. 感作の6日後に、1％TNCB溶液（アセトン/オイルの9：1混合物に溶解）を調製し、ピペットを用いて右耳に20μLをかけて急性および慢性CHSRを誘発する。「> 1
      1. 100μLピペットを用いて、1％TNCB溶液20μLと右耳の両側に第1チャレンジで始まり、CHR（ 図1B）を引き出すために5回（感作後15日目）に毎秒日チャレンジを繰り返します。マイクロメータ測定装置を使用して、毎日の耳の厚さを測定します。
    6. CHRマウスにおいてチャレンジ後12時間のin vivoでの MMPの活性を測定する活性化OI色素（680nmにおける励起を有する市販のプローブ）（ステップ1.1から1.2）を注入します。光学イメージング実験の24時間後に尾静脈注射を行う（IV）。

光イメージングのための3動物の準備

  1. スイッチマウス固形飼料に使用OI剤の蛍光信号の低または非蛍光飼料（ 例えば 、遊離マンガン）（700nmの周りの）自家蛍光の干渉を回避するために（少なくとも3日間撮影前）。
  2. で動物を置きます酸素（1.5L /分）で気化した1.5vol％イソフルラン（酸素は空気で置換することができるが、1回の実験で標準化する必要がある）を用いて麻酔する。
  3. マウスが目に見えて麻酔されたら、それを自作ノーズコーン（1.5体積％イソフルランチューブに接続したカット5mLポリエチレンシリンジで構築）に置き、麻酔を維持する。
  4. 小動物ヘアトリマーを使用して、動物を注意深く標的部位（2cm×2cm）に剃ります。動物の中で非特異的な蛍光シグナルを引き起こし、研究結果に影響を与える可能性があるため、皮膚を傷つけないでください。
    注：HIRは、関心領域（ROI）に依存して、OI中に蛍光シグナルを吸収することができる（マウス株に依存し、多かれ少なかれ吸収が観察される）。
  5. 静脈内注射のために、暖かい水の中にマウスの尾を置き、血管拡張を誘発し、アルコールで注射部位の皮膚を静かに浄化し、カテーテルを尾の先端サイト。尾静脈に20°の角度で、針の端を「カット」と注射器を再懸濁することによってカテーテルの正確な配置をテスト置きます。
  6. カテーテルが正しく配置されている場合は、シリンジを交換し、OIのプローブ（2ナノモル）を注入します。注入後、シリンジを交換し、完全にポリエチレンチューブのデッドボリュームをクリアするために、0.9％の食塩水の25μLを注入。
    注： インビボで MMP活性を測定するために使用OI色素（680nmにおける励起を有する市販のプローブ）の組織半減期は72時間です。完全なクリアランスを確保するために、色素の再注入は、以前の7日前に注射後よりも推奨されていません。

4.光イメージング

  1. 視野（FOV）の中心でOI-スキャナのブラックボックスに黒いプラスチックまたは紙シートを置きます。
  2. 測定プロトコルを設定し、右の波長を選択し（励起：680±10 nmおよび電子ミッション：700±10 nm）を、撮像パラメータ。
    注：一部のOIシステムでは、複数の画像形成色素の設定が事前に定義されています。
  3. 蛍光イメージングのために正しいプロトコルを選択するために、（製造業者によって提供された）画像ソフトウェアを開き、システムを初期化します。ほとんどのCCDカメラは、その使用温度まで冷却する必要があり、これは10分かかることがあります。システムの準備ができるまで、信頼性の高い結果を得るために、待ちます。
  4. in vivoイメージングシステム取得制御パネルがポップアップ観察し、選択された各フィルタ対は、配列中の1枚の画像を表します。この場合には、を有する市販の染料及びそれぞれ680±10nmから700±10nmでの励起および発光波長のフィルタのペアで一つの画像を取得し、（押し「を取得配列」）の測定を開始します。より詳細な手順については、製造元のマニュアルを参照してください。
  5. 適切な画像にラベルを付け、「イメージの編集に情報を保存します「ラベル取得」ウインドウが表示され、「取得シーケンス」の後にポップアップ表示されます。
  6. OI色素を注射する前に各動物のベースラインスキャンを行うか、またはナイーブコントロール動物を用いてバックグラウンドシグナルを区別する。
  7. OI色素の尾静脈注射後、OIシステムにおいて最も高いシグナルを測定する位置で、動物をFOVの中心に置き、測定を開始する。
    注記：重要：低体温はイメージング剤の分布に大きな影響を与える可能性があります。動物の低体温を避けるために、ステージが37℃まで加熱されていることを確認してください。イメージングは​​、1〜5匹のマウスの群の動物と同時に行うことができる。同時に測定する動物の数に応じて、FOVのサイズを選択します。各マウスが見えるかどうかを確認するには、明るいフィールド画像を撮ることができます。

5.データ解析

注：次の画像ソフトウェアを使用してデータ分析を実行します製造業者のプロトコル。

  1. RAの測定には、 図2に示すように校正された光子放射の単位を使用しますが、慢性CHSRは信号強度として％（効率）で描かれます。
  2. ROIを手動で描画するには、ツールプレートを使用します。 RA画像の分析のために、標準化された円を使用し、各動物のすべての足首および足の中で最も高いシグナルの周りに配置する。 CHSRを分析するには、明視野画像に従って左右の耳全体にROIを配置します。
  3. 描かれた特定のROIの光子放出またはシグナル強度値を測定するには、「測定」を押します。システムは、描写的な統計解析のために描かれたROIの値を提供する。

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結果

ナイーブBALB / cマウスにおいて関節リウマチ（RA）を誘発するために、0日目にGPIに対する自己抗体（1×PBSで1：1希釈）を腹腔内注射した。このGPI血清における最大炎症（足首腫脹） RAモデルは注入11日後に投与される。したがって、2nmolの活性化可能なOI色素を調製し、5日目に関節炎マウスおよび健常対照動物の尾静脈に静脈注射した。注射の24時間後（6日目）に、マウスを麻酔し、セクション3 図1A ）。

CHRを誘導するために、C57BL / 6マウスを、剃毛した腹部で0日目に5％TNCBで感作させた。感作後7日目に、1％TNCBを用いた右耳に対する第 1チャレンジを開始した。慢性炎症を誘発するために最大5つのチャレンジ（15日目）を行った。 7時 12分後最後のチャレ...

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ディスカッション

OIは、前臨床研究インビボ分子イメージングにおける非侵襲性のために非常に有用な迅速かつ安価なツールです。 OIの特定の強さは、炎症応答のような非常に動的なプロセスを監視する能力です。また、OIは、1つの数日から数週間の範囲の、長期間にわたって病気の経過を追跡することを可能にします。

それは非常に時間とコスト効率的であるようにOIは、陽電子放射断層撮影（PET）または磁気共鳴画像（MRI）のような他のインビボイメージングモダリティに比べていくつかの利点を有します。買収あたり最大5匹の動物を用いた高スループット分析が可能です。また、多くの異なる生物学的プロセスを標的とするプローブの多数は、利用可能です。 12はさらに、解剖学的情報を提供するために、OIは、MRIまたはX線のような他の画像化技術と組み合わせることができます。別の制限は、 例えば Fに比較して低い組織侵入深さであります独創的なPETイメージング。さらに、多...

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開示事項

著者は何も開示することはありません。

謝辞

私たちは、優れた技術サポートのためにダニエル・ブカラ、ナタリー・アルトメイヤーとFundaケイに感謝します。私たちは、原稿を編集するためのジョナサン・コットン、グレッグ・ボーデンとポールSoubiranに感謝します。この作品は、CRC 156（プロジェクトC3）を通じてヴェルナーシーメンス財団とエバーハード・カールズ大学テュービンゲン（「」Promotionskolleg「」）の医学部でとDFGによってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
CornergelGerhard Mann GmbH1224635眼科用軟膏 
ForeneAbbott GmbH4831850イソフルラン
U40 インスリン注射器Becton Dickinson and Company324876
HeparinSintetica6093089
High-Med-PE 0.28 x 0.61 mmReichelt Chemietechnik GmbH+Co28460ポリエチレンチューブ、内径 0.28 mm、外径 0.61 んん 
BDレギュラーベベルニードル、30 GBecton Dickinson&Co. Ltd.30510630 G 注射カニューレ
RTA-0011 イソフルラン気化器Vetland Medical Sales and Services LLC-Artagain
描画紙Strathmore アーティスト ペーパー446-8コール ブラック
IVIS スペクトラムパーキン エルマー124262光学イメージング システム
BD レギュラー ベベル針、25 Gベクトン ディキンソン アンド カンパニー305122
2-クロロ-1,3,5-トリニトロベンゼンSigma Aldrich GmbH7987456FTNCB
MMPSense 680Perkin Elmer NEV10126蛍光イメージング色素
Oditest Koreplin GmbHC1X018機械的測定
Miglyol 812SASOL-Oil
 BALB/C, C57BL/6チャールズリバーラボラトリーズ -実験に使用したマウス
PBSSigma Aldrich GmbHRA血清の希釈用 
ピペット(100 µL)エッペンドルフ TNCBアプリケーションに使用 
シェーバー ウォール 9962動物用毛刈り機
リビングイメージ パーキン・エルマー OIを測定するイメージングソフトウェア

参考文献

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