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方法論記事

アン

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DOI:

10.3791/55183

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2017年2月9日

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Tulane University

この記事について

サマリー

血管新生は、生理学的に関連性のある環境で調査する必要があるマルチセル、マルチシステムの相互作用を含みます。この研究の目的は、ラット腸間膜培養モデルが血管新生中の無傷の微小血管ネットワークのタイムラプス比較を行う能力を実証することです。

要約

血管新生は、既存の血管か​​らの新たな血管の成長として定義され、内皮細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、免疫細胞、及びリンパ管および神経との調整を含みます。マルチセル、マルチシステムの相互作用は、生理学的に関連する環境における血管形成の調査を必要とします。 in vitro細胞培養モデルの使用は、機械的な洞察を提供してきつつ、一般的な批判は、それらが微小血管ネットワークに関連する複雑さを再現しないことです。このプロトコルの目的は、培養ラット腸間膜組織における血管新生の刺激の前と後に無傷の微小血管ネットワークのタイムラプス比較を行う能力を実証することです。培養組織は、その階層を維持する微小血管ネットワークが含まれています。免疫組織化学的標識化は、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、血管およびリンパ管の存在を確認します。でdditionは、BSI-レクチンと組織を標識すると、増加した毛細血管の発芽と血管密度によって特徴づけられる血清または成長因子刺激の前と後に、ローカルネットワーク領域の経時比較を可能にします。一般的な細胞培養モデルと比較すると、この方法は、内皮細胞系統の研究および生理学的に関連する微小血管ネットワークにおける組織特異的血管新生薬物評価のためのツールを提供します。

概要

微小血管ネットワークの成長とリモデリングは、組織機能のための共通の分母、創傷治癒、および複数の病状であり、重要なプロセスは、既存の1、2から新たな血管の成長として定義され、血管形成です。組織は新しい血管を設計するか、血管新生に基づく治療を設計するため、血管新生に関与する細胞のダイナミクスの重要性を理解することが重要です。しかしながら、この方法は複雑です。これは、微小血管ネットワーク内の特定の位置で変化し、複数の細胞型（ 例えば 、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、マクロファージ、幹細胞）と、複数のシステム（リンパ管ネットワーク及びニューラルネットワーク）を含むことができます。 in vitroモデルは、血管新生3に関与する異なるセル間の関係を調べることに大いに貢献してきたが、それらの生理学的関連性はtheiのために弱体化することができます限られた複雑さと、彼らは密接にin vivoでのシナリオを反映していないという事実rを。これらの制限、三次元培養系3、 エクスビボ組織モデル4を克服するために、マイクロ流体システム5、6、および計算モデル7は、近年開発され導入されています。しかし、無傷の微小血管ネットワークエクスビボでの血管形成を調査するタイムラプス機能を持つモデルの必要性が依然として存在します。複雑さのレベルの血管新生研究のための新たなタイムラプスモデルの確立は、血管新生を調節する根底にあるメカニズムを理解し、治療法を改善するための貴重なツールを提供します。

無傷の微小血管ネットワークを介して血管新生のex vivoでの調査を可能にする潜在的なモデルは、ラット腸間膜培養モデルであります> 8。最近の研究では、血液とリンパ微小血管ネットワークは培養後に生存し続けることが実証されています。さらに重要なことは、ラット腸間膜培養モデルは、機能的な周皮細胞 - 内皮細胞の相互作用、血液およびリンパ管内皮細胞コネクション、タイムラプス撮影を調査するために使用することができます。本稿の目的は、タイムラプスイメージング法のために私たちのプロトコルを提供することです。当社の代表的な結果は、血清と血管新生の刺激後に生き続けると組織特異的血管新生反応と同様に内皮細胞追跡研究を定量化するため、このメソッドの使用例を提供する複数の細胞型を文書化します。

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プロトコル

全ての動物実験および手順は、チューレーン大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。

1.外科プロシージャを設定

  1. 手術前にオートクレーブ機器、手術用消耗品、および文化用品。各ラットに対する外科用品が含まれます：1ドレープ、プレカット穴に1ドレープを（0.5インチ×1.5で）中央に、ガーゼパッド、および1吸収性アンダーパッド。手術器具が含まれます：数10ブレードで1メス、ピンセットの2ペア、および微細なハサミを。文化用品が含まれます：1ドレープ、ピンセットの1組、およびポリカーボネートフィルターで6ウェルプレートのインサートを用意しています。
  2. プレキシガラスのプラットフォーム、外科的なステージと70％エタノールで手術用卓上スペースを滅菌します。使用するまで無菌ボウルに外科的ステージを保管してください。
    1. 100ミリメートル培養皿の中央に穴中1により約2で穿孔することによって、外科的ステージを作成します。次に、滑らかにするためにサンドペーパーを使用任意のシャープなエッジとは、組織のための隆起表面を作成するために、穴のエッジにシリコーン接着剤の層を追加します。
    2. 代替的に、CADソフトウェアを使用して外科的ステージを設計し、3-D印刷（ 図1）によって行います。
  3. ダウン滅菌吸収性アンダーパッドを配置し、その上にプレキシガラスのプラットフォームを築きます。吸収性アンダーパッドの隣に加熱パッド上で、プレカット穴なしで、ドレープを配置します。
  4. 前加温滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、37°C​​にメディアおよび生理食塩水。独立した培養皿に入れメディアとPBS加熱パッドの上、手術のセットアップの隣に50 mLのコニカルチューブに生理食塩水を配置します。
  5. すべてのパッケージは、すべての材料の滅菌処理を確実にするために、手術の開始に先立って開かれていることを確認します。この手順で使用する一般的なツールの完全なリストは、に記載されています 具体的な外科材料とツールの表 。

2. MesenterY組織の収穫

  1. 使用大人の雄Wistarラット（350±25グラム; 6 - 8週齢）。他の株およびラットの年齢を置換することができます。
  2. ケタミン（80 mg / kg体重）およびキシラジン（8 mg / kg体重）の筋肉内注射によりラットを麻酔。ラットが反射反応を確認するために足の指の間につまんで麻酔下であることを確認。どれがあってはなりません。このターミナル手続きのための先制鎮痛は必要ありません。
  3. 腹部を剃ると脱毛クリームを使用して残りの毛を取り除きます。ポビドンヨードに続く70％イソプロピルアルコールで二回腹部の皮膚を拭いてください。ワイプのために、外科医は、手術部位の中心に開始すべきであると以前に滅菌ガーゼまたは滅菌綿棒の同じ部分でスクラビングされた領域を重ならないように円形に準備されたエリアの外に移動します。その後、無菌手術用セットアップに動物を転送し、プレキシガラスプラットの上に置きます形。
  4. 胸骨下の1を開始し、腸の切開で1.25 - メスの刃を使用して、0.75を作ります。腸や腸間膜（皮膚の1層、結合組織の1層、および筋肉の1層）を穿刺しないように注意してください。
  5. 切開オーバープレカット穴とドレープを配置し、ドレープの上に無菌手術用のステージを配置します。開口部は切開部と整列することを確認してください。外科的ステージ開口部を通って回腸を見つけて引き出しを滅菌綿棒アプリケータを使用してください。
  6. 綿棒アプリケーターを使用してステージを8腸間膜Windows、およびWindows（ 図1）には触れないように気をつけて- 6を引き出します。組織は、通常、盲腸の近く始まる小腸の回腸の領域から採取されます。ソリューションを滴下し、無菌注射器を使用して、必要に応じて加温した滅菌生理食塩水で湿った露出された組織を保管してください。
  7. ペントバルビタールナトリウム（ラット当たり0.2 mL）を心臓内注射を介してラットを安楽死させます。私を削除する前にsenteric窓は、ラットが心を触診によって安楽死させていることを確認します。何のパルスがあってはなりません。
  8. ウィンドウをカットする脂肪パッドと細かいハサミをつかむためにピンセットを使用することによって、所望の腸間膜組織を削除します。窓周りの脂肪（2ミリメートル）の境界線を残します。メディアで一度温めた滅菌PBSで一度組織を洗浄し。
  9. 腹腔に体外回腸を戻し、施設のガイドラインに従って動物を処分。

タイムラプス研究3.腸間膜組織培養

  1. 無菌層流フードへの転送オートクレーブ処理培養用品（1.1節を参照）や組織。
  2. ポリカーボネートフィルター膜の上に、各組織を転送するためにピンセットを使用してください。血管系の損傷を防ぐために、脂肪パッドによって組織をつかみます。
  3. 迅速ウィンドウに触れないように注意しながら、脂肪パッドを使用して、組織を広げます。 6ウェルプレートの底部に組織とインサートを反転し、メディアの3ミリリットル（ 図1でカバー）。この手順のために使用される典型的な培地は、1％のペニシリンストレプトマイシン（PenStrep）及び10％ウシ胎児血清（FBS）を有する最小必須培地（MEM）を含みます。メディアは、血管新生を刺激する他の血清および/または成長因子を補充することができます。
  4. までの5日間、標準的なインキュベーター条件の各組織と文化のための3.3（5％CO 2、37℃） -繰り返して、3.2を繰り返します。

腸間膜組織の4タイムラプスイメージング

  1. イメージングの日に、共役BSIレクチンで各ウェルに培地を補充し、30分間の標準的な培養条件下でインキュベートします。レクチンを含まない培地で二回組織を洗ってください。 BSI-レクチン染色は、培養中の最大3日間腸間膜組織に表示されたままになります。
  2. 顕微鏡ステージにプレートを転送します。その形態やネットワーク構造に基づいて、血液やリンパ管を識別します。
  3. 各組織上の所望のネットワーク領域を見つけて、画像を撮影します。イメージングのメモを取ります同じ領域を確保するための場所が、後続のイメージのためにキャプチャされます。電動ステージを使用している場合、座標を文書化します。
  4. インキュベーターに組織を戻し、所望の最終地点まで培養を続けます。希望の実験の時点に応じて、必要に応じて4.3 - 繰り返し、4.1を繰り返します。

5.組織免疫標識

  1. BSI-レクチンラベリング
    1. メディアを有する2つのすすぎに続いて培地中1：40 FITC結合レクチン（6ウェルプレート中のウェルあたり2.5 mLの抗体溶液）を用いて37℃で30分間組織をインキュベートします。リンスの場合は、メディアを追加した後、すぐに交換してください。
  2. ライブ/デッドラベリング
    1. 1 37℃で10分間組織をインキュベート500 2mMのエチジウムホモダイマー1及び1：メディアを有する2つのすすぎに続いて、メディア500、1mMのカルセインAM（6ウェルプレート中のウェルあたり2.5 mLの抗体溶液）。
  3. BSI-レクチン/ NG2ラベリング
    1. スライドし、顕微鏡での組織を広げますE（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。
    2. -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。 PBS（3×10分）で組織を洗います。
    3. 100ウサギポリクローナルNG2抗体および5％正常ヤギ血清（NGS）：一次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。 PBS（3×10分）で組織を洗います。
    4. 100ヤギ抗ウサギCY2結合抗体（GAR-CY2）および5％NGS：二次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。 PBS（3×10分）で組織を洗います。
    5. PBSで2回リンスに続いて、PBS中の午前1時40分FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。リンスのために、PBSを追加し、すぐに交換してください。
    6. スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSで組織およびグリセロール溶液と場所のカバースリップをカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。
  4. LYVE-1 / PECAMラベリング
    1. 顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。
    2. -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。
    3. 200マウスモノクローナルビオチン化CD31抗体と1：一次抗体の標識のために1ながら室温で1時間、組織をインキュベート100ウサギポリクローナルLYVE-1抗体をPBS + 0.1％サポニン+ 2％ウシ血清アルブミン（BSA）+ 5％NGS 。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。
    4. 二次抗体の標識のために、1を用いて室温で1時間、組織をインキュベート：PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100 GAR-CY2：500 Cy3結合ストレプトアビジン抗体および1。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。
    5. 50:50 PBSとグリセロール溶液でスライド、カバー組織をマウントして、上にカバースリップを配置します。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。
  5. BrdU / BSI-レクチンラベリング
    1. メディアへの1mg / mLのBrdUのを追加し、BrdUの溶液で組織メディアを交換。 37℃で2時間インキュベートします。
    2. 顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。
    3. -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。 PBS（3×10分）で組織を洗います。
    4. 37℃で1時間、2 M HCl中の組織DNAを変性させます。 PBS + 0.1％サポニン（3×10分）で組織を洗います。
    5. PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100モノクローナルマウス抗BrdU：一次抗体の標識のために、1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。
    6. 二次抗体標識のために、1を室温で1時間、組織をインキュベート100ヤギ抗マウスCy3結合抗体をPBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGS中（GAM-のCy3）を。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。
    7. をPBSで2回リンスに続いてPBSで1：40 FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。
    8. スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSとグリセロールソリューションと場所カバースリップを有する組織をカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。
  6. BSI-レクチン/ CD11bのラベリング
    1. 顕微鏡スライド上の組織を広げて（1から2の組織/スライド）と乾燥させます。脂肪を切除するためにしっかりと下に押して、メスで余分な脂肪を取り除きます。
    2. -20℃で30分間、冷メタノールで組織を修正しました。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。
    3. PBSで100マウス抗ラットのCD11b + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGS：一次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベートします。洗浄は、PBS + 0.1％サポニン（3×10分）を有する組織します。
    4. 二次抗体の標識のために1を用いて室温で1時間、組織をインキュベート：PBS + 0.1％サポニン+ 2％BSA + 5％NGSで100 GAM-のCy3。 PBSで組織を洗います+ 0.1％サポニン（3×10分）。
    5. PBSで2回リンスに続いて、PBS中の午前1時40分FITC結合レクチンを用いて室温で30分間、組織をインキュベートします。
    6. スライドをマウントするには、上部の50:50 PBSとグリセロールソリューションと場所カバースリップを有する組織をカバーしています。マニキュアを使用して、スライドの端をシールします。

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結果

培養3日後、組織を、ラット腸間膜培養モデル（ 図2A）で微小血管系の生存能力を実証するために生/死生存率/細胞毒性キットを用いて標識しました。腸間膜中に存在する細胞の大部分は、内皮細胞が微小血管セグメントにおけるそれらの位置に基づいて同定された培養物中で生存可能のままでした。内皮細胞増殖はまた、レクチン/ BrdU標識（ 図2D）により確認しました。血管に沿って平滑筋細胞および周皮細胞の存在は、NG2標識（ 図2B）で確認しました。 LYVE1とPECAMのための標識化は、リンパや血液の微小血管ネットワークを分岐同定し、血液内皮細胞表現型（ 図2C） 対維持リンパを確認しました。

このモデルのタイムラプス機能がmicrovaを標識することによって利用されましたBSI-レクチンとscularネットワーク...

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ディスカッション

このプロトコルは、微小血管ネットワークの成長のタイムラプスイメージングのためのex vivoでのツールとしてラットの腸間膜培養モデルを使用するための方法を提示します。我々の研究室での以前の研究は、1のための我々のモデル）、血管新生8、2）リンパ管8、3）周皮細胞-内皮細胞の相互作用8、および4）抗血管新生薬物検査9の使用を確立しています。複数の時点で培養したラットの腸間膜組織を画像化するための能力は、組織特異的成長応答及び様々な血管新生刺激時の細胞間相互作用の追跡を評価するための定量的アッセイを提供しています。血管新生中の内皮細胞の増殖増加および周皮細胞の存在は、私たちの前の仕事8と一致しており、培養ラット腸間膜組織における血管新生の間に複数の細胞型の間の動的相互作用を検証します。

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この作業は、国立衛生研究所のWLMおよびTulane Center for Agingへの助成金5-P20GM103629によって支援されました。プロトコルテキストの編集にご協力いただいたMatthew Niceに感謝いたします。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ドレープカーディナルヘルス401212 "x 12"Bio-Shieldの規則的な殺菌は
メスのハンドルRobozの外科器具RS-9843メスのハンドル、#3;固体;4インチの長さ
の滅菌外科用ブレードシンシナティサージカル0110ステンレス鋼。サイズ 10
培養皿 (60 mm)Thermo Scientific13018110/スリーブ
グレーフ鉗子 (湾曲ピンセット)Roboz Surgical InstrumentRS-5135マイクロ解剖鉗子;鋸歯 状;わずかなカーブ;0.8 mmの先端幅;4インチ長さ
のグレーフ鉗子(ストレートピンセット)Roboz手術器具RS-5130マイクロ解剖鉗子;鋸歯状、ストレート;0.8 mmの先端幅;4 "長さ
NoyesマイクロはさみRoboz手術器具RS-5677Noyesマイクロ解剖スプリングはさみ;
まっすぐでシャープな鈍いポイント。13mmカッティングエッジ;0.25 mm先端幅、4 1/2 "全長
ガーゼパッドFisherBrand13-761-52非滅菌綿ガーゼスポンジ; 4 "x 4" 12プライ
綿TippledアプリケーターFisherBrand23-400-1246 "長さ;木製シャフト;シングルユースのみ
6ウェルプレートフィッシャーサイエンティフィック08-772-49平底、低蒸発蓋付き。ポリスチレン;非発熱性
滅菌シリング 5 mLフィッシャーサイエンティフィック14-829-45ルアーロックチップ
滅菌ボウルMedical Action Industries Inc.0123232オンスピールポーチ;青い;滅菌済みシングルユース
6ウェルプレートインサート(CellCrownインサート)SIGMAZ681792-3EA6ウェルプレートインサート;非滅菌
ポリカーボネートフィルターメンブレンSIGMATMTP04700Isopore Membrane Filter;ポリカーボネート;親 水性;5.0;>&マイクロ;メートル、47 mm、ホワイトプレーン
名前会社カタログ番号コメント/説明
BeuthanasiaSchering-Plough Animal Health Corp. Union(MWI Veterinary Supplyから注文)MWI #:011168有効成分:100 mLあたり、390 mgのペントバルビタールナトリウム、50 mgのフェニトインナトリウム 
KetamineFort Dodge Animal Health (MWI Veterinary Supply から注文)MWI #: 000680Kateset 100 mg/mL
XylazineLLOYD. Inc. (MWI Veterinary Supply から注文)MWI #: 000680Anased 100 mg/mL
生理食塩水Baxter2F7122
PBSInvitrogen14040-133
MEMInvitrogen11095080
PenStrepInvitrogen15140-122
FBSInvitrogen16000-044
BSAJackson ImmunoResearch001-000-162
サポニン SIGMAS7900-100G
イソプロピルアルコールフィッシャーサイエンティフィS25372
ポビドン-ヨウ素オペランド82-226
塩酸シグマ320331
メタノールフィッシャーサイエンティフィック67-56-1
グリセロールフィッシャーサイエンティフィ56-81-5
FITCコンジュゲートレクチンSIGMAL9381-2MG
抗NG2 コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体SIGMAAB5320
PECAM (CD31) 抗体BD Biosciences555026
LYVE-1抗体AngioBio Co.11-034
ヤギ抗ウサギCy2標識抗体Jackson ImmunoResearch111-585-144
ヤギ抗マウスCy3標識抗体Jackson ImmunoResearch115-227-003
ストレプトアビジンCy3標識抗体Jackson ImmunoResearch016-160-084
生死生存率/細胞毒性キットInvitrogenL3224
正常なヤギ血清 ジャクソン免疫研究005-000-121
5-ブロモ-2'-デオキシウリジンSIGMAB5002
モノクローナルマウス抗ブロモデオキシウリジン                       クローンBu20aDakoM074401-8
マウス抗ラットCD11b AbDセロテックMCA275R
を包む ック ック

参考文献

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