方法論記事

の調製と評価 99メートル Tc標識三座キレートバイオ直交化学反応を用いて事前ターゲティングするため

DOI：

10.3791/55188

⸱

2017年2月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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ここでは、プレターゲティングと生体直交化学のための三座99mTc(I)キレート-テトラジン誘導体の放射性標識とin vivo試験のためのプロトコルについて説明します。

要約

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生体直交化学と組み合わせたプレターゲティングは、新しい放射性医薬品を作成するための効果的な方法として浮上しています。利用可能な方法のうち、放射性標識されたテトラジンと生体分子に結合したトランスシクロオクテン(TCO)との間の逆電子要求ディールス・アルダー(IEDDA)環化付加は、特定の生物学的標的をイメージングするための非常に効果的な生体直交的アプローチであることが証明されています。テクネチウム99mは依然として診断用核医学において最も広く使用されている同位体であるにもかかわらず、99mのTc標識テトラジンを調製する方法は不足しています。ここでは、三座-キレート-テトラジン誘導体のファミリーとそのTc(I)錯体の調製について報告します。これらのこれまで知られていなかった化合物を、マイクロ波支援法を用いて99mTcで放射性標識し、31%から83%の放射性化学収率を達成しました。これらの製品は生理食塩水およびPBS中で安定であり、in vitroでTCO誘導体と迅速に反応します。これらのin vivoでのプレターゲティング能力は、活発な骨代謝または損傷の領域に局在するTCO-ビスフォスフォネート(TCO-BP)誘導体を用いて実証されました。マウスの研究では、99mTc-テトラジンは膝と肩関節で高い活性濃度を示しましたが、これはTCO-BPの非存在下で実験を行ったときには観察されませんでした。非標的臓器および薬物動態における全体的な取り込みは、リンカーの性質およびキレートの極性によって大きく異なっていた。

概要

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99m Tc では、世界的に年1、2、3ごとに行わ億50以上の撮像法で、核医学診断に使用される支配的な放射性同位元素のまま。臨床的に使用される99m Tc での薬剤の大部分は、灌流型放射性医薬品です。 99m Tc では、ターゲティング構築物への連結を介して、特定のバイオマーカーを結合するのに向いている積極的に標的とする化合物の数は限られています。対象と99m Tc での放射性医薬品の作成は、多くの場合、目的のバイオマーカー、または同位元素の半減期と結合するターゲッティング分子の能力に99m Tc で -リガンド複合体の影響により阻害される高分子量の生体分子と共に使用するための十分な長さではありません抗体など。後者は、典型的には、画像が非標的TISSからクリアする生体分子のためのために取得されるまでに数日を要します UE。プレターゲッティングは、これらの課題を克服するための代替的なアプローチを提供しています。

バイオ直交化学と組み合わせたプレターゲッティングの両方蛍光および放射性イメージング4、5、6、7、8のための新たな分子イメージングプローブを開発するための有効な方法であることが示されています。 1,2,4,5-テトラジン（Tzの）およびトランス -cyclooctene（TCO）誘導体の間の逆電子需要ディールス-アルダー（IEDDA）反応、 図1に示すように、6特に有効であることが示されました。これらのコンポーネントとのIEDDA反応は、高選択性、in vivoでプレターゲッティングアプリケーション9、10にも最適です（2≈6000 M -1 s -1のk）をPBSに速い反応速度を示すことができます。

e_content 11 C、18 Fに基づく">使用される最も一般的なアプローチは、TCO由来ベクターを標的にし、十分な遅延期間の後、放射性標識されたテトラジンが投与さを投与することを含む。放射性標識テトラジン、64のCu、89 Zrおよび111 Inがされています11、12、13、14、15に報告された。対照的に、in vivoでの結合タンパク質および分解を防止するために、共リガンドの使用を必要とHYNIC系配位子を用いて調製したの99mのみ報告Tc標識Tzのは、あります16。別の方法として、ここでは99m Tc で （I）の合成を報告し、[99m Tc で （CO）3] +コアで安定した三座複合体を形成するリガンドのファミリーを使用して、テトラジンを標識しました。

figure-introduction-1
図1：テトラジンとトランス -cyclooctene間のバイオ直交IEDDA反応。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

準備リガンドのファミリーは、極性および金属結合領域とTzを（ 図2）との間のリンカー基の性質に変化する三座キレートを含んでいます。目標は、結合していないときに効果的に高い標的対非標的比を得るために、局在化およびin vivoでの TCO標識部位と反応し、速やかにクリアできた99m Tc でテトラジン構築物を同定することでした。リガンドをテストするには、ビスホスホネートのTCO-誘導体（TCO-BP）が17を使用しました。私たちは、TCO-BPは、アクティブな骨代謝の領域に局在することが以前に示されているとと反応することができます生体内 18 で放射性標識されたテトラジン。それは、単一の工程で調製することができ、実験は局在が主に関節（膝、および肩）で発生する通常のマウスで行うことができるので、新たなテトラジンをテストするための便利な試薬です。

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プロトコル

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動物実験は、動物ケアに関するカナダ評議会（CCAC）のガイドラインに従ってマクマスター大学の動物研究倫理委員会によって承認されました。

99m Tc でとTZ-三座配位子の1放射性標識

警告：以下の手順は、放射性化合物の使用を必要とします。仕事は、安全性と廃棄規制の遵守とライセンス実験室で行われるべきです。マイクロ波反応は、特に、化学合成のために設計されたマイクロ波中で行うべきです。

  1. 合成[99m Tc で （CO）3（H 2 O）3] + 19、20
    1. マイクロ波バイアルに、結合8mgのK 2 [BH 3 CO 2] 15mgののNa 2 CO 3、20ミリグラムのNa 2 B 4 O 7・10H 2 O、及び25mgのKOCO [CH（OH）]2 COONa・4H 2 Oをパージアルゴンガスで10分間バイアル。
    2. バイアルに0.9％生理食塩水で（〜1100 MBqで、〜30 MCI） - 99メートルのTcO 4の4 mLを加え。
    3. 試薬の十分な混合を確実にするために攪拌し、10秒後、110℃で3.5分間マイクロ波中の反応を加熱します。
    4. 〜400μLの1 M HClを用いて3.5から4に、溶液のpHを調整します。 pH試験紙を使用して確認してください。
  2. テトラジンの放射性標識は、1-5のリガンド
    1. 250μLのMeOH 21内の各リガンドの2mgの（化合物1-5）を溶解します。
    2. 各ソリューションに[99m Tc で （CO）3（H 2 O）3] +（〜74 MBqで、〜2 MCI）の250μLを追加します。
    3. 60℃で20分間マイクロ波を用いて反応混合物を加熱します。
      注：この手順は、すべての5テトラジンため同一でした。
    4. 化合物2-5の場合は、溶媒および再dissolを蒸発させます1（v / v）のDCM：TFA 1の1mLに得られる生成物をまし。
    5. 6分（2-4）または10分（5）マイクロ波で60℃で溶解させた反応生成物（2-5）を加熱します。
    6. 室温に冷却した後、エバポレーター（36℃、8ミリバール、3分、6,000 rpm）を用いて溶媒を蒸発させ、1で乾燥させ、化合物溶解：1 ACN：H 2 Oまたは1：1のMeOH：H 2 OをHPLC精製の前に。
    7. HPLC（C 18逆相）を用いて、未標識テトラジンリガンドで標識された生成物を分離するなどの99m Tc で標識した化合物（1-5）を 、精製します。 H 2 O 20を超える分（18分）、C 18分析4.6×100 mmカラム：40:60 ACNにH 2 O（0.1％TFAとの両方）：通常、30:70 ACNの溶出勾配を使用します。 UV（254 nm）で、ガンマ検出の両方を使用してください。
      1. 各標識生成物の少量のサンプルを取り、共同INJのそれにそのHPLC保持時間を比較します（20％メタノール-H 2 O中の0.125 mg）をected、非放射性、Re標識標準。 Re標識標準は、UV HPLCトレースで識別され、γ-HPLCトレース中の99m Tc で標識化合物と同時に溶出します。この共注射は99m Tc で標識された化合物の正体を確認し、同程度の保持時間でピークを示しています。
    8. 蒸発器（36℃、8ミリバール、3分、6,000 rpm）を用いたHPLC画分から溶媒を蒸発させます。
    9. 0.5％BSAおよび0.01％のTween-80を含む、7.4 kBq / PBS中μLの濃度で精製された化合物を策定します。
    10. 標識された化合物が安定であることを確認するために、in vitroでの安定性試験を行います。安定性を評価するために、各時点でのHPLCに混合物の少量（3.7 MBqの）を注入し、1、4、6時間37℃で製剤化化合物をインキュベートします。

2.事前標的バイオ分布研究

    動物の i>の準備
    1. 7-9週齢の雌のBALB / cマウスを用いて（n = 3）を、尾静脈注射を介して、TCO-BPは、生理食塩水（20ミリグラム/キログラム）（5μgの/μL）中に処方管理。
    2. 物理的な拘束装置にマウスを置き、尾の側面に位置する静脈を識別し、アルコール綿棒で拭いてください。尾の先端から約2cmで、静脈に浅い角度、並列で30ゲージの針を挿入します。ゆっくりと、注射針を削除し、出血が止まるまでのわずかな圧力で、注射部位で清潔なガーゼスポンジを適用するプランジャーを押し下げます。
    3. TCO-BPの1時間後の注射では、尾静脈注射を介して、PBS中の0.5％BSAの100μLで処方さ99m Tc でテトラジンの〜0.74 MBqの（20マイクロCi）、0.01％のTween-80を投与します。
  1. 生体分布研究
    1. 所望の時点（T = 6時間）、3％イソフルラン2％酸素の混合ガスを使用してマウスanaesthetize。に実証eは、麻酔の外科的平面の下であることを確認するために麻酔をかけたマウスの撤退をつまみます。
    2. シリンジヘパリンで前処理を使用して、心臓穿刺により血液（1ミリリットル）を収集します。継続的な麻酔のためのノーズコーンで鼻との背中の上に置いてマウスや動物に剣状突起の位置を確認します。
      1. 20°の角度で、少し剣状突起下の動物の正中線の左に、25 G針を挿入します。完全に針を挿入し、ゆっくりと心を穿刺した場合、針ハブに血を見るために、プランジャーに引き戻します。必要に応じて、心臓を穿刺し、プランジャーを保持しながら、わずかに針を再調整。ゆっくりとシリンジに血液を描画します。
    3. 麻酔下ながら、頸椎脱臼により動物を安楽死させます。
    4. ビニール袋に各動物を置き、全身の活動レベルを測定するために、投与量キャリブレータ（99m Tc で設定）を使用します。
    5. 前計量で、次の組織および体液を収集（内容を）（内容の）血液、骨（膝と肩）、胆嚢、腎臓、肝臓、胃、（内容で）小腸、大腸と盲腸、甲状腺および気管、尿と膀胱：チューブをカウント編、および尾。
    6. 適切な計数管に組織を置く前に血液を除去し、乾燥ブロットをPBS中（血液、胆嚢、および膀胱を除く）は、適切な組織をすすいでください。
    7. ビニール袋に動物の死体を置き、投与量キャリブレータを使用して残留全身活性を測定。
    8. 組織サンプルを含む各チューブを秤量します。チューブの減算初期重量は、組織の塊を得ました。
    9. 各マウスについての注射の時に試験サンプル（100μL）で活性の量を測定するために、投与量キャリブレータ（99m Tc で設定）を使用します。
      注：この試験サンプルは、したがって、注射時に活動カウントを与え、注入量に等しいです。
    10. 組織の測定時に、A以前に使用した試験サンプルのliquot 5μL。マルチ検出器ガンマカウンター（99m Tc で設定）を使用し、5μLの試験サンプル毎分のカウント（CPM）を得ることがカウントされます。
    11. 換算係数（CPMマイクロCi -1）を得るために、式1を使用して活動し、CPMの関係を計算するために、2.2.9と2.2.10で得られた2つの値を使用してください。
      （1） figure-protocol-1
    12. 各組織または液体サンプル中の放射能の量を測定するために、ガンマカウンターを使用してください。
    13. 総注射量の測定の相対的な時に各組織または体液中の活動量を算出するための式1を使用してください。この値は、臓器重量によって正規化し、組織のグラム当たりのパーセント注射用量（ すなわち、％のID / g）と報告されています。
    14. 手順に従ってくださいabsenにおける99m Tc で標識テトラジンリガンドを使用して、負の対照実験を行うために2.2.13に2.1.2TCO-BPのCE。犠牲マウス（n = 3）0.5、1、4及び6時間後の注射で、上述したように、組織または流体を得ました。

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結果

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リガンドは、商業的に入手可能なテトラジン22、23製品のカップリング、続いて単純な還元的アミノ化戦略（ 図2）を介して、異なるリンカーおよびキレート剤を用いて合成しました。放射性標識は、全ての化合物のための同様の方法を使用して実行し、高度に再現可能でした。 83％（1）、45％（2）、31％：プロセスは99m Tc で放射性標識化合物は、そこでリガンド、反応時間および温度の量1~5を高い放射化学的収率に適度で得た、pH値を変化させることによって最適化しました（3）、42％（4）、および54％（5）。エバポレーターを用いて、未反応のリガンドおよび蒸発からHPLC精製後、化合物は、注...

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ディスカッション

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変化する極性のテトラジン結合三座キレートのコレクションを調製し、in vivoでの TCO誘導体とIEDDA反応におけるそれらの99m Tc での複合体の有用性を評価しました。効果的かつ再現性の99m Tc で標識法は、リガンド濃度はラベリング工程（化合物2-5） のt-ブチル基の脱保護を行った10 -3 Mであった。5テトラジンキレート、のために開発されました。リガンドの高濃度放射化学的収率を改善し、テトラジン21の劣化を最小限に抑え、反応時間を減少させるために使用しました。製品はすべて持つ> 99％放射化学的純度及び〜1.48 MBqで/μgの高比活性を有する、31から83までパーセントの範囲の放射化学的収率で得られた、非標識リガンドおよびHPLCによる任意の放射化学不純物から分離し、分離しました。すべての化合物は、0を含むPBS中で安定であることが示されました。最大6時間、5％BSA及び0.01％Tw...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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この作業は、カナダの自然科学工学研究評議会（NSERC）、オンタリオがん研究所（OICR, #P.SI.015.8）、およびカナダがん協会（CCS, #703857）からの助成金によって支援されています。著者らは、原稿の準備に協力してくれたDenis Snider博士の貢献に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルゴンガスAlphagaz------
Na2CO3EMD Millipore106395
---Na2B4O7·10H2OアナケミアS9640---
KNaC4H4O6·4H2OAnachemia217255---
Technelite 99mTc generatorLantheus medical imaging---Source of 99mTcO4-
0.9% 生理食塩水Lantheus 医用画像---To 溶出剤
1 M HClLab Chem---
---MeOHCaledon------
ACNCaledon---HPLCグレード
ミリポア H2Oサーモフィッシャーサイエンティフィックバーンステッド Nanopure---
DCMCaledon------TFA
Caledon------
PBSサーモフィッシャーサイエンティフィック10010023pH 7.4 1x
BSAシグマAldrichA7906
---Tween80Sigma AldrichP8047---
イソフルランCDMV108737サプライヤー:Fresenius Kabi Animal Health
HPLCWaters1525バイナリポンプ、2998 Photodioddeアレイ検出器、E-SAT / IN、Bioscan Flowcount PMT検出器(アイテム#15590)---
化合物の分析と精製のためのHPLCカラム 2-4Phenomenex00G-4435-E0ジェミニ® 5 & マイクロ;メートルC18 110 Å, 化合物の分析と精製のためのLCカラム 250 x 4.6 mm
HPLCカラム 1 and 5Waters 186003115XBridge BEH C18 カラム、130 Å、5 µm, 4.6 mm x 100 mm
マイクロ波反応器 バイオテージ イニシエーター 8
---Biotage V10 エバポレーターバイオテージ シリアル#V1041
---DoseキャリブレーターCapintec、Inc. CRC-25R---
ガンマカウンターパーキン・エルマー・ウィザード 1470 自動ガンマカウンター---
動物室内スケール メトラー・トレドXP105 デルタ レンジ---
マイクロ波バイアル バイオテージ 3556290.5-2 mL 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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99m HPLC TCO BP in vivo

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