Bリンパ芽球様細胞株の樹立のためのシンプルな赤血球溶解法

サマリー

B-LCLを確立するための単純な赤血球溶解方法は、少量の血液を必要とし、凍結保存し、開始からの時間を節約し、高い不死化効率で開発されました。

要約

エプスタインバーウイルスによるBリンパ球をin vitroで不死化細胞株に変換するための多くの方法が存在します。私たちは、B-LCLsの確立のための強力でシンプルな戦略を持つ新しい方法、赤血球溶解法を開発しました。この方法は、赤血球の除去を伴うPBMC分離手順を簡素化し、わずか0.5 mLの全血を使用してEBV不死化細胞株を確立することで、比較的短時間で大きな細胞数に増殖し、100%の成功率を達成しました。この方法は、シンプルで信頼性が高く、時間を節約し、多数の臨床サンプルの治療に適用できます。

概要

休息B細胞は、エプスタイン・バーウイルス(EBV)によってin vitroで活発に増殖するBリンパ芽球様細胞株(B-LCL)に形質転換される可能性があります。B-LCLは分化と発生において生殖細胞と類似しており、B-LCLの体細胞突然変異率はわずか0.3%¹であり、遺伝的および表現型の変化はごくわずかでした。したがって、B-LCLは、末梢血単核細胞(PBMC)の代用として、EBV関連疾患のゲノミクス、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクス研究の進歩を大幅に加速させました^2,3。さらに、B-LCLはモノクローナル抗体のスクリーニングにも重要な用途があります^4,5。

EBVによるBリンパ球の不死化のために、いくつかの方法が開発されてきました。最も一般的な手順には、Bリンパ球の単離と、感染性EBVを産生するためのB95-8細胞株の使用が含まれます。分離から変換まで、これらの方法は3つの戦略に分けられます。リンパ球は、密度勾配遠心分離法と直接EBV形質転換によって新鮮血液から分離されます^6-8、この研究では密度勾配分離法と呼ばれます。しかし、他の技術は新鮮な血液を輸送することの困難さを克服し、精製リンパ球を凍結し、その後の融解とEBV感染^9-11のための手順を使用します。凍結保存された全血は、Bリンパ球の単離および形質転換^{にも使用できる12,13}。Bリンパ球を分離するための密度勾配遠心分離に加えて、一部の研究者は磁気セルソーターを使用してBリンパ球^{を選択する12}。しかし、磁気分離は高価で複雑で時間のかかるプロセスです。これらの方法は、Bリンパ球を高い成功率で不死化するのに役立ちますが、多数の臨床サンプルを治療する必要があり、血液の量が比較的少ないため、永久細胞株を確立するためのより簡単な方法が必要です。

あまり使用されていない方法は、EBV感染とB-LCLの確立のための有核細胞の供給源として全血を使用することです。これらの方法は、分離手順を省略することにより、技術を簡素化します。細胞株を得るには、新鮮¹⁴または凍結^15,16のいずれかの少量の全血だけで十分である。残念ながら、ドキュメント^15、16、およびいくつかの検証テストからの成功には大きなばらつきがあります。さらに、形質転換されたコロニーは、大きな汚染不純物のために顕微鏡ではほとんど認識されません。したがって、より信頼性の高い変換方法が必要です。

上記の考察に基づいて、我々はリンパ球の精製を経ずにB-LCLを確立する新しい方法、すなわち赤血球溶解法を開発しました。この方法は便利で、時間を節約し、多数のサンプルに適用できます。わずか0.5mLの全血で、乳幼児や高齢者が健康を著しく損なうことなく簡単に入手できるB-LCLを得るのに十分でした。

プロトコル

本研究では、遺伝学と発生生物学研究所の倫理委員会によって承認され、プロトコルが人間の福祉のための機関のガイドラインに従います。

EBウイルスの調製

1. 1日目に、6 mLのB95-8細胞培養を解凍完全RPMI 1640培地、10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、および抗生物質（100μg/ mLのストレプトマイシン、100 U / mLペニシリン）を補充しT25培養フラスコ。 37℃、5％CO ₂インキュベーター内で培養フラスコを置きます。
2. 2日目に、顕微鏡下で細胞形態を観察します。彼らは明るいとラウンドしているときに細胞が良好な状態です。 10 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。
3. 4日目に、10 mLの新鮮な完全RPMI 1640培地を追加し、T75培養フラスコに移します。
4. 8日目に、20 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。
5. 新鮮な培地、 すなわち 、飢餓を追加せずに8日間細胞を維持します。
6. 16日目に、細胞を観察します顕微鏡下で観察しました。 15 mL遠心チューブ内の細胞を回収し、12ミリリットル/チューブ。
7. 1時間-80℃で凍結保存し、その後急速に37℃で解凍。ウイルス粒子が細胞から放出されるまで3回繰り返します。
8. 室温で10分間、240×gで遠心分離します。
9. -80℃で0.22μmのフィルター、分量、12ミリリットル/チューブ、およびストアを介して上清をフィルタリングします。

赤血球溶解バッファーで全血の2治療

1. 15 mLチューブにEDTA・K ₂によって抗凝固処理された0.5 mLの全血を追加します。
2. 全血に（使用前に0.22μmのフィルターで濾過し、室温に解凍）1 mLの赤血球溶解緩衝液を入れ、よく混ぜます。 4分間、室温で混合物を配置します。停止反応に迅速に7 mLの1×PBS - 次に5を追加します。
3. 室温で5分間、240×gで遠心分離します。白血球は、チューブの底に沈殿します。
4. 上清を捨て、そして7mLの1640塩基性媒体を追加することによって、沈殿を洗います。室温で240×gで5分間遠心します。二回繰り返します。
5. （20％ウシ胎児血清および10μg/ mLのフィトヘムアグルチニン（PHA）を含有するRPMI 1640培地）300μL変換培地中で細胞ペレットを再懸濁します。

3. EBV感染

1. 細胞懸濁液に20μgの/ mLのシクロスポリンA（CSA）の60μLを追加します。
2. 急速に37℃でEBVのアリコートを解凍。細胞懸濁液に240μLEBVを追加します。
3. よく混合し、96ウェルプレートに細胞懸濁液を置き、ウェルあたり200μL。蒸発を避けるために、96ウェルプレートの周りにあらゆるに200μLの1×PBSを追加します。 37℃で5％CO ₂インキュベーターでプレートを置きます。

B-LCLを4.拡大と凍結保存

1. EBV感染後の最初の月に週1回培地の半分を変更します。唯一の厚いレー細胞断片のrは7日目（ 図2）で、顕微鏡下で可視です。 EBV感染の1ヶ月後、リンパ芽球様細胞クラスターは、顕微鏡下で細胞断片の厚い層（ 図2）の下に表示されます。
2. 細胞クラスターは、顕微鏡（ 図2）の下にはっきりと見えるようになるまで、3日毎に培地の半分を変更します。典型的には、このプロセスは、10〜20日を要します。
3. 混合した後、細胞をピペットし、24ウェルプレートに移します。それが黄色に変わりつつ完全RPMI 1640で培養液の量を倍増。このプロセスは、細胞増殖の速度に依存します。
4. 続いて、T25培養フラスコに細胞を移します。 15 mLの - 媒体の体積が10に展開するまで、それが黄色に変わりとして、培地の量を2倍になります。
5. 凍結前媒体24時間を変更します。 240×gで5分間遠心細胞懸濁液。細胞カウンターで細胞をカウントし、5の密度で凍結- FRで10×10 ⁶ / mLの90％のFBS、10％ジメチルスルホキシド（DMSO）を含むozenストック溶液。 -80℃まで毎分1℃の速度で凍結した後、液体窒素に直接転送します。

5. 3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）アッセイ¹⁷

1. 10％ウシ胎児血清を含む1640培地でB-LCLを単一細胞懸濁液を調製します。シード3×10 96ウェルプレート上にウェルあたり⁴細胞、ウェルあたり100μL。
2. 16時間- 12、37℃で5％CO ₂インキュベーターでプレートを置きます。
3. 細胞が成長しているウェルにMTT（5 mg / mlで）を追加し、37℃で4時間光から遠ざけます。
4. 168×gで10分間遠心分離セルプレート。
5. 上清を除去し、ウェルあたり100μLのDMSOを追加します。
   注：注意してください。針状の染料結晶を触れないでください。
6. 完全に結晶を溶解するために、低速で10分間プレートを振ります。
7. により570 nmで測定吸収マイクロプレート分光光度計を使用して。

結果

変換プロセスの間、細胞の形態学的変化は、光学顕微鏡（ 図2）によって可視化されます。細胞の小さなクラスターは、細胞断片のみ厚い層が、感染の7日後に密度勾配分離法ではっきり見えた赤血球溶解法から見えます。しかし、リンパ芽球様細胞クラスターは30日、感染後細胞断片の厚い層の下に表示されます。より頻繁な培地交換して、細胞破片を減少し、細胞クラスターは明確に視認され、密度勾配分離法によって確立された同じ画像を提示します。

細胞株は正常に確立されたときに、MTTアッセイは、B-LCLをの生存率を評価しました。文献¹⁷によれば、異なる方法によって確立されたB-LCLを、細胞の生存率および16を検出するために選択しました。40培地をブランク対照として使用しました。データは、赤血球の溶解法で確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法（ 図3）からB-LCLをの細胞生存率よりも...

ディスカッション

我々は、赤血球を溶解することによって、全血からのヒトB細胞を不死化するための新規な方法の開発を報告し、そして確立されたB-LCLを、その細胞生存率をMTTアッセイにより評価しました。結果は、赤血球溶解法により確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法よりもはるかに高いことが示されました。赤血球溶解法の主な利点は、簡単であり、高い成功率と高い細胞生存率と永久細胞株を確立するための血液（0.5mLのわずかなど）少量を必要とすることです。

一つだけの単純な溶解工程は、EBV感染の前に必要とされています。リンパ球の前精製することなく、細胞の喪失および細胞の損傷が回避されます。密度勾配分離法の別の障害は、溶血です。 WH、不適切な温度での長期保存後の血液を処理し、輸送中の揺れは、溶血につながる可能性がありICH大幅リンパ球の分離に影響を与えます。他の研究は、赤血球（RBC）溶解の使用は^、18およびリンパ球のサブタイプは、実質的に¹⁹の影響を受けなかった密度勾配分離法を使用するよりも、生存PBMCの高い数をもたらしたことを示しました。費用がかかり...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Centrifuge	Techcomp	CT6T	Centrifugation
Automated Cell Counter	カウンティスター	IC 1000	セルカウント用
エポック マイクロプレート 分光光度計	BioTek 機器		SN263839 吸光度を測定するため
96 ウェル 細胞培養クラスター	コーニング	3599	ポリスチレンプレート
24 ウェル細胞培養クラスター	コーニング	3524	ポリスチレンプレート
25 cm2 細胞培養フラスコ	ネスト	707001	ポリスチレン
FBS	Gibco	10270	B-LCLs中程度のコンポーネント
RPMI中 1640	Gibco	31800-022	B-LCLs中程度
-グルタミン用	Amresco	0374	B-LCLs中
100倍ストレプトマイシンペニシリン溶液BioRoYeeBRY-2309	BioRoYee	BRY-2309	B-LCLs中速
Ficoll paqueプラス	GEの成分 ヘルスケア	17-1440-03	リンパ球のin vitro単離用
PHA-M	Sigma	L8902	リンパ球の増殖を刺激するため
シクロスポリンA	ケイマン 化学	12088	T細胞の細胞毒性効果を阻害するため
赤血球溶解バッファー	Tiangen	RT122-01	赤血球の溶解用
MTT	Amresco	0793	細胞生存率の検出用
DMSO	Sigma	D2650	細胞の凍結用