B-LCLを確立するための単純な赤血球溶解方法は、少量の血液を必要とし、凍結保存し、開始からの時間を節約し、高い不死化効率で開発されました。
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この記事について
サマリー
要約
エプスタインバーウイルスによるBリンパ球をin vitroで不死化細胞株に変換するための多くの方法が存在します。私たちは、B-LCLsの確立のための強力でシンプルな戦略を持つ新しい方法、赤血球溶解法を開発しました。この方法は、赤血球の除去を伴うPBMC分離手順を簡素化し、わずか0.5 mLの全血を使用してEBV不死化細胞株を確立することで、比較的短時間で大きな細胞数に増殖し、100%の成功率を達成しました。この方法は、シンプルで信頼性が高く、時間を節約し、多数の臨床サンプルの治療に適用できます。
概要
休息B細胞は、エプスタイン・バーウイルス(EBV)によってin vitroで活発に増殖するBリンパ芽球様細胞株(B-LCL)に形質転換される可能性があります。B-LCLは分化と発生において生殖細胞と類似しており、B-LCLの体細胞突然変異率はわずか0.3%1であり、遺伝的および表現型の変化はごくわずかでした。したがって、B-LCLは、末梢血単核細胞(PBMC)の代用として、EBV関連疾患のゲノミクス、トランスクリプトミクス、およびプロテオミクス研究の進歩を大幅に加速させました2,3。さらに、B-LCLはモノクローナル抗体のスクリーニングにも重要な用途があります4,5。
EBVによるBリンパ球の不死化のために、いくつかの方法が開発されてきました。最も一般的な手順には、Bリンパ球の単離と、感染性EBVを産生するためのB95-8細胞株の使用が含まれます。分離から変換まで、これらの方法は3つの戦略に分けられます。リンパ球は、密度勾配遠心分離法と直接EBV形質転換によって新鮮血液から分離されます6-8、この研究では密度勾配分離法と呼ばれます。しかし、他の技術は新鮮な血液を輸送することの困難さを克服し、精製リンパ球を凍結し、その後の融解とEBV感染9-11のための手順を使用します。凍結保存された全血は、Bリンパ球の単離および形質転換にも使用できる12,....
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プロトコル
本研究では、遺伝学と発生生物学研究所の倫理委員会によって承認され、プロトコルが人間の福祉のための機関のガイドラインに従います。
EBウイルスの調製
- 1日目に、6 mLのB95-8細胞培養を解凍完全RPMI 1640培地、10％ウシ胎児血清、2mM L-グルタミン、および抗生物質（100μg/ mLのストレプトマイシン、100 U / mLペニシリン）を補充しT25培養フラスコ。 37℃、5％CO 2インキュベーター内で培養フラスコを置きます。
- 2日目に、顕微鏡下で細胞形態を観察します。彼らは明るいとラウンドしているときに細胞が良好な状態です。 10 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。
- 4日目に、10 mLの新鮮な完全RPMI 1640培地を追加し、T75培養フラスコに移します。
- 8日目に、20 mLの完全RPMI 1640培地を追加します。
- 新鮮な培地、 すなわち 、飢餓を追加せずに8日間細胞を維持します。
- 16日目に、細胞を観察します顕微鏡下で観察しました。 15 mL遠心チューブ内の細胞を回収し、12ミリリットル/チューブ。
- 1時間-80℃で凍結保存し、その後急速に37℃で解凍。ウイルス粒子が細胞から放出されるまで3回繰り返します。
- 室温で10分間、240×gで遠心分離します。
- -80℃....
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結果
変換プロセスの間、細胞の形態学的変化は、光学顕微鏡（ 図2）によって可視化されます。細胞の小さなクラスターは、細胞断片のみ厚い層が、感染の7日後に密度勾配分離法ではっきり見えた赤血球溶解法から見えます。しかし、リンパ芽球様細胞クラスターは30日、感染後細胞断片の厚い層の下に表示されます。より頻繁な培地交換して、細胞破片を減少し、細胞クラスターは明確に視認され、密度勾配分離法によって確立された同じ画像を提示します。
細胞株は正常に確立されたときに、MTTアッセイは、B-LCLをの生存率を評価しました。文献17によれば、異なる方法によって確立されたB-LCLを、細胞の生存率および16を検出するために選択しました。40培地をブランク対照として使用しました。データは、赤血球の溶解法で確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法（ 図3）からB-LCLをの細胞生存率よりも.......
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ディスカッション
我々は、赤血球を溶解することによって、全血からのヒトB細胞を不死化するための新規な方法の開発を報告し、そして確立されたB-LCLを、その細胞生存率をMTTアッセイにより評価しました。結果は、赤血球溶解法により確立B-LCLをの細胞生存率は、密度勾配分離法よりもはるかに高いことが示されました。赤血球溶解法の主な利点は、簡単であり、高い成功率と高い細胞生存率と永久細胞株を確立するための血液（0.5mLのわずかなど）少量を必要とすることです。
一つだけの単純な溶解工程は、EBV感染の前に必要とされています。リンパ球の前精製することなく、細胞の喪失および細胞の損傷が回避されます。密度勾配分離法の別の障害は、溶血です。 WH、不適切な温度での長期保存後の血液を処理し、輸送中の揺れは、溶血につながる可能性がありICH大幅リンパ球の分離に影響を与えます。他の研究は、赤血球（RBC）溶解の使用は、18およびリンパ球のサブタイプは、実質的に19の影響を受けなかった密度勾配分離法を使用するよりも、生存PBMCの高い数をもたらしたことを示しました。費用がかかり.......
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開示事項
著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。
謝辞
この作業は、中国科学院（KFZD-SW-205）の主要なプロジェクト、中国科学院の戦略的生物資源技術支援システム（CZBZX-1）によって支援されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Centrifuge | Techcomp | CT6T | Centrifugation |
| Automated Cell Counter | カウンティスター | IC 1000 | セルカウント用 |
| エポック マイクロプレート 分光光度計 | BioTek 機器 | SN263839 吸光度を測定するため | |
| 96 ウェル 細胞培養クラスター | コーニング | 3599 | ポリスチレンプレート |
| 24 ウェル細胞培養クラスター | コーニング | 3524 | ポリスチレンプレート |
| 25 cm2 細胞培養フラスコ | ネスト | 707001 | ポリスチレン |
| FBS | Gibco | 10270 | B-LCLs中程度のコンポーネント |
| RPMI中 1640 | Gibco | 31800-022 | B-LCLs中程度 |
| -グルタミン用 | Amresco | 0374 | B-LCLs中 |
| 100倍ストレプトマイシンペニシリン溶液BioRoYeeBRY-2309 | BioRoYee | BRY-2309 | B-LCLs中速 |
| Ficoll paqueプラス | GEの成分 ヘルスケア | 17-1440-03 | リンパ球のin vitro単離用 |
| PHA-M | Sigma | L8902 | リンパ球の増殖を刺激するため |
| シクロスポリンA | ケイマン 化学 | 12088 | T細胞の細胞毒性効果を阻害するため |
| 赤血球溶解バッファー | Tiangen | RT122-01 | 赤血球の溶解用 |
| MTT | Amresco | 0793 | 細胞生存率の検出用 |
| DMSO | Sigma | D2650 | 細胞の凍結用 |
参考文献
- Mohyuddin, A., et al. Genetic instability in EBV-transformed lymphoblastoid cell lines. Biochim Biophys Acta. 1670 (1), 81-83 (2004).
- Hu, V. W., Frank, B. C., Heine, S., Lee, N. H., Quackenbush, J.
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再版と許可
