Method Article

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

DOI:

10.3791/55204

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February 24th, 2017

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1Institute of Physiology I, University of Bonn

In This Article

Summary

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心筋細胞の細胞分裂と細胞周期の変動を区別するために、私たちは2つのトランスジェニックマウス系統を使用したプロトコルを提示します:Myh6-H2B-mChトランスジェニックマウスは、心筋細胞の核を明確に識別し、CAG-eGFP-アニリンマウスは細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのものです。

Abstract

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心筋細胞は、エンドリデューション(核分裂や細胞質分裂を伴わないDNA合成の継続)や無細胞動態性有糸分裂(核分裂はあるが細胞質分裂はしない)など、細胞周期の変動を起こしやすいです。このような非定型的な細胞周期の変動は、細胞分裂ではなく、倍数体細胞や多核細胞をもたらします。したがって、心臓の代謝回転と再生を決定するためには、心筋細胞の核、細胞あたりの核の数、およびそれらの細胞周期の状態を正しく特定することが非常に重要です。これは、チミジン類似体Ki-67、PCNA、pHH3などの細胞周期活性を同定するための核マーカーの使用に特に当てはまります。ここでは、心筋細胞とその核性を認識し、その細胞周期活性を決定する方法を紹介します。私たちは、心筋細胞の核を明確に同定するためのMyh6-H2B-mChトランスジェニックマウス系統と、細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのCAG-eGFP-アニリンマウス系統の2つの公開トランスジェニックシステムを使用しています。これら2つのシステムを組み合わせることで、心臓の再生と可塑性の研究が容易になります。

Introduction

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心筋細胞の核および細胞周期の状態の正確な同定は、心筋の代謝回転および再生の決意するための極めて重要です。これは、細胞周期活性を同定するための、そのようなpHH3、のKi-67、またはチミジン類似体のような核マーカーの使用のために特に当てはまります。哺乳類成体心筋細胞の増殖能が1非常に小さいので、心筋細胞核の増殖マーカーについて陽性の核の偽の身分証明書は、増殖アッセイの結果で決定的な違いを作ることができます。また、心筋細胞は倍数体および多核細胞ではなく、細胞分裂につながるような核内倍加およびacytokinetic有糸分裂などの細胞周期の変化、になりやすいです。この目的のために、一般的な細胞周期マーカーに対する抗体染色の解釈は、全ての場合において決定的ではありません。

ここで、我々は、直forwaのための方法を提示します RDマウス心筋細胞の認識とそれらの核の明確な同定により生後および成体の段階でネイティブ単離された細胞と厚い組織切片でのnuclearity。そのために、MYH6プロモーターの制御下にヒトヒストンH2BおよびmCherryをからなる融合タンパク質（MYH6-H2B-MCH）の心筋細胞特異的発現を有するトランスジェニックマウス系統は、2を使用しました。 、のeGFP-anillin融合タンパク質の発現は、CMVエンハンサー（CAG-EGFP-anillin）....

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Protocol

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動物を含むこのプロトコルのすべての手順は、ボン大学の倫理基準に従ったし、科学的な目的のために使用される動物の保護に関する指令2010年欧州議会の/ 63 / EUからのガイドラインに準拠します。

生後心筋細胞における細胞周期活性のin vitro可視化1.

  1. 生後心筋細胞解離
    1. 予備実験の準備
      1. 培地（IMDM、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、1％非必須アミノ酸、0.1％βメルカプトエタノール）を調製。培地1：2％にFCSを追加します。媒体2：20％のFCSを追加します。
      2. コート96ウェル培養皿（半成長面積15 平方ミリメートル）のPBS溶液中の0.1％ゼラチンです。
    2. ハート解剖
      1. PBS 15mLでペトリ皿を準備し、氷の上に保管します。乾燥したガラスビーズ滅菌器に入れることにより、2つのピンセットと小さなハサミを滅菌します。
      2. 断頭により新生児トランスジェニックマウス（CAG-EGFP-anillin / MYH6-H2B-MCH）を生け贄に捧げます。 Ehler らに記載されているように、心を解剖、胸部を開きます。 、2013（Jヴィス経験.;（79）：50154 DOI：10.3791 / 50154）、および氷冷PBSに転送します。次のマウスに移....

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Results

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in vitroでの出生後の心筋細胞の細胞周期活性に対するsiRNAを/ miRNAの効果を分析するために、二重トランスジェニックMYH6-H2B-MCH / CAG-EGFP-anillinマウスの心筋細胞は、生後3日目（P3）で単離し、でトランスフェクトしました細胞周期活性誘導miR199 5は、siRNA P27、およびsiRNA Fzr1。陰性対照（ 図1A）と比較して、miR199-（ 図1B）およびsiRNA p27-（ 図1C）の写真は、心筋細胞が細胞周期活性の誘導を示すトランスフェクトしました。 Fzr1の阻害がトランスフェクトされた細胞の核内でのeGFP-anillin融合タンパク質の蓄積をもたらし、Fzr1の損失がAPCの阻害をもたらすようにeGFP-anillinマウスモデルにおいて、Fzr1に対するsiRNAは、トランスフェクションコントロールとして使用することができます.......

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Discussion

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心筋細胞は、細胞周期を再入力し、損傷後や組織の恒常性の間に分割することができるかどうかをめぐる論争があります。心筋細胞の基本的な売上高の値は1％1と80％7の範囲で与えられています。 40％7 - 、心臓病変後、細胞周期活性の誘導および新しい心筋細胞の生成は、0.0083％〜8と25の間の値と、境界域で報告されています。これらの不一致は、部分的に心臓の核を同定するための異なる実験的アプローチ、9組織切片の細胞分裂の間に非常に困難なプロセスによって説明することができます。心筋細胞は、細胞周期の変動を受けやすいように、倍数体および多核細胞をもたらす核内倍加およびacytokinetic有糸分裂、より本格的な細胞分裂を区別するために決定的に重要です。ために細胞分裂の同定は、そのような収縮リングとmidbodiesなどの細胞分裂の特徴を視覚化するだけでなく、二核心筋細胞のパーセンテージを決定する必要があります.......

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Disclosures

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

Acknowledgements

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技術支援について、S. Grünberg氏(ドイツ、ボン)とP. Freitag氏(ドイツ、ボン)に感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10cmシャーレSarstedt821472
100 µm セルストレーナーBecton Dickinson GmbH/Falcon352360
2,3-ブタンジオン一基 (BDM)Sigma-AldrichB0753
G20x1 ½ 注射カニューレ、ステリカンブラウン、メルズンゲン 4657519
20 ゲージ針ベクトン ディキンソン GmbH301300
24 ウェル プレートベクトン ディキンソン GmbH/ファルコン353047
2-メチルブタンCarl Roth GmbH + Co. KG3927.1
37%ホルムアルデヒド溶液AppliChem GmbH A0936,1000
三方活栓B. Braun Medical Inc.16494C
50 mLシリンジB. Braun Medical Inc.8728810F
70% エタノールOtto Fischar GmbH27669
Alexa-Fluor-conjugated secondary antibodyJackson ImmunoResearch115-605-205
α-Aktinin EA-53, Mouse IgGSigma-Aldrich, SteinheimA7811
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Cell Culture Microplate, 96 Well,Half AreaGreiner bio-one675986
Collagenase BRoche11088815001
共焦点顕微鏡 Eclipse Ti-ENikon
cryostat CM 3050SLeica
donkey serumJackson Immuno Research, Suffolk, GB017-000-121
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD8537
EDTASigma-AldrichE4884
子牛胎児血清PromoCell、ハイデルベルク
ホルムアルデヒド溶液 (4%)PanReac AppliChemA3697
豚皮からのゼラチン、タイプ ASigma-Aldrich、SteinheimG2500
ガラス カバースリップVWR631-0146
グルコースSigma-AldrichG7021
ハイデルベルガー延長管IMPROMEDIFORM GmbHMF 1833
Heparin-NatriumRatiopharm5394.02.00
HEPESSigma-AldrichH3375
HistoBond 顕微鏡スライドMarienfeld0810000
Hoechst 33342 (1 mg/mL)Sigma Aldrich, TaufkirchenB2261
インスリン注射器Becton Dickinson GmbH300334
Iscove'ModifiedDulbecco's Medium (IMDM)Gibco/Life Technologies, Darmstadt21980-032
KClSigma-AldrichP9333
LamininCorning354221
Laser Scanning Mikroskop Eclipse TiNikoninstruments, Düsseldorf
Lipofectamine RNAiMAXInvitrogen/Life Technologies, Darmstadt13778075
Mouse IgG Cy5 (donkey)Jackson ImmunoResearch715-175-151
MgCl2Sigma-AldrichM8266
微量遠心チューブSarstedt72690
Mini shakerVWR12620-940
mirVana miRNA mimic, has-miR199a-3pAmbion/Thermo Fischer Scientific4464066
Biopsy MoldSakura Finetek/ VWR4565
M-slide 8-well ibiTreatibidi80826
NaClSigma-AldrichS9888
NaOHMerck Millipore567530
ネガティブcontrol(scrambled RNA)Ambion/Thermo Fischer ScientificAM4611
Neonatal Heart Dissociation KitMiltenyi Biotech, Bergisch Gladbach130-098-373
NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bitNikoninstruments, Düsseldorf
Non-essential amino acids, NEAAGibco/Life Technologies, Darmstad11140-035
Opti-MEM, Reduced Serum MediumGibco51985-026
P21-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
P27-siRNAAmbion/Thermo Fischer Scientific4390771
ペニシリン/ストレプトマイシンGibco/Life Technologies, Darmstadt15140-122
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-Aldrich, Steinheim14190-094
ポリビニルアルコール封入剤 DABCO®, antifadingSigma-Aldrich10981
RNase AQiagen1007885
RNaseZapInvitrogen/Life Technologies, DarmstadtAM9780
サンプルコンテナVitlab80731
セロジカルピペットGreiner607180
ソフトウェア NIS ElementsNikon
スクロースSigma-AldrichS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakura Finetek/ VWR25608-930
ToPro3 ヨウ化物 (642/661)分子プローブ/ThermoFisher ScientificT3605
TrisSigma-AldrichT1503
Triton XFluka93418
Triton X-100Fluka93418
TrypsinSigma-AldrichT1426
小麦胚芽凝集素(WGA) フルオレセイン標識Vector LaboratoriesVEC-FL-1021-5
&α;-アクチニン抗体Sigma-AldrichA7811
&β;-メルカプトエタノールSigma-Aldrich, SteinheimM3148

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell ....

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