ここでは、正常な発達を乱すことなく、生きたゼブラフィッシュの胚の後部体の発達を長期間のタイムラプスイメージングを可能にする汎用性の高いマウント方法を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
ゼブラフィッシュの胚は、アクセシビリティと光透過性の容易さのために複雑な形態形成過程を研究するための理想的な実験系を提供しています。具体的には、後部ボディ伸びは、複数の組織変形が体軸の大部分の形成を指示するために一緒に作用することにより、胚発生に不可欠なプロセスです。長期タイムラプス撮影することによって、このプロセスを観察するためには、十分な支持を顕微鏡及び取得に転送中に正しい方向で試料を維持することを可能にする実装技術を利用する必要があります。また、実装は、その正常な発達に影響を与えることなく、後部ボディ領域の伸長のための運動の十分な自由度を提供しなければなりません。最後に、多様なイメージング・セットアップにイメージングを可能にするために、実装方法の汎用性がある程度存在しなければなりません。ここでは、後部本体の開発を画像化するための実装技術を提供elongatioゼブラフィッシュD.レリオ中のn。この技術は、細長く、正常に発育する後部ボディ領域を残して、ヘッドと卵黄嚢の領域をほぼ完全にアガロース中に含まれるように胚をマウントすることを含みます。これは、直立反転および垂直光シート顕微鏡セットアップのために適合させることができる方法を紹介します。このプロトコルは、後部ボディ用イメージングのための胚をマウントするに焦点を当てているが、それは簡単にゼブラフィッシュの開発のさまざまな側面のライブイメージングのために適合させることができます。
概要
後部ボディ伸びが胚体軸の大部分を形成するように延びていることにより、胚発生に不可欠なプロセスです。これは、複数の細胞の挙動は、個々の組織のレベルでの形態形成を生成するために協調的に作用することにより、複雑な形態形成過程の一例です。これらの差動組織変形は、その後、構造全体のレベルで後部本体の伸長を生成するために一緒に働きます。これらのプロセスが制御され、現像時に調整されている方法を理解するために、我々は（分子、細胞、細胞集団と組織のレベルでIE）複数のスケールで、これらのプロセスに従うことができなければならず、全体の構造の形態形成に直接これを関連付けること。
その光学的透明性と小さなサイズは、最小侵襲性光イメージングのアプリケーションを可能にするようゼブラフィッシュの胚は、LIVによく適して近づいイメージング後部本体の伸長のために理想的です電子イメージング。 1これは、分子のレベル、2単セルで、3と間組織行動、4だけでなく、細胞集団全体の臓器のレベルで後部本体の開発に光を当てるしている最近の一連の刊行物によって証明されています。 5
このような共焦点、多光子顕微鏡法およ....
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プロトコル
1.溶液の調製とプルガラスニードル
- 20 mMトリスpHを8.8に4ミリグラム/ mLでトリカイン（3-アミノ安息香酸エチルエステルとも呼ばれる3-アミノ安息香酸エチル）の25倍ストック溶液を作成し、そのソリューションはpHである4 mLおよび店舗7.小分けに持ち込みます-20℃。
注：麻酔トリカイン、それによって筋肉のけいれんや運動6を遮断する神経電位依存性ナトリウムチャネルに優先的に作用します。 - E3胚培地中0.17ミリグラム/ mlの最終濃度でトリカインの作業溶液を作ります。 7
注：この溶液のpHが漂うとして即時作業溶液トリカインしてください。 - 電子レンジ内の溶液を加熱して50 mLチューブ中のE3胚培地中1.5％の最終濃度を低融点アガロースを溶解します。水浴またはベンチトップインキュベータのいずれかで45℃ - このソリューションは42に平衡化してみましょう。垂直のための大規模な料理を準備している場合光シートイメージング（ステップ4）、アガロースE3胚培地に1％の標準的な融解の追加の25mLのを作ります。
- OD 1.20ミリメートル、ID 0.69ミリメートル、長さ10mmの寸法のフィラメント毛細血管にホウケイ酸ガラスを使用してください。
- 毛細血管は、
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結果
上記で概説したプロトコルは、長期的タイムラプスイメージングのためのゼブラフィッシュ胚の取り付けのための多目的な技術を詳しく説明しています。この例は、図2Aおよびアニメーション/ビデオ図1に示されています。胚は、mRNAがphotoconvertible蛍光タンパク質kikumeGRをコードすると1細胞期で注入しました。上記のように15体節段階でそれらをマウントし、10倍の対物レンズとの倒立型共焦点顕微鏡上で12時間、撮像されました。示すように、得られた共焦点スタックが最大限に表示されるように投影されました。この映画は、明らかに、後方本体が映画の存続期間全体にわたって自由に移動させ、通常の培養条件で自由に絨毛膜を開発することが許可されている胚に見られる形態の類似の変化を示していることを示しています。
さらなる例は、Fのigure 2bに示されていますそし.......
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ディスカッション
この実装技術は、胚は、顕微鏡、複数の長さスケールで後部ボディ伸びを以下のことを目的としたオーバー長期的タイムラプスイメージング実験への転送中に静止保持することができます。それは両方の直立および反転の顕微鏡セットアップのイメージングを可能にし、提案が、これはさらに垂直に向けSPIMに適合させることができる方法のために作られているという点でまた、多目的です。
このプロトコルでの重要なステップは、この構造の正常な発達を可能にするために重要である後部本体を囲む過剰アガロースを慎重に除去することです。卵黄の上部の周囲アガロースを削除する場合は特に、胚にダメージを与えないで、ここで世話をすることが重要です。時にはこのプロセス中に型から胚を失うことが可能であるように、胚の周りからカットアガロースブロックを取り外す際に加えて、注意が必要です。これらの理由から、これは、低スループット法THAでありますtは対照的に、既に3Dプリントプラスチック金型を利用する方法を公開するために、同時に多くのゼブラフィッシュ胚の実装に適していません。
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
Estelle Hirsinger: パスツール研究所と国立研究庁からのコア資金 (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS)。エステル・ヒルシンガーは、国立科学研究センター(CNRS)の出身です。ベンジャミン・スティーブントンは、Agence Nationale de la Recherche(ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS)から資金提供を受け、その後、Rouxフェローシップ(Institut Pasteur)、AFM-Téléthonフェローシップ(番号16829)を受けました。彼は現在、ウェルカム・トラスト/王立協会のヘンリー・デール・フェローシップの支援を受けています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 消耗品 | |||
| ガラス底皿 | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mmシャーレ、10 mmマイクロウェル。No.1.5 |
| 注射針用カバーガラスキャピラリー | サッター | BF 120-94-10 | フィラメント、外径1.20 mm、内径0.94 mm、長さ10 cmのオロケイ酸ガラスを使用しています。ただし、フィラメント針は必要なく、ほとんどの注射用標準針は機能するはずです。 |
| マイクロメス | ザー | P-715 | マイクロフェザー使い捨て眼メス、プラスチックハンドル付き |
| パスツールピペット | 230mm<ロング | ||
| >試薬/ | |||
| トリカイン | シグマ-アルドリッチ | A5040 | |
| 低融点アガロース | シグマ-アルドリッチ | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| fine鉗子 | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | デュモン #5 |
| ニードルプラー | サッター | P97 | 加熱フィラメントニードルプラー |
| 双眼解剖顕微鏡 | ライカ | S8 Apo |
参考文献
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmen....
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再版と許可
