走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

サマリー

このレポートは、厚い生体試料の走査型透過型電子トモグラフィーを実施するための試料調製プロトコルと特定のイメージング条件について説明しています。

要約

この報告は、走査型透過電子顕微鏡を使用してさらに観察するための厚い生物学的試料を準備するためのプロトコルについて説明しています。また、走査型透過型電子トモグラフィーにより、厚い生体試料の3次元構造を研究するイメージング方法についても説明します。サンプル調製プロトコルは、サンプルを化学薬品を使用して固定し、重原子塩造影剤で処理し、一連のエタノール浴で脱水し、樹脂に埋め込むという従来の方法に基づいています。次に、走査型透過型電子顕微鏡で厚い試料を観察するための具体的なイメージング条件について説明します。サンプルのセクションは、さまざまな焦点面でいくつかの画像を収集することを含むスルーフォーカス法を使用して観察されます。これにより、サンプル全体のさまざまな高さで焦点が合った情報を回復できます。この特定の収集パターンは、断層撮影データ収集中に各傾斜角度で実行されます。その後、1つの画像が生成され、すべての異なる焦点面からのピントの合った情報がマージされます。その後、従来の傾斜シリーズ データセットが生成されます。この方法の利点は、チルトシリーズのアライメントと再構築を標準ツールを使用して実行できることです。焦点を合わせた画像のコレクションにより、焦点が合ったサンプルの構造詳細をすべて含む3Dボリュームを再構築できます。

概要

1970年代初頭以来、断層撮影法は、広く、生物学的標本^1、2、3の構造の特徴付けのために使用されてきた透過型電子顕微鏡（TEM）に近づきます。透過型電子断層撮影法の魅力は、細胞の構造および細胞小器官の超微細構造の巨大分子複合体およびタンパク質の構造に、ナノメートルスケールでの生物学的構造の広い範囲を研究するために使用することができるということでした。それにもかかわらず、透過型電子断層撮影法は、非常に厚い試料（0.5μm以下）を研究するために使用することができませんでした。実際、厚い標本は、低い信号対雑音比（SNR）の画像を生成し、あまりにも多くの散乱電子を生成します。さらに、断層撮影法は、試料の見かけの厚さが、傾斜角の増加と共に、傾斜片の画像のコレクションを含みます。非弾性散乱をフィルタリングすることができるにもかかわらずエネルギーフィルタを用いて、高SNR画像のために必要な電子の臨界量はほとんどTEMに達しました。したがって、厚い生体試料は、わずか^4を区画用いて研究されてきました。

それらが切断されたときにいくつかが低下する可能性があり、他はその複雑さを理解するために、その全体で検討する必要がありますいくつかのサンプルをスライスすることはできません。別のアプローチは、走査モード^{5、6、7、8}のTEMを使用することです。透過電子顕微鏡（STEM）の走査において、電子の光路は、従来のTEMと異なります。弾性散乱ものは暗視野（DF）検出器を光軸からある角度で収集することができ、一方、散乱せずに試料を通過する電子は、明視野（BF）検出器⁹との光軸上に集めることができます。STEMの他の利点は、集束電子ビームは、画像のピクセルごとの収集を可能にする、試料の表面で走査されることです。サンプル¹⁰を通過しながら電子ビームを広げても、この特定の収集方式は、従来のTEMより非弾性散乱電子の影響を受けにくいです。また、これにより、TEMで発生する可能性が色収差を回避STEMにはレンズ後の試料​​は、ありません。 BF検出器は、主に非散乱電子を検出するようにカメラの長さを調整することができます。厚い試料を研究するためにDF検出器を使用することであるため、不正確な画像を生成する多重散乱、お勧めできません。代わりに、BF検出器^11を使用することができます。 STEMは、高SNR画像を生成することができるが、それは厚いから回収することができる詳細な情報の量を減少させる、ためTEMに比べて比較的高いビーム収束比較的低い被写界深度を有します標本。フォーカスされている情報は、わずか数ナノメートルの焦点面に由来するように、輻輳角は30ミリラジアンと高くすることができ、収差補正STEM顕微鏡の場合には、被写界深度が十分に低くすることができ。パラレルモードでは、電子ビームを設定する分解能¹²の犠牲に被写界深度電子ビームを高めます。しかし、この設定は常に可能ではありません。

それは収束電子ビームを使用する必要があるたびに厚い試料を研究するとき、人は被写界深度電子ビームを高める技術を使用しなければなりません。最近の研究では、合焦情報^13、14の最大量を回収するために、試料の様々な焦点面における複数の画像の取得を報告しています。二つの研究は、異なる焦点面からの情報を処理するためのさまざまな方法について説明します。ホーブデンら。様々な焦点面で収集した画像は、フーリエ空間で組み合わせ、最終再構成^13を変換次元逆フーリエ変換から直接得ました。対照的に、ダーメンら。実空間内の様々な焦点面¹⁴から3Dボリュームを再構成する収束ビーム再構成エンジンを開発しました。私たちの研究室でも厚い生物学的標本を画像化するための方法を開発しました。当社の戦略は、我々は、様々な焦点面にフォーカスされている情報をマージして平行ビームプロジェクター^15を用いて、実空間での最終3Dボリュームを再構築し、その中に上記の二つの方法は異なっていました。私たちの目的は、簡単に任意の電子顕微鏡研究室で行うことができる方法を開発することでした。この目的のために、我々は、従来の断層撮影実験の時間枠に相当する時間の限られた量で焦点画像を収集することを目的としました。また、提案手法のC整列および再構築ソフトウェアの異なるタイプで使用するために適合されウルド。

2015年¹⁵から私たちの出版物の文脈において、我々は、被写界深度の回復を可視化し、特徴づけるために望んでいたので、私たちは25 mradでの大規模な収束半角を使用しました。ここでは、2015年¹⁵で私たちの研究室で開発された方法に従って、STEMにスルー焦点イメージングを実行するためのステップバイステップのプロトコルを提示し、我々は2015年からのデータが処理された方法を提示します。この方法は、厚さ（750 nm）の生物学的サンプル中の複数の焦点面からの合焦情報を回復し、高品質の3D再構成を可能にします。該当する場合、他のグループによって使用される方法に対するこの方法論の違いも提示されています。

プロトコル

注意：それらを使用する前に、種々の試薬の物質安全データシート（MSDSの）を参照してください。試料調製の際に使用される化学物質のいくつかは、毒性発がん性、変異原性、および/または生殖毒性です。サンプルの処理中にヒュームフードの下で個人用保護具（手袋、白衣、完全長ズボン、およびクローズドつま先の靴）とワークを使用してください。ウルトラミクロトームで試料を区画することは鋭利な器具の使用を含む、およびこれらのツールを慎重に使用することは必須です。以下に説明する手順では、著者らは、試料は、細胞培養サンプルであると仮定する。プロトコルは、サンプルの種類、特に遠心分離工程に応じて変更される必要があり得ます。

緩衝剤およびそれらの混合物の調製

1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液（137mMの塩化ナトリウム、2.7mMの塩化カリウム、10mMののNa ₂ HPO _4、および1.76 mMのKH ₂ PO _4）を調製。
2. 30％、50％、70％等を含有する溶液を調製しますサンプル脱水のためにPBS中hanol。徐々にエタノール濃度を増加させ、サンプルをインキュベートすることにより、試料の脱水を実行します。
3. （ビスフェノールA-（エピクロルヒドリン）（20mL）中、ドデセニル無水コハク酸（9 mL）を、メチル-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボン酸（11 ml）を混合することによりエポキシ樹脂を準備し、そして2,4,6-トリスジメチルアミノメチル）フェノール（0.7 mL）を、他の混合比は、樹脂の所望の硬度に応じて使用することができます。
4. サンプル埋め込みエタノール中30％、50％、及び70％のエポキシ樹脂を含む溶液を準備します。徐々に樹脂の濃度を増加させて試料をインキュベートすることによって、樹脂の埋め込みを行います。
   注：調製した溶液の体積が検討されているサンプルの種類によって異なります。以上の溶液は、細胞培養のためのより組織のために必要とされます。

サンプルの2.固定および着色

1. 遠心分離機5000×gで5分間、細胞培養。同じ条件を用いて、以下の遠心分離のすべてを実行します。
2. 上清を捨て、4％パラホルムアルデヒドおよび2％グルタルアルデヒドを含むPBS（1mL）にそれを再懸濁することにより細胞ペレットを修正。 30分（ 図1A）、室温で静置します。代わりに、一晩または週末の間、4℃で細胞を固定。
3. 遠心分離後、上清を除去し、完全に固定剤を除去するためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄します。
4. 室温で30分間、PBS中の1％のOsO _4（1 mL）でサンプルをポスト修正。
5. 遠心分離後、上清を除去し、完全のOsO ₄取り除くためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄します。油中のOsO _4を無効化_し 、廃棄します。
6. 造影剤としてPBS（1mL）中の2％酢酸ウラニルを追加し、室温（ 図1B）で30分間サンプルをインキュベートします。
7. 遠心分離後、上清を除去し、未結合のウラニル交流を除去するためにPBS（1mL）でペレットを3回洗浄etate;酢酸ウラニルは、放射性元素が含まれており、放射性廃棄物専用のビンで処分しなければなりません。
   注：インキュベーション時間は、試料の大きさに応じて変更することができます。例えば、組織試料と厚い試料の固定および染色は、より長いインキュベーション時間を必要とします。より長いインキュベーション時間は、また、脱水および埋め込みステップのためのより良いかもしれません。酢酸ウラニルは、ガドリニウム塩を含む「ウラニルレス」溶液で置き換えることができます。

3.サンプル・脱水

1. 遠心分離後、上清を捨て、30％エタノール（ 図1C）を含むPBS中で4°C（1 mL）中で30分間試料をインキュベートします。
2. 徐々に増加するエタノール濃度（50％、70％、および100％まで）溶液を用いて手順を繰り返し3.1。これらの脱水工程の間、サンプルの保存のために4℃で試料を維持します。
3. 遠心分離した後、supernatを破棄アリと純エタノール（1 mL）にペレットを再懸濁。 4℃で一晩インキュベートします。

4.樹脂埋め込み

1. 遠心分離後、上清を破棄し、RT（ 図1D）で30分間30％のエポキシ樹脂（1 mL）でエタノール中でペレットを再懸濁します。
2. 徐々にエポキシ樹脂濃度（100％まで、50％、70％など）を増加させるの溶液を使用して手順を繰り返し4.1。
3. 遠心分離後、上清を破棄し、純粋なエポキシ樹脂（1 mL）中にペレットを再懸濁します。 RTで一晩インキュベートします。 DMP-30の硬化の存在は、樹脂の重合を誘発する可能性があります。この問題が発生した場合には、エポキシ樹脂の二つのバッチ、1とし、DMP-30のないものを準備します。
4. 遠心分離した後、純粋なエポキシ樹脂の200μLプラスチックカプセル内（硬化剤​​を含む）中にペレットを再懸濁。サンプルは、プラスチックカプセルの一番下にあるべきです。

5.樹脂重合

1. 私48時間、60℃に設定したインキュベーター中でサンプルを含有するプラスチックカプセルをncubate。樹脂の他の種類は異なる設定で重合することがあります。
2. インキュベーターからカプセルを外し、樹脂が重合していることを確認してください。硬い表面に押し付けた場合の樹脂は、ハードでなければなりません。
3. 試料を含む重合樹脂の上に（硬化剤を含む）、純粋なエポキシ樹脂を追加します。樹脂のこの余分な層は、それが簡単にサンプルをカットするようになります。 48時間60℃でカプセルをインキュベートします。

6.サンプルセクショニング

1. サンプルが上に向かっているように、試料ホルダ内の試料逆さまにマウントして、ウルトラミクロトームのトリミングブロックにそれを修正。しっかりウルトラミクロトームにトリミングブロックを確保するためのレバーをロックします。
2. かみそりの刃または類似の鋭利な切断器具を使用して、重合樹脂からそれを分離するためにプラスチック製のカプセルを切り出します。サンプルが含まれているように、樹脂をカットピラミッドのおおまかな形状で樹脂中に編。全体プラスチックカプセルを削除する必要はありません。唯一の重合サンプルを覆っている部分を削除します。
3. カプセルやトリミングブロックのオフ試料ホルダーを取り、ウルトラミクロトームの移動アームに取り付けます。
4. ナイフブロックにトリミングナイフをインストールし、正確にピラミッドの顔をトリミング。双眼鏡の使用は、ピラミッドに最適な形状を与えることをお勧めします。ピラミッドより良い、より良いセクションになります。
5. トリミングナイフを脱いで、0.5ミクロンよりも厚いセクションを切断するために使用することができ、組織学ナイフと交換してください。
6. 水の正確な量の組織学ナイフのキュベットを充填した後、試料の表面にナイフの刃先を持参し、ナイフはピラミッドに垂直にスライスするように、カプセルのピッチ角を調整するために双眼鏡を使用しています。
7. 希望に応じて切削速度を調整しますセクションの厚さが均一な切片を回収しました。
8. 水上セクションフロートをしようと、ループでそれを釣ります。
9. ろ紙の上に配置された電子顕微鏡銅グリッドに向かってループを動かします。
   注：グリッドは、その親水性を高めるために、以前に処理されている必要があります。これは、グリッドコーティングペンで行うことができます。
10. ろ紙による水の吸収のために、セクションはグリッドに固執しましょう。電子顕微鏡に挿入する前に数分間、それが乾燥してみましょう。

スルー焦点チルトシリーズの7デザイン

1. 一定の焦点間隔でスルー焦点画像を収集します。
   注：スルー焦点チルトシリーズは、チルトシリーズの各傾斜角度で収集されたスルー焦点イメージのセットで構成されています。全焦点振幅は、サンプル全体の厚さをカバーするのに十分であるべきです。
2. フォーカス間隔の値を決定します。間隔がdに等しい場合epth-の視野、焦点のサンプル全体を集めます。この設定は、可能な限り最高のサンプリングを表します。間隔は、被写界深度より大きい場合、試料の一部は、サンプルの一部が焦点に収集されないことを意味し、焦点で取得されません。
3. 被写界深度電子の波長からの電子ビームと電子ビームの収束半角を計算します。電子の波長を直接加速電圧に連結されているのに対し、電子顕微鏡の製造業者によって提供収束半角を使用するか、または既知の試料¹⁶の回折パターンから実験的に決定します。電子は、波長λで加速するので被写界深度（DOF）を決定するために次の式を使用し、電子顕微鏡でαの収束半角でサンプルをヒット：
   
   
4. 設計全体の焦点振幅がその最大見かけの厚さでサンプルをカバーするように、焦点シリーズ（ すなわち、その最高の傾きで）。
   注：0.75ミクロンの厚さの試料を、70°の傾斜で2.19ミクロンの見かけの厚さを持つことになりますので、フォーカス振幅は2.19ミクロン以上でなければなりません。上記で決定したフォーカス間隔が50nmに等しい場合、このサンプルでは、​​それはその最大見かけの厚さでサンプルをカバーする44の画像（2.19ミクロン/ 50 nm）を必要とします。全焦点振幅焦点ステップの数を乗じた焦点間隔の値に等しいです。最高の傾き（θ）では、サンプル見かけの厚さは、次のように定義されます。
   
   

8.サンプル画像

注：これは、STEMモードでの電子顕微鏡を設定する方法を説明するために、このプロトコルの範囲を超えています。この情報のほとんどはI見つけることができますn個のリファレンスマニュアルは、電子顕微鏡の製造元が提供します。ただし、次の点に注意してくださいⅰ）スポットサイズは、所望の倍率に応じて選択する必要があります。 ⅱ）ロンチグラムはよく整列させる必要があります。およびiii）BFモードでは、カメラの長さは、検出器の良好な照明を維持しつつ、非散乱電子を選択するように調整されなければなりません。電子顕微鏡銅グリッド上に堆積させた樹脂のセクションでは、収縮を防ぐために、画像取得の前に点灯している必要があります。樹脂の収縮と帯電効果は、画像取得の際に混乱する可能性があります。帯電効果が発生した場合、対物レンズの開口の使用は、サンプルの安定性を向上することがあります。しかし、STEMのセットアップの特定の場合には、対物絞りはHAADF撮影モードと互換性がない、と非常に小さい目的開口は、BFの撮影モードと互換性がありません。

1. （STEMで20,000前後）低倍率を使用して、サンプルを参照し、関心領域を探します。
2. トンを調整サンプルを回転させながら、関心領域が離れてドリフトしないように、彼は高さ（Z軸）をユーセントリック。
3. 興味の対象が全体のチルト範囲全体にわたって表示されたままになりますことを確認します。
4. スルー焦点チルトシリーズの間に取得された画像の実質的な数のため、自動収集ソフトウェアを使用しています。いずれかの商用ソリューションを使用するか、または希望する場合は、カスタムデータ収集ソフトウェアを設計します。ソフトウェアプログラムは、3次の手順を実行することが可能であることを確認します。
   1. 追跡し、標準的なチルトシリーズコレクション方式のように焦点を当てます。
   2. スルー焦点画像はサンプルのZ位置と重なっていることを確認してください。
   3. 自動的に各傾斜角度におけるスルーフォーカル一連の画像を取得します。
5. ソフトウェアプログラムを介して焦点傾斜シリーズの主なパラメータ（ すなわち、焦点間隔の焦点ステップ、最小傾斜角、最大傾斜角、傾斜ステップ、および走査速度）を得ました。
6. 開始画像収集プロセスや仕上げにソフトウェアプログラムを待ちます。

9.画像処理

注：このプロトコルでは、スルーフォーカルチルト系列処理はImageJのプラグイン^17を使用して実行されます。補足データ1は、アライメント工程（Turboreg）および3焦点値で設計スルー焦点チルトシリーズの合焦情報（フィールドの拡張深さ）をマージするためのImageJのマクロを示しています。

1. 同じ傾斜角（ すなわち、スルー焦点画像）で収集した画像の位置を合わせます。イメージが同じで、フォーカスの情報を持っていないので、位置合わせのための同じ機能を抱いていません。 Turboreg ^18、ImageJのプラグインを使用して（ すなわち、最初に最も近い焦点値で、ピラミッド型の階層を次の）近隣の画像2つずつ整列させることにより位置合わせを行います。
2. 一貫して、各傾斜角でスルー焦点画像の位置合わせを確認してください。目視検査を改善するために整列スルー焦点画像スタック。
   注：スタックをブラウズ中にのみ焦点が合っているゾーンが移動する必要があります。次のステップは、異なる画像からピントが合っている情報の回復で構成されているので正確な位置合わせは、最も重要なことです。
3. フィールド^19、ImageJのプラグインの拡張深さを使用してフォーカスされている情報をマージします。これは、最終的に画像のスタックから単一の画像を生成します。いくつかの設定は、被写界深度の回復中に使用されるが、画像情報を保存するために、最高の設定を使用することができます。
   注：傾斜シリーズは、現在のチルト角毎に単一の画像、スルー焦点画像から回収された合焦情報を含む各画像から構成されています。
4. データを処理します。
   注：データは現在、標準的なチルトシリーズに還元されているので、アライメント・復興のための標準ツールを使用することができます。このプロトコルでは、TomoJは私たちですデータのアライメントおよびデータ再構成^20、21のためのエド。 TomoJを使用する方法についての詳細は、元の出版物²²に記載されています。
5. チルトシリーズのファインアライメントを実行します。
   注：良い戦略を正確に画像間のシフトを追跡するための基準マーカーとしての金のビーズを使用することです。金ビーズをサンプルに添加することができない場合、極小値を使用することもできます。
6. 整列されたデータの3D再構成を実行します。いくつかのアルゴリズムは、利点と制限が各実空間またはフーリエ空間に再構成を行うために利用可能です。
7. チルトシリーズの最終的な位置合わせが悪い場合は、最初の手順を最適化することにより、いくつかの改善を行います。最終的な3D再構成がぼやけたり変形していると思われる場合は、アライメントの手順を繰り返します。実際には、収集した焦点面のより多くの、より良いコントラストと3D再構成の詳細。
   注：セveralソフトウェアプログラムを介して焦点チルト系列を処理するために使用することができます。しかし、このプロトコルで使用されるツールが選ばれたので、私たちの経験では、彼らは最高の行わ。 Turboreg ^18は、フォーカスの勾配が存在したときに画像を整列させるという点で優れた性能を発揮しました。さらに詳しい情報は専用ウェブサイト²³上で見つけることができます。他のツールは、可視ピクセルの変更が生じたのに対し、フィールドのプラグイン¹⁹の拡張深さは、異なる画像からの合焦情報を回復するという点で非常に好調に推移しました。詳細については、特にに関するスクリプトの書き込みは、この専用のウェブサイト²⁴上で見つけることができます。

結果

我々の研究では、電子が電界放出銃の透過型電子顕微鏡で200 kVのに加速しました。画像は、20マイクロ秒の滞留時間を用いてSTEMのBFモードで収集しました。スルー焦点チルトシリーズのデザインに関しては、我々は750nmの厚さの生物学的サンプルであっても、電子ビームの被写界深度があったものののみの超微細構造研究のために満足のいく結果が得られた150nmでのフォーカス間隔を見つけました3 NM-ので、私たちは25 mradでの非常に大きな収束半角を使用。

このレポートで分析されるサンプルは、 トリパノソーマ 、その鞭毛このオルガネラが著しく哺乳類²⁵に原生生物から保存されているので、集中的に研究されている単細胞真核生物です。細胞は、試料調製プロトコルで提示として扱われ、我々はT.ブルセイ （の鞭毛ポケットに構造解析を焦点を当てていました図2B、C...

ディスカッション

この記事では、スルー焦点断層撮影STEMを使用して厚い生物学的サンプルに3D解析を実行するためのステップバイステップのガイドと一緒に、従来の試料調製プロトコルを提示します。生体試料の樹脂埋め込みが何十年²⁶のために使用されており、試料の異なる種類に適合される代替のプロトコルは文献²⁷を通して見ることができます。対照的に、スルーフォーカスの方法を用いてSTEMに厚い標本を撮像すると、新しい仕事であり、それはより普及した方法は、ほとんど改善されます。

この研究の目的は、試料調製プロトコルを記述するためであり、より具体的には、現在利用可能な装置とSTEMで傾斜シリーズ取得焦点を通って、妥当な時間内に行うための撮影条件。このため、大型のフォーカス間隔を使用しました。実際、どれだけ近いかについてのコンセンサスはありません焦点面はスルー焦点チルトシリーズのためにSTEMと厚い試料を画像化するためにする必要があります。これは通常、STEM像を収集するのに数秒を要し、全体従来のチルトシリーズが完了するま...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リン酸緩衝生理食塩水	Sigma-Aldrich	P4417
エタノール	Sigma-Aldrich	2860
エポキシ樹脂	EMS	14120
パラホルムアルデヒド	Sigma-Aldrich	P6148	約60°C. で加熱したPBSにパラホルムアルデヒド粉末を添加 PFA粉末が見えなくなるまで1NのNaOHを添加してpHを上昇させます。
グルタルアルデヒド	Sigma-Aldrich	G5882
オスミウムテトロキシド	EMS	19150
ラニルアセテート	Sigma-Aldrich	73943
ラチンカプセル	EMS	70110
トリミングおよびヒストナイフLFG	分布	珪藻ダイアトームダイヤモンドナイフ電子
顕微鏡銅グリッド	LFG分布	G200-Cu
グリッドコーティングペン	LFG ディストリビューション	70624
試料ホルダー	日本電子	EM-21311 HTR
電子顕微鏡	日本電子	JEM-2200FS