方法論記事

共免疫沈降により核および細胞質画分中のタンパク質間相互作用の可視化とその場で近接ライゲーションアッセイ

DOI：

10.3791/55218

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2017年1月16日

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1University Children's Hospital Basel (UKBB), University of Basel, 2Department of Clinical Research, University of Basel

この記事について

サマリー

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タンパク質間相互作用は、細胞の核と細胞質の両方で発生する可能性があります。これらの相互作用を調べるために、従来の共免疫沈降と最新の近接ライゲーションアッセイが適用されます。本研究では、これら2つの方法を比較して、核と細胞質におけるNF90-RBM3相互作用の分布を可視化します。

要約

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タンパク質間相互作用は、何千もの細胞プロセスに関与しており、異なる空間的文脈で発生します。従来、共免疫沈降はタンパク質間相互作用を検出するための一般的な手法でした。その後のウェスタンブロット解析は、共免疫沈降タンパク質を可視化する最も一般的な方法です。最近、近接ライゲーションアッセイは、タンパク質間相互作用をin situで可視化するための強力なツールとなり、この方法によってタンパク質間相互作用を定量化する可能性を提供しています。従来の免疫細胞化学と同様に、近接ライゲーションアッセイ技術も抗原に対する一次抗体のアクセシビリティに基づいていますが、対照的に、近接ライゲーションアッセイはローリングサークルPCRを含む独自の技術でタンパク質間相互作用を検出しますが、従来の免疫細胞化学はタンパク質の共局在のみを示します。

核因子90(NF90)とRNA結合モチーフタンパク質3(RBM3)は、相互作用するパートナーとして以前に実証されています。それらは主に核に局在しますが、細胞質にも移動し、細胞質コンパートメント内のシグナル伝達経路を調節します。ここでは、共免疫沈降法と近接ライゲーションアッセイにより、核と細胞質の両方でのNF90-RBM3相互作用を比較しました。さらに、空間分布とタンパク質-タンパク質相互作用の特性に関するタンパク質-タンパク質相互作用を視覚化する上で、これら2つの手法の利点と限界について議論しました。

概要

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核因子90（NF90）は、ウイルス感染に応答して、miRNAの生合成1-3のインターロイキン2転写後規制の規制を含む多数の機能を備えたマルチアイソフォームタンパク質です。 RBM3は、RNA結合タンパク質、翻訳およびmiRNA生合成に関与し、低体温症および低酸素4-6を含む様々なストレスによって誘導することができるです。最近、我々は、タンパク質複合体7にNF90とRBM3を発見しました。 NF90とRBM3の相互作用は、小胞体ストレス応答7にプロテインキナーゼRNA様小胞体キナーゼ（PERK）活性を調節することが不可欠です。 NF90とRBM3の両方がPERK活性を調節するために、例えば 、核内に主に位置するが、NF90とRBM3シャトル少量の細胞質へと特定の機能のためにお互いにそこにバインドされています。したがって、を示すことができる、細胞内区画にNF90-RBM3相互作用の分布を可視化することが重要ですそれぞれの区画での様々な役割。

数十年前、酵母2ハイブリッド（Y2H）は、2つのタンパク質8の間の相互作用を検出するために開発されました。しかし、融合タンパク質の人工的な構造のため、偽陽性の結果は、この方法の適用が制限されています。長い間、免疫共沈降は、特に内因性条件9に、タンパク質-タンパク質相互作用を分析するための主な手法でした。超感度および精度が所望される場合、質量分析法を用いているが、共免疫沈降したタンパク質複合体を分析するために、ウェスタンブロットは、最も便利な技術です。近年では、近接ライゲーションアッセイは、in situ 10,11 の両方の細胞および組織におけるタンパク質-タンパク質相互作用を検出するための新規な方法として開発されました。

ここでは、最も人気の共免疫沈降法とNF9を取り込むには比較的小説近接ライゲーションアッセイ法を比較しました細胞内画分中の0-RBM3相互作用。また、両方の技術の利点と限界を議論しました。

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プロトコル

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1.共免疫沈降

  1. 2の1つの6ウェルプレートにウェル当たり2×10 5細胞でHEK293細胞を播種mlのダルベッコ変法イーグル10％ウシ胎児血清（FBS）を有する培地（DMEM）サプリメントおよび100 U / mlのペニシリン-ストレプトマイシン（ペニシリン-ストレプトマイシン） 。
  2. 5％CO 2、37℃で48時間、細胞を増殖させます。
  3. 冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回細胞を洗浄します。 4℃で5分間、500×gで遠心分離によって細胞を回収します。
  4. 商業核および細胞質抽出試薬を用いて、核および細胞質画分を準備します。いくつかの変更を加えて、製造元の指示に従ってください。
    1. 1共免疫沈降実験（1 6ウェルプレートの3ウェルから約90％の密集度）のために3×10 6個の細胞を使用してください。最高速度で15秒間300μlの冷たい細胞質抽出液（CERのI）と渦を追加します。
    2. 氷上で30分間インキュベートします。インキュベーションの間、vorte5秒ごとに10分間のx。
    3. 5秒間16.5μlの冷たい細胞質抽出溶液II（CER II）、渦を加え、氷上で5分間インキュベートします。
    4. 4℃で5分間、16,000×gで5秒、遠心分離機のための渦。
    5. 新しいあらかじめ冷却チューブに上清（細胞質抽出物）を移し、使用するまで氷上に保ちます。
    6. ピペッティングによって、および5回上下するたびに1ミリリットル冷PBSで（核を含む）、不溶性ペレットを3回洗浄します。洗浄後にPBSを削除してください。
    7. 15秒間150μlの常温核抽出液（NER）、渦を加え、氷上で1時間インキュベートします。インキュベーションの間、15秒、ピペット200μlのチップで10回毎に10分間の渦。
    8. 4℃で10分間、16,000×gで15秒間ボルテックスし、遠心分離機。
    9. 使用するまで氷上に維持し、新しいあらかじめ冷却チューブに上清（核抽出物）を転送します。
  5. 各入力として、核と細胞質抽出物の体積の10％を取ります。
  6. A1ミリリットルの最終容量に残った抽出物に冷PBSをddを。使用するまで氷上で保管してください。
    注：プロテインG結合磁性ビーズを使用する場合に事前クリアが必須ではありません。バックグラウンドが高い場合には、40μlのプロテ​​インG結合磁性ビーズ（50％スラリー）と回転子上で30分間、4℃で、このステップからの溶解物を希釈した1ミリリットルをインキュベートすることにより、事前決済を行います。磁気ラックでビーズから分離した上清（前清澄化ライセート）。ビーズを捨てます。
  7. プロテインG結合磁性ビーズと結合一次抗体に、200μlのPBSを加えたトゥイーン20緩衝液中に4μgのウサギポリクローナル抗RBM3抗体またはウサギIgG（陰性対照）と40μlのプロテ​​インG結合磁性ビーズ（50％スラリー）をインキュベートローテーター上で40分間、室温（RT）で（PBST、0.02％のTween 20）。
  8. 磁気ラックを有する抗体結合ビーズと上清を分離し、上清を捨てます。 200μlのPBST（0.02％）で1回ビーズを洗浄します。
  9. 1を追加します。mlのビーズに溶解物（または必要に応じて、事前にクリアされた溶解物）で希釈し、そして4℃で一晩回転子にインキュベートします。
  10. 翌日、磁気ラックによってビーズと上清を分離し、上清を捨てます。 20 rpmで一定の速度で回転体に4℃で各チューブのための0.5ミリリットルPBST（0.02％）で3×10分を洗ってください。
  11. 40μlの試料緩衝液（1×市販サンプル緩衝液および50mMの1,4-ジチオスレイトール（DTT））を添加することによってビーズからタンパク質を溶出させます。 10分間70℃で加熱。新しい1.5 mlチューブにスピンダウンし、転送用液体。
  12. 70℃で10分間熱：（1×市販サンプルバッファーと50mMのDTTの最終濃度）をサンプルバッファ内の入力溶解物を希釈します。プレキャスト4-12％Bis-Trisゲルへの最後のステップからの負荷入力および免疫沈降タンパク質。各ウェルの積載量は20μLを超えてはなりません。 35分間氷上で1×商業ランニングバッファーで電気泳動を行います。
    注：ロード核と細胞質抽出物細胞の同じ初期量を反映2（V / V）：1の比率でのS。
  13. 4℃で2時間、30 Vで1×商業転送バッファにおけるPVDF膜に転写タンパク質。
  14. 5％のブロック膜は、シェーカー上で40分間室温にてPBST中の乳（0.1％のTween 20）脱脂しました。
  15. 一晩4℃でPBST（0.1％）において、一次抗体で膜（千の両方が1で希釈）インキュベートします。
  16. シェーカー上で室温でPBST（0.1％）で3×10分を洗ってください。
  17. 西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で膜をインキュベートする（両方とも1で希釈した：5,000）、抗マウスまたは抗ウサギ二次抗体を抱合PBST（0.1％）中で、室温で1時間。
  18. シェーカー上で室温でPBST（0.1％）で3×10分を洗ってください。
  19. cm 2の膜当たり0.2ミリリットル増強化学発光（ECL）基質混合物を使用し、室温で5分間インキュベートします。赤信号を除く以降、このステップからの全ての光を避けてください。
  20. 液体捨て、フィルムカセットにX線フィルムにさらします。自動膜PRを用いてフィルムを開発ocessingマシン。

2.免疫細胞化学および近接ライゲーションアッセイ

  1. シード0.4ミリリットルDMEM中の1つの8室のポリ-D-リジンコートスライドで室あたり1.5×10 4細胞でのHEK293細胞を、10％FBSおよび100U / mlのペニシリン-ストレプトマイシンを補充しました。
  2. 5％CO 2、37℃で48時間、細胞を増殖させます。
  3. 吸引中、室温で10分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定します。
  4. 吸引しPFA、および室あたり0.5mlのPBSで3×10分を洗います。
  5. 透過処理し、室温で1時間PBS中の0.5％トリトンX-100および5％正常ヤギ血清（NGS）を有するブロック細胞。
  6. 一晩4℃でシェーカー上でPBS中0.1％トリトンX-100および5％NGS中で一次抗体と共にインキュベートします。二重染色のためにPBS中に100：マウスモノクローナル抗NF90抗体およびウサギポリクローナル抗RBM3抗体1を希釈します。ネガティブコントロールのために、独立して2次抗体のいずれかを省略し、第三の制御の両方の抗体を省略します。
    注：商業ブロッキングと希釈試薬を使用しないでください。
  7. 室あたり0.5mlのPBSで3×10分を洗ってください。
  8. 免疫細胞化学または近接ライゲーションアッセイプロトコールに従うことを条件
    1. 免疫細胞化学
      1. 500希釈された緑色蛍光色素結合抗マウスおよび赤色蛍光色素結合抗ウサギ二次抗体を室温で1時間：1でインキュベートします。以降、このステップからの光を避けてください。
      2. 室温で10分間PBSで5,000：4 '、6-diamidin-2-phenylindol（DAPI）で対比染色核は1に希釈しました。
      3. 室あたり0.5mlのPBSで3×10分を洗ってください。
      4. ガラススライド、乾燥からチャンバを削除します。スライドごとにメディアをマウント、250μでマウントします。
    2. 近接ライゲーションアッセイ
      1. 近接ライゲーションアッセイプローブを準備します。混合と番目を連結することができる別のオリゴヌクレオチドと結合した2つの近接ライゲーションアッセイプローブ（抗マウス及び抗ウサギ二次抗体を希釈ラフライゲーション溶液中の2つの他のオリゴヌクレオチドの付加）1両方：0.1％トリトンX-100で5、PBS中5％NGS、1つの8チャンバースライド（1cm 2当たり約40μl）を320μlの総体積を持ちます。 RTで20分間インキュベートします。
      2. ガラススライドから室を削除し、希釈したプローブを追加します。 1時間37℃で加湿インキュベーター中でインキュベートします。
      3. ライゲーション溶液を準備します。 8μlのリガーゼを混ぜ、64μlの5×ライゲーション株式と248μlのH 2 O
      4. スライドから液体をオフにタップし、1×洗浄バッファーA（キットに付属）で2×5分間洗浄します。
      5. ライゲーション溶液を加え、30分間、37℃で加湿インキュベーター中でインキュベートします。
      6. 増幅溶液を準備します。以降、このステップからの光を避けて4μlのポリメラーゼ、64μlの5倍の増幅ストックと252μlのH 2 Oを混ぜます。
      7. スライドから液体をオフにタップし、1×洗浄緩衝液Aで2×2分の洗浄
      8. アンプを追加lification溶液および100分間、37℃で暗所湿度インキュベーター中でインキュベートします。
      9. スライドから液体をオフにタップし、1×洗浄緩衝液B（キットに付属）で2×10分を洗います。 0.01x洗浄緩衝液Bで1分間洗浄します
      10. スライドを乾燥させ、スライドあたり（DAPI付き）商業マウンティング培地250μlのマウント。
  9. 10X接眼レンズおよび20X対物レンズを使用して、顕微鏡下で蛍光シグナルを調べます。 CCDカメラで画像を取得します。

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結果

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図1は、NF90およびRBM3の両方の核タンパク質であり、ごく一部が細胞質内に存在することを示しています。特に、RBM3のために陽性に染色された三つの異なるバンドがあります。わずか20キロダルトン以下の最小はRBM3の正しいサイズを反映（RBM3の推定分子量は17kDaのです）。他の二つのバンドの起源は調査されていません。ベイトタンパク質としてRBM3との共免疫沈降実験は、NF90-RBM3相互作用は核と細胞質の少数に主に存在していることを明らかにしました。共免疫沈降データは、各単一のタンパク質の局在化をサポートしています。

図2（a）に示すように 、NF90およびRBM3は、主に核内にもその場で細胞質内に位置しています。両タンパク質は、両方の区画で完璧な共局在を示しています。近接ライゲーションアッセイパターンを明らかにしました大...

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ディスカッション

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両方の方法にはいくつかの利点だけでなく、欠点があります。比較的新しい技術として、近接ライゲーションアッセイの明らかな利点は、単一細胞レベルの代わりに、異種の細胞のバッチでのタンパク質 - タンパク質相互作用を解明する可能性があります。高い大きさと（共焦点顕微鏡によって）解像度の画像は、単一の蛍光スポットを計数することによって定量化のための可能性を提供します。対照的に、ウエスタンブロットと免疫共沈降技術の従来の組み合わせは、適切な負荷制御がIPサンプルについて決定することは困難である主な理由は、タンパク質のバンドを半定量することができます。加えて、タンパク質-タンパク質相互作用は、生物学的物質の大量弱いまたは一時的である場合、 例えば 、細胞または組織融合タグとの共免疫沈降又は人工の過剰発現システムは、相互作用を検出するための機会を増強するために適用されるため、必要とされます。代替的に、検出さt例えば、質量分析法のような高感度のechniques実験の質を向上させることができます。しかしながら、近接ライゲーションアッセイ法の出発材料の量に関して明確な利点を有します。ごく少数の細胞が必要とされる、抗体の高...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この研究はスイス国立科学財団（SNSF, 31003A_163305）の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ダルベッコのモディファイドイーグル 'SigmaD6429高グルコース
4,500 mg/L
ウシ胎児血清 (FBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific10270106
Penicillin-Streptomycin (PenStrep)BioConcept4-01F00-H
NE-PER 核および細胞質抽出試薬Thermo Fisher Scientific78833
1,4-Dithiothreitol (DTT)Carl Roth6908.3
Dynabeads Protein GNovex, Thermo Fisher Scientific10003D
DRBP76 (NF90/NF110) antibodyBD Transduction Laboratories612154WBに1:1,000、ICC/PLA RBM3抗体に1:100
ProteinTech14363-1-APWBに1:1,000、ICC/PLA
Lamin A/C抗体Cell Signaling Technology#2032WBに1:1,000を使用 
抗GAPDH抗体Abcamab8245はWBに1:1,000を使用します 
正常なウサギIgGSanta Cruzsc-2027
抗ウサギIgG、HRP結合二次抗体Cell Signaling Technology#7074WBに1:5,000を使用 
抗マウスHRP二次抗体Carl Roth4759.1WB 
Clarity Western ECL Blotting SubstrateBio-Rad#1705060
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris GelNovex、Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
NuPAGE LDS Sample Buffer (4x)、Novex、Thermo Fisher ScientificNP0007
NuPAGE MES SDS Running buffer (20x)、Novex、Thermo Fisher ScientificNP0002
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Novex, Thermo Fisher ScientificNP00061
Amersham Hypond P 0.2 PVDF membraneGE Healthcare Life Sciences10600021
Poly-D-Lysine 8 well CultureSlide Corning BioCoat354632
パラホルムアルデヒド (PFA)SigmaP6148
正常ヤギ血清 (NGS)Gibco, Thermo Fisher ScientificPCN5000
ヤギ抗マウスIgG(H+L抗体)、Alexa Fluor 488コンジュゲートThermo Fisher ScientificA-11001
ヤギ抗ウサギIgG(H+L抗体)、Alexa Fluor 568コンジュゲートサーモフィッシャーサイエンティフィックA-11011
4′、6-ジアミジン-2-フェニリンドール(DAPI)SigmaD9542
Duolink PLAプローブ アンチマウスPLUSSigmaDUO92001
デュオリンクPLA プローブ 抗ウサギ MINUS ΣDUO92005
Duolink 検出試薬 レッドシグマ DUO92008
Duolink ウォッシュバッファー 蛍光SigmaDUO82049
Duolink DAPI封入剤SigmaDUO82040
Mowiol 4-88Sigma81381
顕微鏡オリンパスAX-70
CCDカメラSPOTInsight 2MP Firewire
X線フィルム富士フイルムスーパーRX
フィルム加工機富士フイルムFPM-100A
を使用 に1:100を使用

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Patiño, C., Haenni, A. L., Urcuqui-Inchima, S. NF90 isoforms, a new family of cellular proteins involved in viral replication? Biochimie. 108, 20-24 (2015).
  2. Shim, J., Lim, H., R Yates, J., Karin, M. Nuclear export of NF90 is required for interleukin-2 mRNA stabilization. Mol Cell. 10 (6), 1331-1344 (2002).
  3. Sakamoto, S., et al. The NF90-NF45 complex functions as a negative regulator in the microRNA processing pathway. Mol Cell Biol. 29 (13), 3754-3769 (2009).
  4. Dresios, J., et al. Cold stress-induced protein Rbm3 binds 60S ribosomal subunits, alters microRNA levels, and enhances global protein synthesis. Proc Natl Acad Sci. 102 (6), 1865-1870 (2005).
  5. Danno, S., Itoh, K., Matsuda, T., Fujita, J. Decreased expression of mouse Rbm3, a cold-shock protein, in Sertoli cells of cryptorchid testis. Am J Pathol. 156 (5), 1685-1692 (2000).
  6. Wellmann, S., et al. Oxygen-regulated expression of the RNA-binding proteins RBM3 and CIRP by a HIF-1-independent mechanism. J Cell Sci. 117 (Pt 9), 1785-1794 (2004).
  7. Zhu, X., Zelmer, A., Kapfhammer, J. P., Wellmann, S. Cold-inducible RBM3 inhibits PERK phosphorylation through cooperation with NF90 to protect cells from endoplasmic reticulum stress. FASEB J. 30 (2), 624-634 (2016).
  8. Fields, S., Song, O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
  9. Verhelst, J., De Vlieger, D., Saelens, X. Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein. J Vis Exp. (98), (2015).
  10. Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2007).
  11. Jarvius, M., et al. In situ detection of phosphorylated platelet-derived growth factor receptor beta using a generalized proximity ligation method. Mol Cell Proteomics. 6 (9), 1500-1509 (2007).
  12. Liu, C. H., et al. Analysis of protein-protein interactions in cross-talk pathways reveals CRKL protein as a novel prognostic marker in hepatocellular carcinoma. Mol Cell Proteomics. 12 (5), 1335-1349 (2013).

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HEK293NF90 RBM3

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