強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

サマリー

網膜の注射は、加齢黄斑変性症に対する幹細胞補充療法の臨床研究で広く適用されています。この可視化の記事でラットの目に細胞を提供する強膜によるリスクの少ない、再現性と正確に変更された網膜注入手法について述べる。

要約

加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの網膜変性疾患は、世界的な不可逆的な視力喪失の主要な原因です。AMD は、機能的にサポートおよび解剖学的神経網膜の周りを囲むセルの単分子膜は、網膜色素上皮 (RPE) 細胞の退化によって特徴付けられます。非血管新生 AMD (AMD) の現在の薬理学的治療法は、病気の進行を遅くしか新規治療戦略の特定を目的とした研究を施行したビジョンを復元できません。変性の網膜色素上皮細胞を乾燥 AMD を将来的に治療するために健康な細胞の将来性に置き換えます。AMD のための幹細胞補充療法の広範な前臨床研究は、幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜注入の技術を適用する動物モデルの網膜への移植を含みます。これらの前臨床動物研究で最も頻繁に使用されるアプローチは、針の端の直接可視化の欠乏によって困難になされる、網膜の損傷で起因できるしばしば強膜ルートを通じてです。針終了位置の直接観察が可能硝子体を通して別のアプローチがより目の組織が邪魔と手術のトラウマ高いリスクを運ぶ。我々 は正常にし一貫してラット網膜下腔網膜色素上皮細胞を提供し、過剰な網膜の損傷を避けるために定義された針の角度と深さを使用するリスクが少ないと再現性のある変更された強膜注入手法を開発しました。この方法で配信される細胞は、最低 2 ヶ月は王立外科医師 (RCS) ラットで結構効果があります以前実証されています。細胞移植のみならず小分子や遺伝子治療の配信、この手法を使用することができます。

概要

人間の網膜は光感覚組織として目関数の後ろに位置し、視覚認知に重要な役割を果たしています。網膜細胞の機能不全や細胞死したがってビジョンの問題や永久的な盲目を引き起こします。変性や網膜の異なる層の細胞の機能不全を伴う疾患はその中で AMD は最も一般的なタイプと^{の先進国で高齢者に回復不能な失明の主要な原因、網膜変性疾患として知られています。1,2}。AMD の病理学的プロセスが網膜色素上皮層と順番視細胞の生理学、神経網膜の萎縮およびビジョンの損失^{3につながるの RPE サポートを損なう基になるブルッフ膜の間「ドルーゼン」蓄積関連付け 4,5}。これまでの治療がない高度な (非血管新生) AMD を乾燥します。幹細胞療法として再生医療の新しいパラダイムの出現は、健康な細胞の幹細胞の機能不全や死者の網膜色素上皮細胞を交換の希望をもたらします。確かに、広範な臨床研究移植の幹細胞 (例えば、ヒト胚性幹細胞)-RPE 変性動物モデルに派生の網膜色素上皮細胞が実行^6、7にいくつかの進歩をされています。臨床試験^8,9 (NCT01344993、ClinicalTrials.gov)。最近では、幹細胞が人間の網膜色素上皮層、人間の網膜色素上皮幹細胞 (hRPESCs) の居住者の代替ソース研究室によって識別され、現在 amd hRPESC 派生した網膜色素上皮細胞 (RPE-hRPESC) 移植療法の臨床研究で使用されて^10,11,12,13。

網膜下注入の技術は、上記当社グループを含む複数のグループによる前臨床試験に適用されます。動物の網膜注入の 2 つの一般的なアプローチ: トランス vitreal と強膜。トランス vitreal 方法の利点はレンズに全体 vitreal 腔を越える前眼に浸透、浸透、subretinal に到達する目に後ろに網膜と針の端を直接観察することが外科医のスペース^14,,1516。ただし、それは (前部と後部)、2 つの場所で網膜を中断すること、レンズを傷つけるリスクを運ぶし、針が取り消されるとき硝子体に細胞の逆流の可能性があります必要があります。対照的に、トランス強膜方法は、原則として、網膜と硝子体の関与を回避し、逆流が目を終了します。色素性の齧歯動物の外科医は当初、強膜の浸透を観察できるが、色素性の脈絡膜に通過後針の端が表示されなくなります。直接観察することがなく網膜に違反は一般的と網膜剥離、硝子体に細胞や血液の配信になります。また、眼の表面が湾曲しているために、強膜注射のため最も効果的などの針の角度と深さを知ることは非常に困難です。

この可視化の記事で光コヒーレンストモグラフィ (OCT)、注射部位の詳細な検査ができると手術後の評価を使用して通知強膜網膜注入法を紹介します。私たちの強膜注入法は、定義済みの場所、角度、および非常に低い外科的外傷と高信頼性を生成する注射針の深さを利用しています。ここでは、人間の AMD の前臨床モデル RCS ラットの網膜注入 hRPESC 網膜色素上皮細胞を具体的に示す.この注入法で正常にかつ一貫して救わ hRPESC 網膜色素上皮細胞に非常に高い成功率で RCS ラットの目の網膜。細胞の注射以前が認め RCS 視細胞の保全に注入¹³後少なくとも 2 ヶ月。この手順は、解剖顕微鏡の下で行われ、学ぶことは簡単です。(外科医と助手) 注射を実行する二人必要で、それぞれの動物の注入の平均時間は 5 分未満。定義された角度と注射針の深さは 10 月が正常網膜注入を達成するために利用可能な研究所を可能にします。それは再現性の高い網膜にアクセスできます、細胞移植のみならず、医薬品配送と遺伝子治療のために使用できます。

プロトコル

動物を含むすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、アルバニーのニューヨークの州立大学、によって承認されています。

1. 事前注入準備

1. HRPESC RPE の細胞懸濁液の調製
   注: 滅菌のティッシュ文化フードのすべての次の手順を実行し、基本的な生殖不能の技術と知識が必要です。
   1. 主な hRPE 細胞を分離および 24 ウェル プレート¹²に培養細胞を 50 から 90 年間人間のドナーから目が高齢者します。通路 1 細胞を凍結、融解必要に応じて文化通路 2 (P2) 細胞の注入の 4-5 週間 (図 1 a) の。
   2. 培地¹²を外し、軽く 500 μ L で 2 回リンス井戸で加温ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水カルシウム & マグネシウムなし X 1 (1 DPBS CMF x) 1 を追加することによって X DPBS-CMF 井戸 1,000 μ L ピペットを使用し、真空を使用してそれを削除することに。
   3. 各ウェルに 300 μ L トリプシン/DNAse を追加します。トリプシン/dn (0.25% トリプシン-EDTA の 1 mL あたり 4 区 DNase) セルを分離する 37 ° C で 4 分で hRPESC 網膜色素上皮細胞を孵化させなさい。
   4. 彼らを切り上げているかどうかを顕微鏡下で細胞を確認します。まだ切り上げ彼らない場合さらに 2 分間トリプシン/DNase のセルをインキュベートし続けます。
   5. セルが切り上げられます、一度カップ刻んだ井戸から剥離細胞とトリプシン/DNase を不活化する、予め温めておいた培の等量と 15 mL の円錐管に剥離細胞を含むトリプシン/DNase を転送する 1,000 μ L ピペットを使用します。
   6. 予め温めておいた 1 と井戸をリンス優しく特に; 井戸の縁の周りを上下、ピペッティングにより X DPBS CMF以前の円錐管にこれらの細胞を追加します。
   7. 細胞のペレットへの 4 ° C で 5 分間 286 x g で円錐形の管を遠心します。
   8. 上澄みを除去し、培地 1 mL の細胞を再懸濁します。
   9. 診断を使用してセルをカウントします。
   10. 細胞のペレットへの 4 ° C で 5 分間 286 × g で遠心分離機します。
   11. 上澄みを除去し、細胞に滅菌バランスの取れた塩ソリューション (BSS) 50,000 細胞/μ L で (網膜注入中に 1 μ L のボリュームの 50,000 セルを配信) に再懸濁します。
   12. 1.7 mL 遠心チューブに氷-水混合物の注入に使用されるまで最終的な細胞懸濁液 (CS) を転送します。
2. セル インジェクターの準備
   1. 注射器とインジェクターを組み立てるにはしっかりとネジに滅菌 33 ゲージ ベベル針を挿入します。
   2. 5-6 回 100% エタノールでインジェクターをフラッシュします。
   3. 5-6 回の 70% エタノール噴射装置をフラッシュします。
   4. 5-6 回 BSS とインジェクターをフラッシュします。
   5. (図 1 b) 解剖顕微鏡下で針の先端から 600 μ m の位置にある黒のマーカーペン滅菌とインジェクター針をマークします。
   6. 注射用マイクロマニピュレーターにインジェクターを配置します。

2. 網膜注入

1. 外科領域と動物の準備
   1. 4-5 週齢 RCS ラット (60-100 g) の重量を量るし、イソフルラン蒸気の配信システムを使用してそれを麻酔します。
      注:誘発するには、麻酔は 5% にイソフルランの流量を維持します。足を押すことによって麻酔の深さを確認し、手術中に麻酔維持のための 2-3%、流量を減らします。
   2. 滅菌手術ドレープ、滅菌手術領域を設定する解剖顕微鏡のステージの下に、加熱パッドを配置します。
   3. 外科領域にラットを転送し、ラットを麻酔を維持するためにイソフルラン システムに接続されている鼻の円錐形に配置します。
   4. ガーゼでラットの体をカバーしてください。完全麻酔を確認するラットのつま先をピンチします。
2. 顕微鏡下強膜網膜注入
   1. ラットの unoperated 目に目の潤滑剤の滴を適用します。
   2. 注射、外科医の右手に向かって頭とその外科医の方のための天井に直面して左眼の右側にラットを配置します。
   3. 小さなハサミで目をカバーするひげをトリムします。
   4. 左眼の時間的側面から目の洗浄量を点滴し、目を洗うに綿棒で鼻側に過剰を収集します。
   5. それぞれの滴を適用することによって投与後 10 月受験 (たて 10% フェニレフリンから手術の日にそれ 0.9% 生理食塩水で希釈することによって作られる) 1% 2.5% とトロピカミド フェニレフリンで瞳孔を散大させます。
   6. 4-6 回目の周囲の皮膚を軽く引いてするまぶたを開き、目は若干れ角膜輪部の後方の領域にアクセスするため、突出しています。
   7. 目の洗浄の適用ドロップ、目の潤いを保ちます。
   8. 優しく (1.1. 12 のステップで準備) CS をカップ刻んだし、1.2 μ L CS とインジェクターをロードします。余分な 0.2 μ L が注入逆流を補うために使用されます。
      注:について私たちの測定に基づく 5,000-8,000 セルはセル損失の約 10-16% に相当する 50,000 の細胞/μ の注射で逆流で失われ、0.2 μ L CS の余分をこのセル損失を補償するために注入されました。
   9. 満ちている CS マイクロマニピュレーターにインジェクターを配置 (またはそれを保持するアシスタント) 垂直として RPE 細胞傾向にある懸濁液で簡単に沈みます。
   10. 目にプロパラカイン 0.5% (ローカル局所麻酔薬) のドロップを適用し、綿アプリケーター付き過剰を削除します。
       注:この手順は、角膜反射を抑制するし、目が後続の手順の実行中に点滅するを防ぐ必要があります。
   11. 結膜、角膜の後方をグリップし、鼻、目を回転させる「テント」結膜を持ち上げて鉗子を使用します。
   12. 結膜に小さな開口部を確認し、基になる強膜を公開「テント」上部をカットするはさみを使用します。
   13. 鉗子を使用して、残り結膜角膜マージンの端をつかんで、瞳孔軸テーブル トップ (図 1) を基準にして約 30 度の角度で、鼻、目を回転します。針挿入時反力を提供するために、最適な角度で目を維持するために、結膜縁の継続的な把握が必要です。
   14. 細胞の注入のための下穴をするためには、滅菌ベベル 31 ゲージ インスリンの針の先端位置は 1,200-1,500 μ m 直面している先端の開口縁の後方で。
   15. 10-15 度 (目的の注射部位の虚数平面に接線) 強膜上にあるインスリンの針の角度を調整します。約 500 μ m の針の深さに強膜・脈絡膜複合体にゆっくりと浸透します。色素性のラットで針の端が「消滅」色素性の脈絡膜の下にあります。ここで使用されるインスリンの針のブランド、針の先端から面取りまでの距離は 500 μ m です。
   16. 慎重に撤回するインスリンの針 (血の非常に小さい胸水が見られるかもしれない)。
   17. 過度の出血が認められる場合、目槍は、必要に応じて、穴をオフに適用できます。継続的な出血後槍アプリケーション容器が破損しています。
   18. 上下強膜の局所的な面を基準にして約 10-15 度の角度に直面して開口をパイロット穴に挿入、RPE 細胞ロード インジェクター針をガイドします。
   19. インジェクター針を網膜の領域にアクセスする約 500 μ m の深さにパイロット穴にそっと挿入します。黒のペンのマークの端と針が (図 1と1 D) 色素性の脈絡膜で覆われているポイントの間 100 μ m のマージンについて必要があります。
   20. 優しく細胞 (約 1.2 μ L) の適切な量を注入する注入器注射器のプランジャーを押し下げるにアシスタントを頼みます。プランジャーを押すとアシスタントとしていくつかの反力を提供する準備ができてください。
       注:アシスタントの前に模擬練習は外科医とこのステップに必要な経験を持つアシスタントの両方を提供できます。
   21. ペンで視覚的に焦点を当てながらエッジをマーク、25-30 秒の場所にインジェクターを保持、インジェクターをゆっくりと上げます。少量の逆流がよく観察されます。
       注:逆流を認められなかった場合で、ケナコルト硝子体内注入をされてありますいる可能性があります。逆流シールや、強膜の下に充填セルを介して場合は、注入が浅すぎていた。
   22. 3 回滅菌目洗うと注射部位から細胞排出を洗うし、綿アプリケーター付き過剰を収集します。
   23. 運営の目に目の潤滑剤の滴を適用し、ラットを移植細胞の場所と網膜の胞のサイズを検討する 10 月駅に転送します。

3. 後注入治療

1. 抗炎症、痛みの緩和治療
   1. 痛みを軽減する皮下生理食塩水で 0.1 mg/kg 体重でブプレノルフィンを注入します。
   2. 腹腔内注入 (i. p.) 炎症制御による生理食塩水で 1.6 mg/kg 体重でデキサメタゾンを注入します。
2. 動物の回復
   1. ラットを体温を維持する熱ランプの下で回復ケージに戻ります。
   2. 運営の目には出血の兆候を確認します。
   3. 麻酔が出てくるようにラットを観察します。
   4. 回復した動物を新鮮なケージに戻る手術カードでケージをフラグし、毎日の苦痛、眼出血、角膜混濁の兆候を監視します。懸念がある場合は、すぐに獣医師を通知します。

結果

この資料で説明する手法を使用すると、一貫して納品 hRPESC 網膜色素上皮細胞 RCS ラットの網膜下腔の場所、角度、および組織 (図 1 b-D にインジェクター針挿入の深さを正確に制御することにより).すぐに次の移植は、OCT 検査を行った注射部位及び移植の細胞によって作成された網膜下の水疱を観察します。手術後 10 月評価は注射や網膜の損傷や出血を監視の質を評価するためのスクリーニング ツールとして提供しています。両方網膜下水疱 (図 2 a、 CおよびD) 注射部位 (図 2 aおよびB) はスキャン OCT ではっきり確認できたし、。網膜下の水疱は、通常注射後 24 時間以内に解決します。鉱物のサイズの測定は困難な OCT を用いたが、我々 は細胞移植による視細胞保護区域に等しいと仮定すると水...

ディスカッション

この資料に示されている網膜注入法はインジェクター針が神経網膜を傷つけるまたは硝子体腔を乱すことがなく目の壁の外側の層 (強膜・脈絡膜・網膜色素複合体) を貫通強膜の経路です。代替トランス vitreal アプローチには、レンズの損傷を齧歯動物のレンズが硝子体腔の大半を占めているので、白内障につながるの潜在的なリスクがあります。このメソッドと比較して、本手法はリスクが少ないで、インジェクター針は網膜の領域に到達する全体の硝子体腔をまたぐ必要がないので、最小限の外傷を引き起こします。確かに、私たちの研究で OCT 所見網膜浸透の非常にまれなイベントと、動物のフォロー アップ試験では永続的な網膜剥離がないです。また、注射部位が非常に小さい (< 200 μ m 径) 針 33 ゲージ注射器を用いたときの強膜・脈絡膜・網膜色素複合体の構造は非常に限られたので。針撤回後注入穴自己シールないのでステッチ自動的にまたは組織接着剤が必要です。

インジェクション周辺または内から過度の出血、手術の合併症が含まれます下の穴。角膜輪部結膜余白をグリップに鉗子を使用している場合、血管をつまんでを避けるために...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.25% トリプシン-EDTA (1x)	Life Technologies	25200-072
DNAse I	Σ	DN-25
1xDulbecco'カルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 &マグネシウム(1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
滅菌バランス塩溶液(BSS)	アルコン	00065079550
洗眼液	Moore Medical	75519
滅菌0.9%生理食塩水	Hospira	488810
プロパラカイン塩酸塩点眼液(0.5%)	Akorn	17478026312
トロピカミド点眼液、USP(1%)	Bausch &ロム	24208058559
フェニレフェリン点眼液、USP(10%)ストックバ	ウシュ&Lomb	42702010305	これは2.5%のフェニレフェリン
Buprenex	のパターソン	433502
デキサメタゾン	APPの薬剤	を作63323051610
100%のエタノール	サーモの科学	的な615090040
70%のエタノール	Ricca Chemical Company	2546.70-5
Sterile GenTealの潤滑油の目のゲル	を作るのに使用されていますノバルティス	78042947
滅菌済み シスタン ウルトラ 潤滑剤点眼薬	アルコン	00065143105
hRPESC-RPE 細胞	市販		細胞の単離とメンテナンスについては、「リファレンス #12」を参照してください。
24ウェルプレート	コーニング	3526
コニカルチューブ (15 ml)	Sarstedt	62554002
Oリング付き微量遠心キャップ	LPS inc	L233126
キャップレス微量遠心チューブ (1.7 ml)	LPS inc	L233041
遠心分離	Eppendorf	5804R
滅菌アルコールワイプ	McKesson	58-204
滅菌綿チップアプリケー	ターマッケソン	24-106-2S
滅菌Weck-Cel槍ビー	バービジテックインターナショナル
滅菌外科用ドレープ	マッケソン	25-515
ガーゼ	マッケソン	16-4242
ナノフィル シリンジ (10 ul)	ワールド プレシジョン インスツルメンツ	ナノフィル
ナノフィル 面取り 33 ゲージ針	ワールド プレシジョン	NF33BV-2
インスリン シリンジ ニードル 31ゲージ	ベクトン ディキンソン	328418
ラット 歯付き鉗子	ワールド精密機器	555041FT
バンナスマイクロ解剖スプリングはさみ	Roboz	RS-5602
循環水Tポンプ	ストライカー	TP700
ヒーティングパッド	ケントサイエンティフィック	TPZ-814
動物麻酔システム	ワールドプレシジョンズ	EZ-7000
バランス	オーハウス	PA1502
実体顕微鏡	ツァイス	ステミ 2000
顕微鏡光源	ショット	ACEシリーズ
Bioptigen Envisu スペクトル領域眼科イメージングシステム	Bioptigen	R2210
滅菌ブラックマーカーペン	Viscot Industries	1416S-100
ミニチュア測定スケール	Ted Pella Inc	13623
赤外線日光浴スポットランプ	EXO-TERRA	PT2144	これは、術後の回復期に動物の暖房ランプとして使用されます。