網膜の注射は、加齢黄斑変性症に対する幹細胞補充療法の臨床研究で広く適用されています。この可視化の記事でラットの目に細胞を提供する強膜によるリスクの少ない、再現性と正確に変更された網膜注入手法について述べる。
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方法論記事
強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
加齢に伴う黄斑変性症 (AMD) などの網膜変性疾患は、世界的な不可逆的な視力喪失の主要な原因です。AMD は、機能的にサポートおよび解剖学的神経網膜の周りを囲むセルの単分子膜は、網膜色素上皮 (RPE) 細胞の退化によって特徴付けられます。非血管新生 AMD (AMD) の現在の薬理学的治療法は、病気の進行を遅くしか新規治療戦略の特定を目的とした研究を施行したビジョンを復元できません。変性の網膜色素上皮細胞を乾燥 AMD を将来的に治療するために健康な細胞の将来性に置き換えます。AMD のための幹細胞補充療法の広範な前臨床研究は、幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜注入の技術を適用する動物モデルの網膜への移植を含みます。これらの前臨床動物研究で最も頻繁に使用されるアプローチは、針の端の直接可視化の欠乏によって困難になされる、網膜の損傷で起因できるしばしば強膜ルートを通じてです。針終了位置の直接観察が可能硝子体を通して別のアプローチがより目の組織が邪魔と手術のトラウマ高いリスクを運ぶ。我々 は正常にし一貫してラット網膜下腔網膜色素上皮細胞を提供し、過剰な網膜の損傷を避けるために定義された針の角度と深さを使用するリスクが少ないと再現性のある変更された強膜注入手法を開発しました。この方法で配信される細胞は、最低 2 ヶ月は王立外科医師 (RCS) ラットで結構効果があります以前実証されています。細胞移植のみならず小分子や遺伝子治療の配信、この手法を使用することができます。
概要
人間の網膜は光感覚組織として目関数の後ろに位置し、視覚認知に重要な役割を果たしています。網膜細胞の機能不全や細胞死したがってビジョンの問題や永久的な盲目を引き起こします。変性や網膜の異なる層の細胞の機能不全を伴う疾患はその中で AMD は最も一般的なタイプとの先進国で高齢者に回復不能な失明の主要な原因、網膜変性疾患として知られています。1,2。AMD の病理学的プロセスが網膜色素上皮層と順番視細胞の生理学、神経網膜の萎縮およびビジョンの損失3につながるの RPE サポートを損なう基になるブルッフ膜の間「ドルーゼン」蓄積関連付け 4,5。これまでの治療がない高度な (非血管新生) AMD を乾燥します。幹細胞療法として再生医療の新しいパラダイムの出現は、健康な細胞の幹細胞の機能不全や死者の網膜色素上皮細胞を交換の希望をもたらします。確かに、広範な臨床研究移植の幹細胞 (例えば、ヒト胚性幹細胞)-RPE 変性動物モデルに派生の網膜色素上皮細胞が実行6、7にいくつかの進歩をされています。臨床試験
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プロトコル
動物を含むすべてのプロシージャは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC)、アルバニーのニューヨークの州立大学、によって承認されています。
1. 事前注入準備
-
HRPESC RPE の細胞懸濁液の調製
注: 滅菌のティッシュ文化フードのすべての次の手順を実行し、基本的な生殖不能の技術と知識が必要です。- 主な hRPE 細胞を分離および 24 ウェル プレート12に培養細胞を 50 から 90 年間人間のドナーから目が高齢者します。通路 1 細胞を凍結、融解必要に応じて文化通路 2 (P2) 細胞の注入の 4-5 週間 (図 1 a) の。
- 培地12を外し、軽く 500 μ L で 2 回リンス井戸で加温ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水カルシウム & マグネシウムなし X 1 (1 DPBS CMF x) 1 を追加することによって X DPBS-CMF 井戸 1,000 μ L ピペットを使用し、真空を使用してそれを削除することに。
- 各ウェルに 300 μ L トリプシン/DNAse を追加します。トリプシン/dn (0.25% トリプシン-EDTA の 1 mL あたり 4 区 DNase) セル....
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結果
この資料で説明する手法を使用すると、一貫して納品 hRPESC 網膜色素上皮細胞 RCS ラットの網膜下腔の場所、角度、および組織 (図 1 b-D にインジェクター針挿入の深さを正確に制御することにより).すぐに次の移植は、OCT 検査を行った注射部位及び移植の細胞によって作成された網膜下の水疱を観察します。手術後 10 月評価は注射や網膜の損傷や出血を監視の質を評価するためのスクリーニング ツールとして提供しています。両方網膜下水疱 (図 2 a、 CおよびD) 注射部位 (図 2 aおよびB) はスキャン OCT ではっきり確認できたし、。網膜下の水疱は、通常注射後 24 時間以内に解決します。鉱物のサイズの測定は困難な OCT を用いたが、我々 は細胞移植による視細胞保護区域に等しいと仮定すると水.......
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ディスカッション
この資料に示されている網膜注入法はインジェクター針が神経網膜を傷つけるまたは硝子体腔を乱すことがなく目の壁の外側の層 (強膜・脈絡膜・網膜色素複合体) を貫通強膜の経路です。代替トランス vitreal アプローチには、レンズの損傷を齧歯動物のレンズが硝子体腔の大半を占めているので、白内障につながるの潜在的なリスクがあります。このメソッドと比較して、本手法はリスクが少ないで、インジェクター針は網膜の領域に到達する全体の硝子体腔をまたぐ必要がないので、最小限の外傷を引き起こします。確かに、私たちの研究で OCT 所見網膜浸透の非常にまれなイベントと、動物のフォロー アップ試験では永続的な網膜剥離がないです。また、注射部位が非常に小さい (< 200 μ m 径) 針 33 ゲージ注射器を用いたときの強膜・脈絡膜・網膜色素複合体の構造は非常に限られたので。針撤回後注入穴自己シールないのでステッチ自動的にまたは組織接着剤が必要です。
インジェクション周辺または内から過度の出血、手術の合併症が含まれます下の穴。角膜輪部結膜余白をグリップに鉗子を使用している場合、血管をつまんでを避けるために.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
我々 は RPE 細胞の準備のため手術とスーザン ボーデンに彼女の援助のためのパテ レダーマンを感謝したいです。我々 はまた、このプロジェクトのための資金の NYSTEM C028504 を認めます。ジャスティン D. ミラーは NIH によってサポートされて F32EY025931 を付与します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.25% トリプシン-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Σ | DN-25 | |
| 1xDulbecco'カルシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水 &マグネシウム(1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| 滅菌バランス塩溶液(BSS) | アルコン | 00065079550 | |
| 洗眼液 | Moore Medical | 75519 | |
| 滅菌0.9%生理食塩水 | Hospira | 488810 | |
| プロパラカイン塩酸塩点眼液(0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| トロピカミド点眼液、USP(1%) | Bausch &ロム | 24208058559 | |
| フェニレフェリン点眼液、USP(10%)ストックバ | ウシュ&Lomb | 42702010305 | これは2.5%のフェニレフェリン |
| Buprenex | のパターソン | 433502 | |
| デキサメタゾン | APPの薬剤 | を作63323051610 | |
| 100%のエタノール | サーモの科学 | 的な615090040 | |
| 70%のエタノール | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTealの潤滑油の目のゲル | を作るのに使用されていますノバルティス | 78042947 | |
| 滅菌済み シスタン ウルトラ 潤滑剤点眼薬 | アルコン | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE 細胞 | 市販 | 細胞の単離とメンテナンスについては、「リファレンス #12」を参照してください。 | |
| 24ウェルプレート | コーニング | 3526 | |
| コニカルチューブ (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Oリング付き微量遠心キャップ | LPS inc | L233126 | |
| キャップレス微量遠心チューブ (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| 遠心分離 | Eppendorf | 5804R | |
| 滅菌アルコールワイプ | McKesson | 58-204 | |
| 滅菌綿チップアプリケー | ターマッケソン | 24-106-2S | |
| 滅菌Weck-Cel槍ビー | バービジテックインターナショナル | ||
| 滅菌外科用ドレープ | マッケソン | 25-515 | |
| ガーゼ | マッケソン | 16-4242 | |
| ナノフィル シリンジ (10 ul) | ワールド プレシジョン インスツルメンツ | ナノフィル | |
| ナノフィル 面取り 33 ゲージ針 | ワールド プレシジョン | NF33BV-2 | |
| インスリン シリンジ ニードル 31ゲージ | ベクトン ディキンソン | 328418 | |
| ラット 歯付き鉗子 | ワールド精密機器 | 555041FT | |
| バンナスマイクロ解剖スプリングはさみ | Roboz | RS-5602 | |
| 循環水Tポンプ | ストライカー | TP700 | |
| ヒーティングパッド | ケントサイエンティフィック | TPZ-814 | |
| 動物麻酔システム | ワールドプレシジョンズ | EZ-7000 | |
| バランス | オーハウス | PA1502 | |
| 実体顕微鏡 | ツァイス | ステミ 2000 | |
| 顕微鏡光源 | ショット | ACEシリーズ | |
| Bioptigen Envisu スペクトル領域眼科イメージングシステム | Bioptigen | R2210 | |
| 滅菌ブラックマーカーペン | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| ミニチュア測定スケール | Ted Pella Inc | 13623 | |
| 赤外線日光浴スポットランプ | EXO-TERRA | PT2144 | これは、術後の回復期に動物の暖房ランプとして使用されます。 |
参考文献
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic revi....
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