方法論記事

げっ歯類での後根神経節の脊髄および単離の油圧押出

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DOI:

10.3791/55226

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2017年1月22日

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1Department of Biomedicine, Aarhus University

この記事について

サマリー

ここでは、脊髄の油圧押し出しと、同じげっ歯類の特定の後根神経節（DRG）の同定と分離のためのプロトコルを提示します。標準的な脊髄分離法と比較して、この方法は大幅に迅速で、組織損傷のリスクを軽減します。

要約

伝統的に、脊髄は椎弓切除術、すなわち一度に一つずつ脊椎を壊すことによって分離されます。これは時間がかかり、解剖プロセスによって脊髄が損傷する可能性があります。ここでは、油圧を使用して脊髄を押し出す方法を示します。ハンドリング時間がわずか数分に大幅に短縮され、タンパク質の損傷が減少する可能性があります。脊髄組織への損傷のリスクが低いため、その後の免疫組織化学分析が改善されます。従来の椎弓切除術の代わりに水硬性脊髄押出術を行うことにより、げっ歯類をさらにDRG分離に使用することができ、それにより動物の数を減らし、同じげっ歯類の組織間での分析が可能になります。我々は、肋骨に対するそれらの局在化に従ってDRGを同定し、分離するための一貫した方法を実証する。ただし、胸部と腰椎の両方の脊髄セグメントの数は動物の種類や系統によって異なる可能性があるため、この方法を使用される特定の動物に合わせて調整することが重要です。さらに、単離された組織のさらなる加工例を例示する。

概要

この方法の全体的な目的は、脊髄を単離するために、ならびにたDRG 1,2を同定および単離することです。脊髄の水圧押出時に脊椎骨一方を破壊することによって、すなわち 、椎弓切除術により脊髄分離する従来の方法よりも大幅に速い方法であり、この方法は、解剖法3によって引き起こされる組織損傷の危険性を低減し、4 。 DRGを識別することは困難であろう。正確な同定は、 例えば 、坐骨神経損傷後、組織分析のために非常に重要です。肋骨へのそれらの局在の相対に従ってのDRGに番号を付けることにより、DRGを一貫して識別することができます。

ここで実証された技術により単離された組織は、ウェスタンブロッティング5を含む分析の広い範囲に適用することができます6、定量PCR 7および免疫組織化学染色8。

DRGを識別するとき、脊髄セグメントの数は、動物のタイプおよび株9、10、11と変化することが知られていることを考慮することが重要です。マウスでは、この方法を実行する際の利点は、利用可能な遺伝的に修飾された変異体と比較的低い住宅費の数が多いです。ラットを使用しての利点は、比較的に高い組織の収率であり、神経損傷を伴う場合には、手順はサイズで緩和されます。

プロトコル

全ての動物は、デンマークと欧州の規制に完全に準拠して処理されていました。許可番号：2012-15-2934。

脊髄の油圧押出用シリンジの調製

  1. 成体ラットの場合、10 mLの注射器を使用しています。成体マウスの場合は、5 mLの注射器を使用しています。子犬のために、2.5 mLの注射器を使用しています。
  2. それは注射器にしっかりと収まるまで、ピペットチップの大端をトリミングすることによって2-200μLピペットのために普遍的に適切な非フィルターピペットチップを調整します。注射器の調整されたピペットチップを置きます。子犬のために、調整されたピペットチップの代わりに23 Gまたは類似の針を使用します。
  3. 吸引除去し、氷冷滅菌PBSおよびさらに使用するまで氷上で注射器を残します。

2.安楽死

  1. これが不可能な押し出しをレンダリングする脊椎骨の​​障害になるように、頸椎脱臼を実行しないでください。
  2. 成体ラット/マウスの場合は、例えばCO 2やisofluなどのガスを使用して安楽死させますRANE。これらの物質は有害です。ドラフト内で安楽死を実行し、機関のガイドラインに従って物質を取り扱います。 （注意：CO 2：H280、P410、P403、イソフルラン：H361d、P260、P281、P280）
    1. げっ歯動物が死んでいることを確認するために、ピンセットで足をつまんで反射が存在しないことを確認してください。大きなはさみを使用して、げっ歯類を刎ねます。子犬のために、断頭により安楽死させます。

脊柱の3分離

  1. 髪を制御するために毛皮に水を振りかけます。
  2. ハサミを使用して、遠位方向に脊柱に沿って毛皮を開いてカットし、骨盤骨過去の脊柱に沿って両側に切断することにより、脊柱を分離します。ハサミで骨盤骨に遠位脊髄をカットします。
    注：吻側 - 尾側軸は、プロトコルを通して近位 - 遠位軸として示されています。
    1. proximal-を回避するためにハサミを使用して脊柱をトリムこれらのようなほとんどと最も遠位の領域があまりにも成功した脊髄押出にS字型の脊柱をレンダリングすることができます。脊髄が両端に表示されていることを確認してください。脊髄が表示されていない場合、脊髄が見えるようになるまで、ハサミで脊柱をトリム。

脊髄の4油圧押出

  1. 氷上で滅菌PBSで満たされたペトリ皿（直径100mm）を配置します。
  2. これにより、できるだけ多くの脊柱を矯正、脊柱の屈曲部（最も近位端）に人差し指を適用することによって、脊柱をまっすぐにします。
    1. 椎骨は不可能脊髄押し出しをレンダリング中断されますように子犬のために、背骨を曲げません。
  3. 脊柱の最遠位端にピペットチップ（子犬用23 G針、成体マウスのための代わりに18 G針）を挿入します。正しく挿入した場合、先端が脊髄空洞内に安定化されます。
  4. 脊柱は、可能な限りまっすぐにされていることを確認してください。安定した圧力を適用し、氷上のペトリ皿に脊髄を押し出します。脊髄がさらに取り扱いまで、PBS中でそれを維持することによって氷の上に湿った保たれていることを確認してください。

figure-protocol-1
図1： 代表的脊髄。油圧で脊髄を押し出さ。成体ラット、成体マウス、マウスの子犬：左から右。ボックスでマークされた腰椎拡大。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

後根神経節の5識別（DRG）を切り出し、

  1. はさみを使用して2つの等しい縦の部分で脊柱を分割し、顕微鏡下で分割脊柱を配置します。
  2. によってT13の椎骨セグメントを特定します近くの肋間神経で肋骨を混同しないように注意を払って脊柱上の最遠位肋骨の付着部位の位置を特定します。最遠位肋骨はT13の椎骨セグメントの近位部に装着され、T13 DRGは、椎骨T13にし、近位椎骨L1に遠位に位置しています。
  3. 遠位方向に付随したDRGを識別します。成体ラットの場合、付随DRGを明確に見える背側と腹側の根の白い表示されます。成体マウスの場合、付随DRGを明確に見える背側と腹側の根の白い表示されます。子犬のために、付随DRGをクリア球を表示されます。

figure-protocol-2
図2：脊髄の押出後の脊柱内のDRGの同定。脊柱は、矢印で示すようのDRGの可視化を可能に分割されています。成体ラットとマウスの子犬によって例示。 REF = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55226/55226fig2large.jpg"ターゲット= "_空白">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

DRGの6の単離

  1. 特定のDRGに従って番号ペトリ皿（直径30mm）を、例えば 、L3、L4、L5、単離することができます。氷冷滅菌PBSでペトリ皿を記入し、氷の上に置きます。
  2. マイクロはさみを使用して、背側とのDRGにダメージを与える避けながら、それらを解放するためにできる限りのDRGに近い腹側根をカット。
  3. 閉じたピンセットの先端で、軽くのDRGをかき出すと、対応する番号のペトリ皿に移します。

figure-protocol-3
図3：代表単離したDRG。成体ラット、成体マウス、マウスの子犬：左から右。"_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

さらなる分析のための組織の7.処理

  1. ウエスタンブロット法
    1. 脊髄腰膨大例えば 、関心の組織領域を分離します。必要に応じて、同側および対側の側面に脊髄を分離し、さらに背側と腹側の角へ。
    2. このような氷の上の適切な酵素阻害剤を含むTNE溶解緩衝液（10mMトリス塩基、150mMのNaCl、1mMのEDTA、二重蒸留H 2 O中1％NP40）などの溶解緩衝液中で組織を置きます。
    3. 機械的粉砕乳棒を用いて氷上で約30秒のための組織をホモジナイズします。
    4. 4℃で16,000×gで15分間遠心分離し、標準的なプロトコル5、6に従って、さらなる処理のために上清を使用したり、さらに使用するまで-20℃で上清を保ちます。
  2. RNA分析
    1. 目的の組織を分離します。
    2. すぐにストレージのためのRNAを安定化するために、RNAの安定化溶液中の組織を置きます。
    3. 標準プロトコル7に記載の RNAを分離します。
    4. RNAをcDNAに変換し、標準的なプロトコル7に従って定量PCRを行います。
  3. 免疫組織化学
    1. （脊髄に適用）新鮮凍結組織の場合：
      1. 粉大さじ2杯に相当する量にドライアイスキューブを粉砕してドライアイス粉末を準備します。布でドライアイスキューブをカバーし、ハンマーを使用してキューブを粉砕。ドライアイスキューブの層の上に銀箔（約5cm×5センチ）を配置し、ドライアイス粉末と銀箔をカバーしています。
      2. ピンセットを用いて、ドライアイス粉末にさらなる分析のために選択された脊髄領域を配置し、それは、スナップ凍結し、クライオチューブに脊髄を転送してみましょう。すべての回で、ドライアイス上でそれを維持するか、または私達を促進するまで-80℃で保管してください電子。
      3. クライオスタット（-20℃）に脊髄を転送します。必要な場合は、クライオスタット内部の脊髄をトリミング。試料ディスクにアタッチするために、クライオスタット内部の材料を埋め込むに脊髄を置きます。
      4. 例えば 5μmで、所望の厚さで脊髄を切断し、ガラス板上に集まります。より良い結合のための組織収集に直前に指でガラス板を加熱します。さらに使用するまで-80℃で凍結チューブ中の残った組織を保ちます。
      5. 定着後の準備ができるまで、クライオスタット内部のガラス板上のセクションを残します。
      6. 室温で10分間、4％PFAに浸漬することによってセクションをポスト修正。
      7. 標準プロトコル8に従って染色実行します。
    2. （脊髄およびDRGをに適用）切片凍結のために固定された組織
      1. 4％PFA（脊髄のための2時間、マウスのDRGのための1.5時間およびラットのDRGのため4時間）で脊髄とのDRGを修正しました。4°C（水平位置にある場所脊髄が曲がった位置に固定するのを防ぐため）。
      2. 4℃で一晩w / vスクロース25％に組織を転送します。組織は、さらなる使用まで4℃で微生物汚染を防止するために、10％のアジ化ナトリウムを数滴を補充w / vスクロース25％に格納することができます。必要な場合は、唯一のシリコーンボードまたは類似の上に腰膨大を補うために脊髄をトリミング。
      3. ペーパータオルの先端を使用して、組織から過剰なスクロース溶液を吸引します。
      4. 材料を埋め込むと低温の金型半埋めます。このような閉じたピンセットなどのツールでクライオ金型の側面に気泡を押してください。
      5. ピンセットを使って埋め込む材料に組織を置き、所望の組織の向きを確認してください。
      6. 材料を埋め込むで完全に凍結型を充填し、遠く（閉じたピンセットを用いて、 例えば ）可能な限り組織から任意の気泡を押し出します。
      7. ペトリ皿（100ミリメートルを埋めます2-メチルブタンと直径）インチこの物質は有害です。ドラフト内で、このステップを実行し、機関のガイドラインに従って物質を処理する（注意：H224、H304、H336、H411、P210、P280、P273、P301、P331、P304 / P340、P309 / P310）。
      8. ドライアイスの層の上にペトリ皿を置き、ペトリ皿に2ドライアイスキューブを追加します。ペトリ皿にクライオ金型を置き、埋め込む物質が完全にフリーズすることができます。
      9. さらなる処理までパラフィルムで包んですべての回で、または-80℃のドライアイス上包埋組織を保管してください。
      10. クライオスタット（-20°C）で所望の厚さに組織、 例えば 5μmでカットします。
      11. 標準プロトコル8に従って染色実行します。
    3. （脊髄およびDRGをに適用）パラフィン包埋のために固定された組織
      1. 4°C（場所脊髄で4％PFA（脊髄のための2時間、マウスのDRGのための1.5時間およびラットのDRGのため4時間）で脊髄とのDRGを修正しました。水平に）曲がった位置に固定するのを防止します。
      2. 4℃で一晩w / vスクロース25％に組織を転送します。組織は、さらなる使用まで4℃で微生物汚染を防止するために、10％のアジ化ナトリウムを数滴を補充w / vスクロース25％に格納することができます。
      3. 脊髄腰膨大例えば 、関心の組織領域を分離します。
      4. パラフィンで包埋モールドを半埋めます。
      5. 少しパラフィンを硬化させるために埋め込み機の冷却領域にそれを置くことによって埋め込むモールド簡単にクールダウン。これは、良好な組織の位置決めを可能にします。
      6. 埋め込み型内の所望の方向に組織を置きます。パラフィンで包埋型を記入し、直ちに冷却します。
      7. それは完全に硬化と埋め込み型から組織を含むパラフィンブロックを削除できるように、4℃で一晩パラフィン含有の埋め込み型を置きます。
      8. Oセクションをカット所望の厚さ、 例えば 5ミクロンでミクロトームナ。
      9. 標準プロトコル8に従って染色実行します。

結果

油圧で押し出された脊髄は、図1に示す滑らかな損傷を受けていない面が表示されます。腰部拡大が容易図1の箱入り脊髄の肥厚領域として識別することができます。脊髄の背側と腹側の側面は、形態に応じて目で確認することができます。 図1では、腹側は、脊髄全体に沿って明確な正中線によって同定、視聴者に直面しています。脊髄に沿った2つの広いラインは、背側の識別を可能にします。最遠位端で、馬尾は時々成体ラット及び成体マウスに付着したままであってもよいです。

脊柱、 図2に位置しながら、個々のDRGを唯一同定することができます。隔離、 図3に続いて、個々のDRGを外観によって識別することはできません。必要に応じて、それゆえあります明確に分離時に分離しておくことが重要。ステップ7.3において概説し、 図4に示すように分離した後に、脊髄およびDRGを処理して染色することができます。 図4aは、ニューロンとその周囲の衛星グリア細胞がはっきりと見えるDRGセクションの免疫組織化学染色を示しています。 DRGを正しく識別することにより、損傷したニューロンの細胞体に、並びにそれらの周囲の衛星グリア細胞の坐骨神経損傷の効果を分析することが可能です。 図4bは、セクションの滑らかなエッジに反映されるように組織が無傷である油圧で押し出された脊髄のニッスル染色を示します。

figure-results-1
図4：代表組織切片。 。 DRGセクションの免疫組織化学染色。 B。ニッスル染色した切断面油圧で押し出された脊髄のn個。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

脊柱が乱された場合、頚椎脱臼により、例えば 、脊髄は、押出中に分割されます。脊髄を押し出すことができない場合、脊柱は両端でわずかにトリミングすることができ、押出試行を繰り返すことができます。ケースで脊髄全体がすなわち子宮頸部の拡大だけでなく、腰膨大からなる、さらなる分析のために必要とされ、脊柱は、ほんの少しだけトリミングする必要があります。唯一の腰膨大をさらなる分析のために必要とされている場合は、脊髄を本プロトコルに従ってトリミングされるべきです。脊柱は、押し出しを容易にするために指先を使ってまっすぐにする必要があります。

プロトコルは、すべての年齢のげっ歯類に適用可能であり、ここで成体マウス（8週）、マウスの仔（5日間）および成体ラット（10週間）が例示されます。動物のタイプおよび株に依存して、胸部および腰部セクションの数は、9を変えることができます 10、11。解析対象とするタンパク質に応じて、大人の齧歯類は、前安楽死への酵素阻害ソリューションで灌流することができます。片側神経損傷を伴う実験を行う場合、脊髄はすぐに押出後に超微細ピンセットを用いて、同側と反対側の側面に分割することができます。さらに、各側面は、背側と腹側とに分割することができます。組織は、その後さらなる分析、 例えば、ウェスタンブロッティングのために処理することができます。

これは、脊髄非可撓性をレンダリングし、脊髄油圧押し出しを防止するような先行脊髄押出PFAとTranscardial灌流固定は、避けるべきです。油圧脊髄押出は、後根をはがすます。添付の背側根が必要な実験のために、椎弓切除術が推奨されます。また、脊髄髄膜は、標準的椎弓切除することによって回避することができる油圧押し出し、によって失われます 3。

脊髄とDRGの分離の水圧押出し代わり氷冷PBSの酸素人工脳脊髄液（ACSF）を用いて実施することができます。 ACSFの使用は、その後の電気生理学的記録12、13の場合には特に重要である優れた生理的環境において、単離された組織の保存を可能にします。 ACSFの代わりに、一次DRG培養物14の生成のためには1g / Lのグルコースを含有するPBSであってもよいです。

脊髄の水圧押出しは、組織処理時間を短縮し、したがってタンパク質の損傷の危険性を減少させる、椎弓切除術により脊髄分離する従来の方法よりも大幅に速い方法です。固定液で灌流前切開中および最終的な除去の間に組織損傷の危険性を減少させることができる椎弓切除術により脊髄を単離します脊柱から脊髄。しかし、組織の固定は、例えば、ウェスタンブロットなどの分析への適用を排除します。油圧押出利回り分析の広い範囲に適した構造的損傷を受けていない組織3。

DRGの一貫性の識別が困難な場合があります。しかし、これは、 例えば 、坐骨神経損傷後、組織分析のために不可欠です。肋骨へのそれらの局在の相対に従ってのDRGに番号を付けることにより、DRGを一貫して識別することができます。 DRGの脊髄組織の染色ならびにプロトコルステップ7で概説図示組織治療変形を実行することによって最適化することができます。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

撮影と編集をしてくださったオーフス大学のDavid Kielに感謝いたします。VirtualDubソフトウェアは、顕微鏡ビデオシーケンスの処理に使用されました。機器へのアクセスを提供してくださったデンマークのトランスレーショナルニューロサイエンス研究所(DANDRITE)、Nordic EMBL Partnership、オーフス大学研究財団、EU 7FPプロジェクトPAINCAGE、Det Frie Forskningsrad(DFF)、および資金を提供してくださったThe Lundbeck Foundationに感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ボンはさみ、極細、ストレート、8.5 cmF.S.C. (Fine Science Tools)# 14084-08DRG(成体マウス、成体ラット)の分離前に脊髄を切り開くため。他のメーカーが使用することができます
遠心分離機 Eppendorf# 5427 R均質化された組織の遠心分離用
クライオスタット ミクロトームライカバイオシステムズ # CM 3050 S染色前に埋め込まれた組織を切断するため;他のモデルとメーカーは
、鉗子、デュモン、#3F.S.C. (ファインサイエンスツール)#11231-30後の脊髄の取り扱いに使用できます。他の製造業者/タイプは、
鉗子、デュモン、#5F.S.C. (Fine Science Tools)#11252-20DRG(成体マウス、成体ラット、子犬)の分離に使用できます。他のメーカーは、
イソフルラン(フラン)IsoFlo Vet 100%Abbott#002185安楽死のために使用することができます。他のメーカーを使用することもできます。注意:有毒
イソペンタンGPRレクタプールVWR化学物質#24872.298スナップ凍結用。他のメーカーを使用することもできます。注意:有毒
ミクロトームライカバイオシステムズ#RM 2155フィン包埋組織の切片化用。他のモデルとメーカーは、
パラフィンワックスペレットSigma-Aldrich#76243パラフィン埋め込み用を使用することができます。他のメーカーは、
パラフィン組織包埋ステーションLeicaBiosystems#EG1160後の切片化のための組織のパラフィン包埋用に使用できます。他のモデルとメーカーは、
ペレットペステル、モーターコードレスシグマアルドリッチ#Z359971-1EAスタンブロッティングの前に分離された組織の機械的均質化のために使用することができます。他のメーカーは
、シャーレ、35ミリメートルモフィッシャーサイエンティフィック#121V分離DRGのストレージに使用することができます。他のメーカーとサイズは
、ペトリ皿、100ミリメートルグマアルドリッチ#P7741脊髄押出し用使用することができます。他の製造業者およびサイズは
スファターゼ阻害剤、PhosstopSigma-Aldrich#04906845001ホスファターゼ阻害剤カクテルを使用してもよい。他のメーカーは、
ピペットチップ、1-200 μを使用することができます。L、フィルターなしSarstedt# 70.1189.105油圧押出用;他の製造業者は
、プロテアーゼ阻害剤、コンプリートシグマ-アルドリッチ#05892791001プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用してもよい。他のメーカーは、
RNAlaterソリューションSigma-Aldrich#R0901保存のためのRNA安定化に使用することができる。他のメーカーは、
Rneasy Protect Mini KiTQiagen#74124。他のメーカーはメスを使用することができる
。スワン・モートン外科用ブレード No. 11スワン・モートン# REF0203脊髄腰部の隔離用。他のメーカー/タイプは
、はさみ、ストレート、タイプ3、25ミリメートルの刃先Bochem#4070椎の分離のために使用することができます。他のメーカー/タイプは、
さみ、130ミリメートルの刃先Hounisen#1902.0130髄(成体ラット)の分離のために
スプリングハサミ、ストレート、8ミリメートルの刃先F.S.C.(ファインサイエンスツール)#15009-08DRGs(子犬)の分離前に脊柱を切り開くため、およびDRG(成体マウス、成体ラット、子犬)の分離のために;他のメーカーは、
標準シリンジ、2.5 mL、5 mL、10 mLテルモ#SS02SE1;#SS05SE1;#SS10SE1油圧押出用;他の製造業者は対
物レンズ1Xおよび接眼レンズ10Xの実体顕微鏡MZ12.5Leica# 10446370他の製造業者/タイプは使用することができます
滅菌PBSGIBCO# 10010-015油圧押出しのため;また、標準的なプロトコルに従って作ることができる
シリンジ針 23 G x 1インチ、0.6 x 25 mmテルモ・ネオラス# NN-2325R子犬の油圧押出用;他のメーカー/タイプは、
シリンジ針18 G x 1 1/2、1.2 x 40ミリメートルモNeolus#NN-1838S大人のマウスの油圧押出のためのピペットチップの代替品を使用することができます。他の製造業者は、
Tissue-TekSakura#4583Tsue包埋材料を後で凍結切片化するための
TNE-溶解バッファーVWR化学薬品#10128-582ウェスタンブロッティング前の組織溶解用;他のメーカーを使用することもできます。また、標準的なプロトコルに従って作成することもできます
押出な組織のなパラウェサーシ、必要に応じてTNE溶解バッファーに追加するためのホ、必要に応じてTNE溶解バッファーに添加するためにをRNA分離のためにを使用することができます脊は脊を使用することができます テル材料を使用することができます

参考文献

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