方法論記事

神経筋接合部機能を測定

DOI：

10.3791/55227

⸱

2017年8月6日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ と筋肉の両方の機能を総合的に評価するためのプロトコルについて述べる。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経筋接合部 (NMJ) 機能は運動ニューロンと筋肉の間の通信障害、加齢、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの病気を勉強して極めて重要な役割を果たしています。ここで述べる NMJ 機能を電気刺激の 2 つのタイプを組み合わせることで測定するために使用することができます実験的プロトコル: 筋膜刺激と神経を通して刺激を直接します。これらの 2 つの異なる刺激に対する筋反応の比較は、筋肉の機能低下につながる略記で潜在的な変化の機能レベルで定義する助けることができます。

Ex vivo準備はよく統制された研究に適しています。ここで筋肉と NMJ 機能ヒラメ坐骨神経の準備のため、ダイヤフラム横隔神経の準備のためのいくつかのパラメーターを測定するための集中的なプロトコルについて述べる。プロトコルは約 60 分を持続し、カスタムメイドによる間断なく行われている収縮動態特性、筋肉や神経の刺激の力周波数の関係と 2 つパラメーター NMJ 機能に固有すなわち神経伝達障害と intratetanic の疲労を測定するソフトウェア。この方法論は、SOD1G93Aトランスジェニック マウス、普遍的突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) を染色 ALS の実験モデルを用いたヒラメ筋と横隔膜筋の準備で損害を検出する使用されました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神経筋接合部 (NMJ) は、筋線維の運動終板と運動ニューロンの軸索の端末間の接続によって形成される化学シナプスです。略記は、筋肉と神経との間の通信が高齢化や筋萎縮性側索硬化症 (ALS) が発生すると、障害に重要な役割を再生する示されています。筋肉や神経は、双方向の方法1,2通信、筋肉奇形とは切り離して NMJ 欠陥を測定することができるという、physiopathological の相互作用に新たな洞察があります。確かに、この機能の評価は、形態や生化学的変化を減らす神経伝達機能を伝達するかどうかを評価するために役立つことがあります。

神経刺激と同じ筋に、膜の直接刺激によって誘発される応答による筋収縮反応の比較は NMJ 機能の間接測定として提案されています。確かに、膜刺激パスによって神経伝達シグナル、以来 2 つの収縮応答の違いと思われる略記で変更します。このアプローチをラット3,4,5,6、7、広く提案されており、またマウス モデル8,9,10、11,12に関する情報を収集するために使用します。

ここでは、私たちは消費税し、2 つの筋の準備、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔の準備をテストする手順の詳細に説明します。特注を使用してソフトウェア、考案した NMJ と筋肉の両方の機能を特徴付けるいくつかの測定を組み合わせた連続的なテスト プロトコルそれにより筋肉の別々 に NMJ 損傷の包括的な評価を降伏します。特に、収縮力と筋の動態、直接力周波数曲線, 神経刺激、発砲とテタヌス周波数と intratetanic 疲労7の両方の神経伝達障害13プロトコルを測定します。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物実験は、ローマのサピエンツァ大学の倫理委員会によって承認され、現在の動物保護に関するイタリアの法律に従って行われました。

1. 実験的な設定

  1. アクチュエータ/トランスデューサー1個、刺激装置2個、体外運動器1個、調製組織浴1個、吸引電極1個、デジタルオシロスコープ1個、実体顕微鏡1個、冷光照明器1個、取得ボード1個、コネクタブロック1個、パソコン1台で構成される実験システムのセットアップ
    注:ここでは、コマンドソフトウェアはLabViewでプログラムされ、刺激の高い柔軟性、精度、再現性を保証するように設計されています。各刺激について、ユーザーはパルス幅、周波数、持続時間を選択し、それが膜に送達されるか神経を介して送達されるかを決定できます。また、各刺激の前の休息時間の長さを選択することもできます。

2. ヒラメ筋と横隔膜筋のNMJ収縮特性の評価

  1. システムのウォームアップ
    1. Krebs Ringer buffer14を用意し、実装装置と準備組織浴の浴に入れます。4mlのシリコンで調製した60mmの皿を準備用ティッシュバスに入れます。
    2. 循環水浴の電源を入れ、ヒラメ筋の温度を30°C、横隔膜筋の温度を27°Cに設定します。
    3. 95%O2〜5%CO2混合物を両方の浴に流し込みます。
    4. アクチュエータ/トランスデューサーと2つのパルス刺激装置をオンにし、電流値を膜刺激の場合は300 mA、神経刺激の場合は5 mAに設定します><。 注:300 mAの電流値は、D-ツボクラリンを溶液15に追加した場合、神経枝に大きな収縮を誘発しないことが以前に示されています。5mAの電流値は、溶液によって誘発される膜刺激と重なることなく、神経を介して筋肉を刺激するために必要な電流量に対応します。吸引電極と筋肉の間の距離は神経の長さに依存するため、以下で説明するように、各実験の前にこの電流値を慎重に調整する必要があります。
  2. ヒラメ筋と横隔膜の解剖
    1. 頚椎脱臼によってマウスを犠牲にして苦痛を最小限に抑え、次のようにすぐに筋肉を切除してテストします。
    2. ヒラメ肉質坐骨神経の調製、解剖、およびセットアップ
      1. マウスの脚に70%エタノールをスプレーし、脚を覆っている皮膚を取り除き、ハサミで脚の上部を切開し、皮膚をしっかりと引っ張ります。アキレス腱を脛骨から分離し、ハサミでアキレス腱を切断します。
      2. 一対の鉗子で腱をしっかりと固定し、腓腹筋をヒラメ筋と一緒にそっと引っ張ります。ヒラメ筋の近位腱が露出したら、アキレス腱を保持したまま、はさみでふくらはぎ全体をカットします。直ちに組織サンプルを調製組織浴に入れる。
      3. 準備槽を実体顕微鏡の下に置き、直径0.20mmのステンレス製ピンを使用して子牛をシリコンディッシュに固定します。一対の鉗子を使用して、ヒラメ筋の近位腱を固定し、そっと引っ張って坐骨神経支配を露出させます。
      4. 神経支配が露出したら(図1)、神経の約5mmを露出させるために周囲の組織を慎重に除去します。細いハサミを使って神経を切断します。ヒラメ筋を近位腱に鉗子でしっかりと固定しながら、再度引っ張ってハサミでアキレス腱を切って切除します。
      5. アクチュエータ/トランスデューサーのレバーアームの穴にナイロン線を通します。ワイヤーの端に縄を作り、アキレス腱をつかんでから、筋肉が取り付け装置の浴槽に到達するまでワイヤーを引き戻します。近位腱を固定クランプ内に固定し、ナイロンワイヤーをレバーアームに結びます。溶液中で筋肉が平衡化するのを待ちます。
      6. 最適な初期長さ (L0) を決定します。
        1. まず、筋肉を伸ばして10mNでプリロードします(この値は最大twitch力を保証します（経験に基づく))。次に、筋肉を優しく伸ばしてプリロードを変更し、一連のシングルパルスで筋肉を刺激します。最適な長さは、最大収縮力を測定すると達成されます。
    3. 横隔膜の調製、解剖、およびセットアップ
      1. マウスの皮膚に70%エタノールをスプレーします。横隔膜の筋肉を覆っている皮膚をはさみで胸骨を切開し、皮膚をしっかりと引っ張って取り除きます。
      2. ハサミで腹部を胸骨より下に水平に切り込み、一対の鉗子で腸と臓器をやさしく取り除きます。太いハサミを使って背骨を切ります。
      3. 胸骨の上でリブを約1cm切り、水平に進みます。一対の鉗子で外側の臓器をそっと取り除き、背骨を切って横隔膜を含む肋骨の円形のリングを作ります。
      4. 調製物をクレブスリンガーバッファーを含むディッシュで洗浄し、上面を上にして胸骨を前に向けて、調製ティッシュバス内のシリコンディッシュに入れます。
      5. 実体顕微鏡を使用して、肺と残りの臓器を慎重に取り除きます。右側に横隔神経が見えます（図2A)。
      6. ダイヤフラムに沿って約2mmのリングを残すようにリブをトリミングします。
      7. 鉗子を使用して、横隔神経神経支配に対応する点の横隔膜中央腱に直径0.20mmのステンレス鋼ピンを1本固定し、同じ軸上の肋骨に別のピンを固定して、目的の横隔膜ストリップを特定します。
      8. 選択したストリップの両側の中央の腱に追加の2つのピンと、別の2つのピンをリブに固定して、ダイヤフラムをレイアウトします。必要に応じて、鉗子を使用して周囲の結合組織から横隔神経を洗浄します。
      9. 湾曲したブレードを使用して、神経支配の両側で横隔膜を切断し、図2Bに示すように、腱-筋-肋骨ストリップを特定します。
      10. アクチュエータ/トランスデューサーのレバーアームの穴にナイロン線を通します。ワイヤーの端に縄を作り、腱をつかんでから、筋肉が取り付け装置の浴に到達するまでワイヤーを引き戻します。
      11. 固定クランプ内にリブを固定しますamp レバーアームの周りにナイロンワイヤーを結びます。
      12. 筋肉が溶液中で平衡化するのを待ち、初期の最適な長さ(L0)を決定します。
        1. 筋肉を伸ばして、5mNでプリロードします。筋肉をやさしく伸ばしてプリロードを変更し、一連のシングルパルスで筋肉を刺激します。最適な長さは、最大収縮力を測定すると達成されます。

figure-protocol-1
図1 - ヒラメ筋坐骨神経の準備。機能検査のための外科手術中のヒラメ筋坐骨神経。坐骨神経は一対の鉗子を使用して露出します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-2
図2 - 横隔神経の準備写真は、大腸横隔神経準備切除術(A)と機能検査用ストリップ(B)の段階を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 筋肉の収縮性とは別にNMJ特性を測定する
    1. 神経を介した刺激に最適な電流強度を設定し、吸引電極を介して供給される電流パルスが、浴中の電流の広がりによって筋肉の収縮を引き起こさないことを確認します。
      1. 吸引電極を筋肉の近くに置き、神経を引き込みます。電流強度を緩やかに増加させながら(5mAから)、一連の単一パルスで筋肉を刺激します。最適な電流値は、twitch forceが最大になったときに決定されます。
      2. 神経を電極から押し出し、いくつかの単一パルスを送達します。溶液による膜刺激との重なりによって筋肉が収縮しないことを確認してください。再び神経を引き込みます。
    2. プログラムを起動し、入力ファイルを選択して目的のテストプロトコルを実行します。
      注:入力ファイルには、プロトコル全体を実行するために必要なすべての刺激パラメータが含まれています。2つの筋肉には同じプロトコル構造が使用されますが、刺激パラメータはプロトコルによって異なります:ヒラメ筋または横隔膜の筋肉を指します。
      1. ヒラメ肉 - 坐骨神経刺激(表1を参照)
        1. すべての電気刺激には、坐骨神経刺激に1.4 ms、直接ヒラメ筋刺激に0.1 msのパルス幅を使用します。完全なプロトコルは約 65 分間続きます。
      2. 横隔膜神経刺激(表2を参照)
        1. すべての電気刺激には、横隔神経刺激に1.8 ms、直接横隔膜刺激に0.2 msのパルス幅を使用します。完全なプロトコルは約55分続きます。
      3. 実験プロトコルの最後に、0.05 mm精度のアナログキャリパーと0.1 mg精度の精度スケールを使用して、筋肉の長さと湿重量をそれぞれ測定します。
        1. 断面積(CSA)は、筋肉量を最適な繊維長(Lf)と哺乳類の骨格筋の密度(1.06 mg/mm3)16.<br />の積で割ることにより計算します。 注:Lfは、L0に繊維の長さ/筋肉の長さの比率(ヒラメ筋の場合は0.7116、横隔膜筋の場合は117)を掛けて求められます。
名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 ます。 名 名 ます。
実験の種類周波数期間繰り返し筋肉または神経刺激目的
(ヘルツ)(S)
引き攣りシングルパルス1筋肉Twitchの力と動力学
休む30
引き攣りシングルパルス1神経
休む30
引き攣りシングルパルス1筋肉
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引き攣りシングルパルス1神経
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未融合破傷風400.81神経神経と筋肉の刺激の力/周波数曲線
休む180
未融合破傷風600.81筋肉
休む180
融合破傷風800.81神経
休む180
未融合破傷風200.81筋肉
休む180
未融合破傷風600.81神経
休む180
融合破傷風800.81筋肉
休む180
未融合破傷風200.81神経
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未融合破傷風400.81筋肉
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疲労パラダイム350.81 筋肉刺激に続いて 14 回の神経刺激をそれぞれ 1.2 秒の休息時間で 20 回繰り返し神経伝達障害(NF)
休む900
疲労パラダイム800.81 筋肉刺激に続いて 14 回の神経刺激をそれぞれ 1.2 秒の休息時間で 20 回繰り返し神経伝達障害(NF)と脳内疲労(IF)

表1 - ヒラメ筋坐骨神経刺激プロトコル。この表は、ヒラメ筋坐骨神経の準備をテストするための完全なプロトコルを形成する一連のテストを示しています。

名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 名 ます 名 名 ます
実験の種類周波数期間繰り返し筋肉または神経刺激目的
(ヘルツ)(S)
引き攣りシングルパルス1筋肉Twitchの力と動力学
休む30
引き攣りシングルパルス1神経
休む30
引き攣りシングルパルス1筋肉
休む30
引き攣りシングルパルス1神経
休む120
未融合破傷風600.51神経神経と筋肉の刺激の力/周波数曲線
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融合破傷風1000.51筋肉
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未融合破傷風400.51神経
休む120
未融合破傷風200.51筋肉
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未融合破傷風800.51神経
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未融合破傷風800.51筋肉
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未融合破傷風200.51神経
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融合破傷風1000.51筋肉
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融合破傷風1000.51神経
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未融合破傷風600.51筋肉
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疲労パラダイム350.331 筋肉刺激に続いて 14 回の神経刺激をそれぞれ 0.67 秒の休息時間で 20 回繰り返し神経伝達障害(NF)
休む900
疲労パラダイム800.331 筋肉刺激に続いて 14 回の神経刺激をそれぞれ 0.67 秒の休息時間で 20 回繰り返し神経伝達障害(NF)と脳内疲労(IF)

表2-横隔膜神経刺激プロトコル。 この表は、横隔膜神経の準備をテストするための完全なプロトコルを形成する一連のテストを示しています。

3. データ分析

注:プロトコルの最後に、必要なすべてのパラメータを次のように計算します。

  1. シングルパルス刺激から
    1. twitch 力(mN;twitch中に生成される最大有効力)と比twitch力(mN/mm2)を計算します。これは、初期初期荷重値を筋肉によって生成される最大力に差し引くことによって計算します。比筋力は、筋 CSA で割った筋力として計算します。
    2. パルス解放からトゥイッチフォースまでの時間として、ピーク張力までの時間(TTP)(ms)を計算します。
    3. 半緩和時間 (1/2RT) (ms) を、twitch forceからtwitch forceの50%までの時間として計算します。
    4. 収縮相中の力導関数の最大値として dF/dt (mN/ms) を計算します。
    5. -dF/dt (mN/ms) をリラックスフェーズ中の力微分の最大値として計算します。
  2. パルストレインの刺激から
    1. 非融合力(mN)と比非融合力(mN/mm2)を計算します。これは、初期初期荷重値を筋肉によって生成される最大力に差し引くことによって計算します。非融合力の比を、非融合力を筋肉 CSA で割ったものとして計算します。
      注:非融合力は、テタニック号の周波数よりも低い周波数のパルス列中に生成される最大有効力です。
    2. 破風力(mN)と比破風力(mN/mm2)を計算します。最大力は、破傷風の周波数で送達されるパルス列中に生成される最大有効力です。これは、初期初期荷重値を筋肉によって生成される最大力に差し引くことによって計算します。比破傷風力は、破傷風力を筋肉CSAで割ったものとして計算します。
    3. 力-周波数曲線を計算します。各刺激で得られる力(または特定の力)の値と、刺激の増加頻度をプロットします。通常、それは単一のパルス刺激から始まり、破傷風の周波数で終わります。
  3. 疲労パラダイムから
    1. 神経伝達障害(NF)を次のように計算します:
      figure-protocol-3
      ここで、MFは筋肉刺激後の力減少、Fは神経刺激後の力減少であり、筋肉刺激後の最初のパルス列で測定されます。
    2. 線路疲労 (IF) を次のように計算します:
      figure-protocol-4
      ここで、Flpは最後の刺激パルスで筋肉によって生成される力であり、FMは同じパルス列中に筋肉によって生成される最大力です。神経刺激については、直接刺激直後の最初のパルス列で内的疲労を計算します。

4. 統計分析

注:統計分析モデルは、神経と膜の両方の刺激に対する筋肉の反応が同じ動物モデル内で比較されるか、2つの異なる動物モデル間で比較されるかに応じて選択する必要があります18,19。

  1. 直接刺激と間接刺激に対する筋肉の反応のみを比較する場合は、TTP、1/2RT、dF/dt、-dF/dtのスチューデントt検定を使用します。2つの異なるマウス系統から得られた筋肉調製物を比較する場合は、刺激タイプとマウス系統を固定因子とする2因子分散分析を使用します。二元配置分散分析で有意な結果が返された場合は、多重比較検定を使用して統計的な差を検索します。
  2. 力-周波数曲線(直接刺激と間接刺激に対する筋肉の反応のみを比較する場合)には、刺激タイプと刺激の頻度を固定因子とする2元配置分散分析を使用します。必要に応じて、複数の比較テストを使用します。
    1. 2つの異なるマウス系統から得られた筋肉調製物を比較する場合は、刺激タイプ、刺激の頻度、およびマウスの系統を固定因子とする3元配置分散分析を使用します。
      1. 3元配置分散分析で因子動物系統と刺激タイプの有意な効果が得られる場合は、二元配置分散分析を使用して、一度に2つのグループ間の有意差を特定します。例えば、膜刺激に対する2つのグループの筋肉反応の違い、または1つのグループ内の直接刺激と間接刺激に対する筋肉反応の違いを評価することができます。
  3. Intratetanic Fatigue
    注:プロトコルは、コントロールマウスでも神経刺激に応答して疲労を誘発するように設計されていたため、このパラメータは2つのマウス系統間の違いを調査するためにのみ使用でき、1つのグループ内の統計分析は常に有意な違いをもたらします。
    1. 2つのグループを比較するには、刺激の種類、時間、およびマウスの系統を固定因子として3因子分散分析を使用します。3元配置分散分析が因子動物株と刺激タイプの有意な効果をもたらす場合、力-周波数曲線と同様に、2元配置分散分析を使用して、一度に2つのグループ間の有意差を特定します。
  4. 神経伝達障害の場合は、動物系統と時間を固定因子とする2因子分散分析を使用します。有意な結果が返された場合は、多重比較検定を使用して統計的な違いを検索します
    注:このパラメータはマウス系統ごとに1つの値しか返さないため、異なるマウスモデルを比較することができます。
  5. 筋肉の重量、長さ、およびCSAについては、スチューデントのt検定を使用して、異なる動物モデルの筋神経製剤を比較する際の差を調査します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々 が説明されたプロトコルでは、いくつかの神経筋疾患や老化サルコペニア機能神経について説明します。かどうか (その場合は、どのレベルで) は、このプロトコルを使用することができます筋肉の変化がそれ自体筋肉または神経筋伝達で発生する選択の変更によるものです。下図のデータは、我々 グループの18、20疾患の末期で筋萎縮性側索硬化症の SOD1G93Aトランスジェニック マウス モデルの実施による前の仕事の結果です。G93A SOD1 のトランスジェニック マウスでは、突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) 普遍的染色します。図 3 と 4 は、dF/dt とヒラメ坐骨神経 (左) およびダイヤフラム横隔神経 (右) 準備テタヌス力値を示します。これらの結果は、厳密に筋肉自体に関連するものではなく NMJ に関連している遺伝子の筋肉の機能的な欠陥を検出するここで提案する手法の能力を発揮します。確かに、dF/d...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上記実験のプロトコルは、測定、差別または筋肉に直接に発生した任意の機能変化間接的神経筋接合部のレベルでの理想的な方法を提供します。この手法は NMJ 機能の間接測定に基づいているので、かどうか瑕疵は形態学的変化または生化学的変化に関係を確立する使用できません。対照的に、任意の形態学的または生化学的変化が神経伝達シグナルの機能を減らしたかどうかを決定するの効果的な方法を用意します。しかし、力の測定が完了したら、筋肉お風呂から削除、消された、最適の長さで固定、埋め込み化合物に囲まれたできイソペンタンを溶解で急速凍結されました。筋肉は、免疫組織化学的、形態学的分析など-80 ° C 以降の評価のために格納できます。

我々 はここで提案する手法は、初めて NMJ と筋肉の機能を特徴づけるいくつかのパラメーターの測定を組み合わせた実験的テスト プロトコルに基づいています。3 つの重要なポイントは、この手法には、信頼性の高い結果が得られますを確認します。

まず、骨格筋切除は比較的一般的な手法では今、余分な注意が必要、神経を筋肉をそのままに...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者が明らかに何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

筆者らの研究室で仕事に支えられたスタンパーリアラヴェッロ ローマ、テレソン (付与なし。GGP14066)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
デュアルモードレバーシステム オーロラ・サイエンティフィック社300Bアクチュエータ/トランスデューサ
ハイパワーバイフェーズスティミュレーター オーロラ・サイエンティフィック社701Bパルススティミュレータ(神経)
ハイパワーバイフェーズスティミュレータ オーロラ・サイエンティフィック社701Cパルス刺激装置(筋肉)
In vitro Muscle Apparatus オーロラ・サイエンティフィック社800A
準備ティッシュバスRadnoti158400
モノポーラ吸引電極AMシステム573000リファレンス 
オシロスコープ テクトロニクスTDS2014
実体顕微鏡ニコンSMZ 800
冷光照明 フォトニックオプティクスPL 3000
アクイジションボードナショナルインスツルメンツNI PCIe-6353
端子台ナショナルインスツルメンツNI 2110
パーソナルコンピュータAMD Phenom II x4 970プロセッサ 3.50 Ghz Windows 7
LabView 2012ソフトウェアナショナルインスツルメンツ
クレブスリンガー重炭酸塩バッファ シグマ・アルドリッチK4002 生理学的バッファー
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS5761 
塩化カルシウムCaCl2Sigma-AldrichC4901無水、粉末、≥97%
バッファーHEPESシグマ-アルドリッチH3375≥99.5% (滴定)
ディッシュ 60mm x 15mmファルコン353004ポリスチレン
シリコーンシルガード 184シリコーン エラストマーキット  0.5Kg。
サーモスタットDennerleDigitalDuomat 1200
ポンプNewa MiniMN 606水族館用
耐熱性 サーモケーブルラッキー 爬虫類61403-150/60Hz 50W
バケツ任意の 10 リットルポリプロピレン
O2 + 5%CO2siad混合ガス
#5 鉗子 ファインサイエンスツール11252-202アイテム
スプリングハサミ - 8 mm ブレードファイン サイエンス ツール15024-10神経切除
シャープハサミ ファインサイエンスツール 14059-11筋肉除去
はさみワグナー02.06.32動物の
学生のメスのハンドル#3ファインサイエンスツールの外側 91003-12 
メスブレード #10ファインサイエンスツール 10010-00
メスブレード #11ファインサイエンスツール 10011-00
ナイロンワイヤー&オスラッシュ;0.16 mm任意
ー 自家製繊細な

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
  3. Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
  4. Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
  5. Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
  6. Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
  7. Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
  8. Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
  9. Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
  10. Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
  11. Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
  12. Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
  13. Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
  14. Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
  15. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
  16. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
  17. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
  18. Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
  19. Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
  20. Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).

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