Method Article

神経筋接合部機能を測定

DOI:

10.3791/55227

⸱

August 6th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

In This Article

Summary

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神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ と筋肉の両方の機能を総合的に評価するためのプロトコルについて述べる。

Abstract

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神経筋接合部 (NMJ) 機能は運動ニューロンと筋肉の間の通信障害、加齢、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの病気を勉強して極めて重要な役割を果たしています。ここで述べる NMJ 機能を電気刺激の 2 つのタイプを組み合わせることで測定するために使用することができます実験的プロトコル: 筋膜刺激と神経を通して刺激を直接します。これらの 2 つの異なる刺激に対する筋反応の比較は、筋肉の機能低下につながる略記で潜在的な変化の機能レベルで定義する助けることができます。

Ex vivo準備はよく統制された研究に適しています。ここで筋肉と NMJ 機能ヒラメ坐骨神経の準備のため、ダイヤフラム横隔神経の準備のためのいくつかのパラメーターを測定するための集中的なプロトコルについて述べる。プロトコルは約 60 分を持続し、カスタムメイドによる間断なく行われている収縮動態特性、筋肉や神経の刺激の力周波数の関係と 2 つパラメーター NMJ 機能に固有すなわち神経伝達障害と intratetanic の疲労を測定するソフトウェア。この方法論は、SOD1G93Aトランスジェニック マウス、普遍的突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) を染色 ALS の実験モデルを用いたヒラメ筋と横隔膜筋の準備で損害を検出する使用されました。

Introduction

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神経筋接合部 (NMJ) は、筋線維の運動終板と運動ニューロンの軸索の端末間の接続によって形成される化学シナプスです。略記は、筋肉と神経との間の通信が高齢化や筋萎縮性側索硬化症 (ALS) が発生すると、障害に重要な役割を再生する示されています。筋肉や神経は、双方向の方法1,2通信、筋肉奇形とは切り離して NMJ 欠陥を測定することができるという、physiopathological の相互作用に新たな洞察があります。確かに、この機能の評価は、形態や生化学的変化を減らす神経伝達機能を伝達するかどうかを評価するために役立つことがあります。

神経刺激と同じ筋に、膜の直接刺激によって誘発される応答による筋収縮反応の比較は NMJ 機能の間接測定として提案されています。確かに、膜刺激パスによって神経伝達シグナル、以来 2 つの収縮応答の違いと思われる略記で変更します。このアプローチをラット3,4,5,6、7、広く提案されており、またマウス モデル....

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Protocol

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すべての動物実験は、ローマのサピエンツァ大学の倫理委員会によって承認され、現在の動物保護に関するイタリアの法律に従って行われました。

1. 実験的な設定

  1. アクチュエータ/トランスデューサー1個、刺激装置2個、体外運動器1個、調製組織浴1個、吸引電極1個、デジタルオシロスコープ1個、実体顕微鏡1個、冷光照明器1個、取得ボード1個、コネクタブロック1個、パソコン1台で構成される実験システムのセットアップ
    注:ここでは、コマンドソフトウェアはLabViewでプログラムされ、刺激の高い柔軟性、精度、再現性を保証するように設計されています。各刺激について、ユーザーはパルス幅、周波数、持続時間を選択し、それが膜に送達されるか神経を介して送達されるかを決定できます。また、各刺激の前の休息時間の長さを選択することもできます。

2. ヒラメ筋と横隔膜筋のNMJ収縮特性の評価

  1. システムのウォームアップ
    1. Krebs Ringer buffer14を用意し、実装装置と準備組織浴の浴に入れます。4mlのシリコンで調製した60mmの皿を準備用ティッシュバスに入れます。
    2. 循環水浴の電源を入れ、ヒラメ筋の温度を30°C、横隔膜筋の温度を2....

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Results

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我々 が説明されたプロトコルでは、いくつかの神経筋疾患や老化サルコペニア機能神経について説明します。かどうか (その場合は、どのレベルで) は、このプロトコルを使用することができます筋肉の変化がそれ自体筋肉または神経筋伝達で発生する選択の変更によるものです。下図のデータは、我々 グループの18、20疾患の末期で筋萎縮性側索硬化症の SOD1G93Aトランスジェニック マウス モデルの実施による前の仕事の結果です。G93A SOD1 のトランスジェニック マウスでは、突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) 普遍的染色します。図 3 と 4 は、dF/dt とヒラメ坐骨神経 (左) およびダイヤフラム横隔神経 (右) 準備テタヌス力値を示します。これらの結果は、厳密に筋肉自体に関連するものではなく NMJ に関連している遺伝子の筋肉の機能的な欠陥を検出するここで提案する手法の能力を発揮します。確かに、dF/d.......

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Discussion

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上記実験のプロトコルは、測定、差別または筋肉に直接に発生した任意の機能変化間接的神経筋接合部のレベルでの理想的な方法を提供します。この手法は NMJ 機能の間接測定に基づいているので、かどうか瑕疵は形態学的変化または生化学的変化に関係を確立する使用できません。対照的に、任意の形態学的または生化学的変化が神経伝達シグナルの機能を減らしたかどうかを決定するの効果的な方法を用意します。しかし、力の測定が完了したら、筋肉お風呂から削除、消された、最適の長さで固定、埋め込み化合物に囲まれたできイソペンタンを溶解で急速凍結されました。筋肉は、免疫組織化学的、形態学的分析など-80 ° C 以降の評価のために格納できます。

我々 はここで提案する手法は、初めて NMJ と筋肉の機能を特徴づけるいくつかのパラメーターの測定を組み合わせた実験的テスト プロトコルに基づいています。3 つの重要なポイントは、この手法には、信頼性の高い結果が得られますを確認します。

まず、骨格筋切除は比較的一般的な手法では今、余分な注意が必要、神経を筋肉をそのままに.......

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Disclosures

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著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

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筆者らの研究室で仕事に支えられたスタンパーリアラヴェッロ ローマ、テレソン (付与なし。GGP14066)。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
デュアルモードレバーシステム オーロラ・サイエンティフィック社300Bアクチュエータ/トランスデューサ
ハイパワーバイフェーズスティミュレーター オーロラ・サイエンティフィック社701Bパルススティミュレータ(神経)
ハイパワーバイフェーズスティミュレータ オーロラ・サイエンティフィック社701Cパルス刺激装置(筋肉)
In vitro Muscle Apparatus オーロラ・サイエンティフィック社800A
準備ティッシュバスRadnoti158400
モノポーラ吸引電極AMシステム573000リファレンス 
オシロスコープ テクトロニクスTDS2014
実体顕微鏡ニコンSMZ 800
冷光照明 フォトニックオプティクスPL 3000
アクイジションボードナショナルインスツルメンツNI PCIe-6353
端子台ナショナルインスツルメンツNI 2110
パーソナルコンピュータAMD Phenom II x4 970プロセッサ 3.50 Ghz Windows 7
LabView 2012ソフトウェアナショナルインスツルメンツ
クレブスリンガー重炭酸塩バッファ シグマ・アルドリッチK4002 生理学的バッファー
重炭酸ナトリウムSigma-AldrichS5761 
塩化カルシウムCaCl2Sigma-AldrichC4901無水、粉末、≥97%
バッファーHEPESシグマ-アルドリッチH3375≥99.5% (滴定)
ディッシュ 60mm x 15mmファルコン353004ポリスチレン
シリコーンシルガード 184シリコーン エラストマーキット  0.5Kg。
サーモスタットDennerleDigitalDuomat 1200
ポンプNewa MiniMN 606水族館用
耐熱性 サーモケーブルラッキー 爬虫類61403-150/60Hz 50W
バケツ任意の 10 リットルポリプロピレン
O2 + 5%CO2siad混合ガス
#5 鉗子 ファインサイエンスツール11252-202アイテム
スプリングハサミ - 8 mm ブレードファイン サイエンス ツール15024-10神経切除
シャープハサミ ファインサイエンスツール 14059-11筋肉除去
はさみワグナー02.06.32動物の
学生のメスのハンドル#3ファインサイエンスツールの外側 91003-12 
メスブレード #10ファインサイエンスツール 10010-00
メスブレード #11ファインサイエンスツール 10011-00
ナイロンワイヤー&オスラッシュ;0.16 mm任意
ー 自家製繊細な

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8

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Neuromuscular Junction FunctionalityElectrical StimulationEx Vivo PreparationSoleus Sciatic NerveDiaphragm Phrenic NerveForce Frequency RelationshipNeurotransmission FailureIntratetanic FatigueTwitch Kinetics PropertiesSOD1 G93A Mouse

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