神経筋接合部 (NMJ) の機能評価は、筋肉と神経の間の通信に不可欠な情報を提供できます。ここで使用して 2 つの異なる筋神経剤、すなわちヒラメ坐骨とダイヤフラム隔 NMJ と筋肉の両方の機能を総合的に評価するためのプロトコルについて述べる。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
神経筋接合部 (NMJ) 機能は運動ニューロンと筋肉の間の通信障害、加齢、筋萎縮性側索硬化症 (ALS) などの病気を勉強して極めて重要な役割を果たしています。ここで述べる NMJ 機能を電気刺激の 2 つのタイプを組み合わせることで測定するために使用することができます実験的プロトコル: 筋膜刺激と神経を通して刺激を直接します。これらの 2 つの異なる刺激に対する筋反応の比較は、筋肉の機能低下につながる略記で潜在的な変化の機能レベルで定義する助けることができます。
Ex vivo準備はよく統制された研究に適しています。ここで筋肉と NMJ 機能ヒラメ坐骨神経の準備のため、ダイヤフラム横隔神経の準備のためのいくつかのパラメーターを測定するための集中的なプロトコルについて述べる。プロトコルは約 60 分を持続し、カスタムメイドによる間断なく行われている収縮動態特性、筋肉や神経の刺激の力周波数の関係と 2 つパラメーター NMJ 機能に固有すなわち神経伝達障害と intratetanic の疲労を測定するソフトウェア。この方法論は、SOD1G93Aトランスジェニック マウス、普遍的突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) を染色 ALS の実験モデルを用いたヒラメ筋と横隔膜筋の準備で損害を検出する使用されました。
概要
神経筋接合部 (NMJ) は、筋線維の運動終板と運動ニューロンの軸索の端末間の接続によって形成される化学シナプスです。略記は、筋肉と神経との間の通信が高齢化や筋萎縮性側索硬化症 (ALS) が発生すると、障害に重要な役割を再生する示されています。筋肉や神経は、双方向の方法1,2通信、筋肉奇形とは切り離して NMJ 欠陥を測定することができるという、physiopathological の相互作用に新たな洞察があります。確かに、この機能の評価は、形態や生化学的変化を減らす神経伝達機能を伝達するかどうかを評価するために役立つことがあります。
神経刺激と同じ筋に、膜の直接刺激によって誘発される応答による筋収縮反応の比較は NMJ 機能の間接測定として提案されています。確かに、膜刺激パスによって神経伝達シグナル、以来 2 つの収縮応答の違いと思われる略記で変更します。このアプローチをラット3,4,5,6、7、広く提案されており、またマウス モデル....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
すべての動物実験は、ローマ・サピエンツァ大学の組織学・医学胚胎学部門の倫理委員会によって承認され、動物保護に関するイタリア法の最新版に従って実施されました。
1. 実験セットアップ
- 1台のアクチュエータ/トランスデューサ、2台の刺激装置、1台のin-vitro筋肉測定装置、1台の組織浴槽、1本の吸引電極、1台のデジタルオシロスコープ、1台の実体顕微鏡、1台の冷光照明装置、1枚のデータ収集ボード、1個のコネクタブロック、および1台のパーソナルコンピュータで構成される実験システムを構築する。
注：ここでは、高い柔軟性、精度、および刺激の再現性を保証するように、LabViewで制御ソフトウェアをプログラムした。各刺激について、ユーザーはパルス幅、周波数、持続時間を選択し、膜に直接刺激するか、または神経経由で刺激するかを決定できる。また、各刺激前の休止期間の長さも選択可能である。
2. ヒラメ筋および横隔膜におけるNMJ収縮特性の評価
- システムのウォームアップ
- Krebs Ringer緩衝液14を調製し、固定装置のバスおよび組織調製用バスに入れる。4 mlのシリコンを入れた60 mmディッシュを組織調製用バスに配置する。 ....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
我々 が説明されたプロトコルでは、いくつかの神経筋疾患や老化サルコペニア機能神経について説明します。かどうか (その場合は、どのレベルで) は、このプロトコルを使用することができます筋肉の変化がそれ自体筋肉または神経筋伝達で発生する選択の変更によるものです。下図のデータは、我々 グループの18、20疾患の末期で筋萎縮性側索硬化症の SOD1G93Aトランスジェニック マウス モデルの実施による前の仕事の結果です。G93A SOD1 のトランスジェニック マウスでは、突然変異体の抗酸化酵素スーパーオキシドジスムターゼ 1 (SOD1) 普遍的染色します。図 3 と 4 は、dF/dt とヒラメ坐骨神経 (左) およびダイヤフラム横隔神経 (右) 準備テタヌス力値を示します。これらの結果は、厳密に筋肉自体に関連するものではなく NMJ に関連している遺伝子の筋肉の機能的な欠陥を検出するここで提案する手法の能力を発揮します。確かに、dF/d.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
上記実験のプロトコルは、測定、差別または筋肉に直接に発生した任意の機能変化間接的神経筋接合部のレベルでの理想的な方法を提供します。この手法は NMJ 機能の間接測定に基づいているので、かどうか瑕疵は形態学的変化または生化学的変化に関係を確立する使用できません。対照的に、任意の形態学的または生化学的変化が神経伝達シグナルの機能を減らしたかどうかを決定するの効果的な方法を用意します。しかし、力の測定が完了したら、筋肉お風呂から削除、消された、最適の長さで固定、埋め込み化合物に囲まれたできイソペンタンを溶解で急速凍結されました。筋肉は、免疫組織化学的、形態学的分析など-80 ° C 以降の評価のために格納できます。
我々 はここで提案する手法は、初めて NMJ と筋肉の機能を特徴づけるいくつかのパラメーターの測定を組み合わせた実験的テスト プロトコルに基づいています。3 つの重要なポイントは、この手法には、信頼性の高い結果が得られますを確認します。
まず、骨格筋切除は比較的一般的な手法では今、余分な注意が必要、神経を筋肉をそのままに.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
筆者らの研究室で仕事に支えられたスタンパーリアラヴェッロ ローマ、テレソン (付与なし。GGP14066)。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| デュアルモードレバーシステム | オーロラ・サイエンティフィック社 | 300B | アクチュエータ/トランスデューサ |
| ハイパワーバイフェーズスティミュレーター | オーロラ・サイエンティフィック社 | 701B | パルススティミュレータ(神経) |
| ハイパワーバイフェーズスティミュレータ | オーロラ・サイエンティフィック社 | 701C | パルス刺激装置(筋肉) |
| In vitro Muscle Apparatus | オーロラ・サイエンティフィック社 | 800A | |
| 準備ティッシュバス | Radnoti | 158400 | |
| モノポーラ吸引電極 | AMシステム | 573000 | リファレンス |
| オシロスコープ | テクトロニクス | TDS2014 | |
| 実体顕微鏡 | ニコン | SMZ 800 | |
| 冷光照明 | フォトニックオプティクス | PL 3000 | |
| アクイジションボード | ナショナルインスツルメンツ | NI PCIe-6353 | |
| 端子台 | ナショナルインスツルメンツ | NI 2110 | |
| パーソナルコンピュータ | AMD Phenom II x4 970 | プロセッサ 3.50 Ghz Windows 7 | |
| LabView 2012ソフトウェア | ナショナルインスツルメンツ | ||
| クレブスリンガー重炭酸塩バッファ | シグマ・アルドリッチ | K4002 | 生理学的バッファー |
| 重炭酸ナトリウム | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| 塩化カルシウムCaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | 無水、粉末、≥97% |
| バッファーHEPES | シグマ-アルドリッチ | H3375 | ≥99.5% (滴定) |
| ディッシュ 60mm x 15mm | ファルコン | 353004 | ポリスチレン |
| シリコーン | シルガード | 184シリコーン | エラストマーキット 0.5Kg。 |
| サーモスタット | Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| ポンプ | Newa Mini | MN 606 | 水族館用 |
| 耐熱性 サーモケーブル | ラッキー 爬虫類 | 61403-1 | 50/60Hz 50W |
| バケツ | 任意の 10 リットル | ポリプロピレン | |
| O2 + 5%CO2 | siad | 混合ガス | |
| #5 鉗子 | ファインサイエンスツール | 11252-20 | 2アイテム |
| スプリングハサミ - 8 mm ブレード | ファイン サイエンス ツール | 15024-10 | 神経切除 |
| シャープハサミ | ファインサイエンスツール | 14059-11 | 筋肉除去 |
| はさみ | ワグ | ナー02.06.32 | 動物の |
| 学生のメスのハンドル#3 | ファインサイエンスツールの外側 | 91003-12 | |
| メスブレード #10 | ファインサイエンスツール | 10010-00 | |
| メスブレード #11 | ファインサイエンスツール | 10011-00 | |
| ナイロンワイヤー&オスラッシュ;0.16 mm | 任意 |
参考文献
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
