このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価

7.7K 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/55240

⸱

2017年1月18日

 ,  , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

この記事について

サマリー

最近の発見は、細菌のべん毛モーターがさまざまな環境信号を感知し、それに応じて改造することを示唆しています。ここで議論されているビーズアッセイは、環境ストレス要因に対する細胞適応におけるリモデリングの役割を説明するのに役立つと期待されています。

要約

細菌の運動性と走化性におけるべん毛モーターの役割はよく理解されています。最近の発見は、べん毛モーターがさまざまな環境刺激に応答して改造することができ、表面のコロニー形成と感染の引き金の1つであることを示唆しています。モーターが細胞の適応を再構築し、促進する正確なメカニズムは、主要なモーター属性に依存する可能性があります。ここで紹介する光電子増倍管ベースのビーズトラッキング技術は、運動速度やスイッチダイナミクスの適応など、運動機能の正確な生物物理学的特性評価を可能にします。このアプローチには、リアルタイムの追跡と、長期間にわたるモーターの挙動を調査する機能という利点があります。ここで説明したプロトコルは、さまざまな細菌種のべん毛モーターの研究に容易に拡張できます。

概要

べん毛モーターは、らせん状の細胞外フィラメントを回転させることで泳ぐために細胞を可能にします。モーターは、鞭毛（ すなわち 、粘性負荷）の所定の長さのために生成することができるトルクの量は、遊泳速度を決定します。一方、回転方向を切り替える能力は、化学物質、走化性として知られるプロセスに応じて細胞移動を制御します。走化性及び運動性ある毒性が1-3因子 、鞭毛モーターは年4上で十分に特徴づけされています。証拠は今、モータがメカノとして作用することを示唆している-それは機械的に固体基板5,6の存在を検出します。この能力は、おそらく表面のコロニー形成および感染症5,7を誘発するのに役立ちます。その結果、モータが表面を検知し、シグナル伝達を開始させるメカニズムが有意8,9です。

べん毛モーターは容易にflagellを係留することによって研究することができますumの基板へとセルの回転を観察します。このようなテザリングは、最初の10の抗フック抗体を用いてガラス基板に大腸菌 、正常に取り付けられたフックにpolyhook変異体で働いていたシルバーとサイモン、によって達成されました。係留細胞アッセイは、化学的刺激の様々なモーター・スイッチの応答を研究する研究者を可能にしました。例えば、セガルおよび共同研究者は、化学的イオン導入ピペットを用いてテザー細胞を刺激しました。 CW バイアスの対応する変化（モータは、CWを時計回りに回す時間の割合）は、走化性ネットワーク11,12に適応の動態を測定するためにそれらを可能にしました。係留細胞アッセイは、スイッチの応答を研究する上で有効であったが、唯一の粘性負荷13の限られた範囲にわたって運動力学への洞察を提供することができました。この問題を克服するために、リュおよび共同研究者は、表面に付着した細胞上のフィラメントスタブに球状、ラテックスビーズを係留しました。ビーズがありましたその後、弱い光トラップ14で逆焦点干渉計を使用して追跡。異なるサイズのビーズと協力して、研究者は、負荷のより広い範囲に渡ってモーターを学ぶことができます。このアッセイは、後にレーザー暗視野照明と組み合わせた光電子増倍管ベースのビーズ追跡技術を開発した元とベルク、改善されました。彼らの方法は、外部の粘性抵抗が回転15,16の内部の粘性抵抗に比べて低かったこと（〜60 nm）のように小さなました係留金ナノビーズの追跡を可能にしました。これは、 大腸菌 （〜300ヘルツ）で達成可能な最大速度の測定値につながりました。 V.のalginolyticusでは、同様のビーズアッセイは、中間粘性負荷（〜700 Hz）で17で回転速度の測定を可能にしました。 （無負荷から近いストールに）粘性負荷の全体の可能な範囲での運動反応の測定を可能にすることにより、ビーズアッセイは、トンを理解するための重要な生物物理学的なツールを提供しました可トルク世代のプロセス18,19。

最近、我々は個々のモータ6に精密な機械的刺激を適用することができた光ピンセットを含むように元-Bergのアッセイを修正しました。それらは粘性負荷の変化に応じて改造 - この手法を用いて、モータの回転力発生器が動的mechanosensorsであることを示しました。メカニズムは不明のままであるが、このような負荷感知群がっ細菌への細胞の分化をトリガすることが可能です。直接的な証拠が不足しているものの、他の種におけるべん毛モーターは、また20機械受容していることもありそうです。ここでは、鞭毛フィラメント15につながラテックスビーズの回転を追跡するための光電子増倍管ベース（PMT）のアプローチを議論します。リアルタイムでかつ長期硬膜の上に単一のビーズを追跡することは比較的簡単であるため、超高速カメラで追跡と比較して、光電子増倍管、セットアップが有利です。ション。環境刺激21にべん毛モーター複合体で長時間の再構築を検討する場合に特に便利です。具体的には、大腸菌のための我々詳細プロトコルが、それらは、容易に他の種における鞭毛モーターを研究するために適合させることができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

1.細胞の調製

  1. 10mLの新鮮なTBで1：100希釈で接種続いトリプトンブロス（TB、1％ペプトン、0.5％のNaCl）にアレル15,22スティッキーFLICを運ぶ目的の株の一晩培養を成長させます。 OD 600 = 0.5になるまで振とうインキュベーター内で33℃で培養物を成長させます。
  2. 1,500×gで細胞をペレット5から7分と再分散ペレット積極的に濾過滅菌運動性バッファー10mL中（メガバイトを、10 mMリン酸バッファー：0.05から0.06 MのNaCl、10 -4 M EDTA、1μMメチオニン、 pHは7.0）。
  3. 繰り返しステップ1.2をさらに2回と1 mLのMBで最終ペレットを再分散させます。
  4. （ - 長さ12cm、0.58ミリメートル、内径7）ポリエチレン管で接続された21〜23ゲージアダプタで2つのシリンジの間で前後〜75回通過させることにより、懸濁液を剪断。 45秒 - 30にせん断の合計時間を制限します。
  5. 5-7分間1500×gで剪断した細胞を遠心分離し、再分散MBの500μL - 100でペレット。

2.スライドの準備

  1. カバースリップと顕微鏡スライドとの間に2つの両面テープを挟んで撮像チャンバーを準備します。走化性アッセイのために、MBおよび化学的刺激剤の交換を可能にする任意のマイクロ流体チャンバーを採用。
  2. チャンバー内に0.01％ポリ-L-リジンのソリューションを追加し、5分後に静かにMBで表面を洗い流し（80から100μL）。
  3. チャンバー内に細胞懸濁液40μLを追加し、ガラス面への取り付けのための十分な時間を許可（7から8分）。反対側から濾紙で溶液をウィッキングながら、チャンバの一方の側に100μLMBを追加することによって、剥がれた細胞を流出します。
  4. チャンバー内にラテックスビーズの15μL、ビーズに落ち着くと細胞に付着するのに十分な時間を許可 - 10を追加します（7から8分）。静かにバラバラビーズを除去するために、ステップ2.3で説明したように、MBの100μLですすいでください。ビーズ-SIの範囲を使用します良好なコントラストが利用可能である限り、実験のためのZES。

3.ビーズの追跡

  1. 顕微鏡ステージ上にサンプルを置き、モータに取り付けられたビーズのための表面をスキャンします。位相差顕微鏡が必要ではないが観測を行うために40X位相目標を使用します。また、あまりにも長い間、十分なコントラストがはっきりと暗い背景に明るいビーズを区別するために維持されているように明視野イメージングを採用しています。
  2. ビーズが選択されると、 図1Bに示すように、予め定められた隅にビードを配置するために横方向にステージを移動させます。同コーナーで位置ビーズは、ビーズの回転方向が正しく知られていることを確認します。理想的なビーズの軌道はほぼ円形であるが、楕円形の軌道が許容されています。
  3. エイリアシングに関連するエラーを回避するために、モータの二倍回転周波数よりも高いサンプリング周波数を維持します。本研究では、で回転されたモーターを使用10倍（500 Hz）であった周波数で50Hzのサンプルは、滑らかな信号を得ることができます。

4.データ解析

  1. 23を必要に応じて、センターでは、アフィン変換と軌道におけるPMTの出力電圧と、正しい楕円率をスケールと。回転速度17を決定するために、パワースペクトル解析を使用してください。
  2. 極角、θ（トン）= ATAN（Y（t）を/ x（t）を）決定します。モータ速度の変化を決定し、ωを算出することにより、時間を切り替えますfigure-protocol-1 14。
  3. モータ速度データを平滑化するためにメディアンフィルタを用います。 2回転以上のフィルタウィンドウは23,24を推奨します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

光電子増倍管のセットアップは図1Aに示されています。光電子増倍管は、関心のビーズによって散乱波長範囲にわたって高い感度を有することが重要です。ここで用いられる光電子増倍管は、可視及び近赤外範囲で動作し、ハロゲン光源によって照明ビードによって散乱された光を検出することができました。最適な照明条件や電源電圧が1セットアップから別のものに変化します。この作業で使用されたセットアップのために、PMTゲイン〜4月10日から5月10日までで十分証明しました。各光電子増倍管は、光電子増倍管の前に配置3×1ミリメートルスリットを除いて覆った。スリットは、光が光電子増倍管に入ることができ、そこから細胞サンプル領域を制限し、2つのスリットは、互いに直交しています。回転ビードが正しい位置（ 図1B）に位置するとき、光電子増倍増加に入射する光の量は、ビーズが来るようにビューでその円形経路は、ビューからそれを奪うように減少します。正弦PMT電圧出力の周波数は、回転速...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

係留ビーズの追跡とモータトルクの正確な推定を容易にするために、以下の情報を見直すべきです。鞭毛細胞でこれらの測定を行う場合、剪断は重要なステップです。シャーリングにより、モータ上の粘性負荷が主にビーズによるものであり、10％の誤差16内に推定することができることを確認して、単なるスタブにべん毛フィラメントを低減します。シャーリングもしっかりと分散型偏心（<ビーズ直径14）の円形軌道を見つける可能性を向上させます。不適切なせん断追跡で、粘性の薬物の計算に誤りを化合物わがままな軌道での結果、ならびに劣悪な信号対雑音比が得られます。オシロスコープの使用は、このようなデータの迅速な排除を可能にします。鞭毛フィラメントの生体力学的特性は、種に応じて変化することが予想されるので、剪断法は、おそらくTに十分な剪断を確実にするために適合させる必要があります彼目的の細菌。剪断に関連するエラーを減少させる効果的な方法は、フィラメントのタンパク質をコードする遺伝子を欠く細胞で機能することです。プローブビーズを、次いで、抗フック抗体を介してフックに直接取り付けることができます。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

著者は、ビーズ追跡顕微鏡/光電子増倍管の寄付に対してハワードバーグを、資金としてテキサスA&M工学実験ステーションに感謝します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ポリ-L-リジン溶液 (0.1%)Sigma-AldrichP8920http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7307 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
1 mLルアースリップチップシリンジExel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic ルアー スタブ アダプター 23 ゲージベクトン、ディキンソン アンド カンパニー427565
http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp ポリエチレン チューブハーバード デバイス59-8325http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
光電子増倍管チューブ浜松R7400U-20スペクトル応答範囲 300 - 920 nm、ピーク波長 630 nm、  0.78 ns 応答時間 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm 精密スリットエドモンド・オプティクスNT39-908光電子増倍管上に互いに直角に取り付けられた 2 つのスリット
オシロスコープテクトロニクスTBS 1032B代替ブランドも可。デジタル・オシロスコープ、TBS 1000Bシリーズ、2アナログ、30MHz、500MSPS、2.5kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 極 LP/HP フィルターKrohn-Hite3384代替ブランドは許容されます。0.1 Hzから200 kHzの周波数範囲を推奨します。   
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
オプティフォト顕微鏡ニコンNA直立相顕微鏡、逆位相顕微鏡なら何でも使用可能
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) キューブ ビームスプリッターThorLabsBS013

参考文献

  1. Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
  2. Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
  3. Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
  4. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
  5. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  6. Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
  7. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  8. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  9. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
  10. Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
  11. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  12. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
  13. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  14. Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
  15. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  16. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
  17. Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
  18. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  19. Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
  20. Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
  21. Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
  22. Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
  23. Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
  24. Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
  25. Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
  26. Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。