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DOI:

10.3791/55263

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2017年1月26日

 , 
1Biology Department, Hendrix College

この記事について

サマリー

Saccharomyces cerevisiaeの内因性位置でヒストン遺伝子の突然変異を生成するための戦略が提示されます。

要約

私たちは、出芽酵母細胞のヒストン遺伝子に標的変異を生成するためのPCRおよび相同組換えベースのシステムについて説明します。結果として生じる変異対立遺伝子は、その内因性ゲノム部位に存在し、処置後、ゲノムに外因性DNA配列は残されません。一倍体酵母細胞では、4つのコアヒストンタンパク質のそれぞれが、高度に相同なオープンリーディングフレーム(ORF)を持つ2つの非対立遺伝子によってコードされているため、特定のヒストンタンパク質をコードする2つの遺伝子のうちの1つを特異的に標的とする突然変異誘発が問題となる可能性があります。ここで説明する戦略は、相同組換えステップのために標的遺伝子のORFの内部ではなく外部の配列を利用することにより、この問題を回避します。このシステムのもう一つの特徴は、相同組換えステップを駆動するDNAの領域を非常に広範囲にすることができ、したがって、統合イベントが成功する可能性を高めることができることです。これらの特徴により、この戦略はヒストン遺伝子の突然変異誘発に特に適していますが、酵母ゲノムの他の遺伝子の突然変異誘発にも適応できます。

概要

4つのコアヒストンタンパク質H2A、H2B、H3、およびH4は、真核生物の染色体の締固め、組織、および機能において中心的な役割を果たしています。これらのヒストンのそれぞれの二組は、最終的にヌクレオソーム1の形成をもたらす、ヒストン八量体、自身の周囲のDNAの〜147塩基対の折り返しを指示する分子スプールを形成します。ヌクレオソームは、そのような遺伝子転写の調節および染色体全体のユークロマチンとヘテロクロマチンの形成と染色体ベースのプロセスの様々な積極的な参加者であり、そのように、過去数十年にわたって集中的な研究の焦点となっています。これらの機構は、ヒストン残基、ATP依存的ヌクレオソームのリモデリング、およびATP非依存性ヌクレオソーム再編成の翻訳後修飾を含む - の機構の数がヌクレオソームは、特定のプロセスの実行を容易にすることができる方法で操作することができるによって記載されています及び組立/分解2,3。

出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエは、真核生物におけるヒストンの機能を理解するために、特に強力なモデル生物です。これは主に遺伝的および生化学的実験の様々なドメイン真核生物および酵母の従順を通して、ヒストンタンパク質の進化的保存の高度に帰することができる4に近づきます。酵母における逆遺伝的アプローチは広くクロマチン生物学のさまざまな側面に関する特定のヒストン変異の影響を研究するために使用されてきました。実験のこれらのタイプのためには、自律的なプラスミドからの発現は、ヒストンタンパク質の異常な細胞内レベルにつながることができますように（これは細胞内でのプラスミドの様々な数に）、変異型ヒストンが母国のゲノム遺伝子座から発現される細胞を使用することが好ましいことが多いとクロマチンアンの同時変更最終的には結果の解釈を混乱することができvironments、。

ここでは、ゲノム中の残りの外因性DNA配列せずに所望の変異（複数可）の生成にクローニングステップと結果を必要としないそれらの天然ゲノム位置でのヒストン遺伝子の標的突然変異誘発を可能にするPCRベースの技術が記載されています。この技術は、酵母内で効率的な相同組換え系を利用し、他のグループによって開発された他の同様の技術と共通のいくつかの機能があります-最も顕著Delitto PERFETTO、サイト固有のゲノム（SSG）突然変異誘発、およびクローニングのないPCRに基づく対立遺伝子を代替法5、6、7。しかし、私たちが説明する手法は、特にヒストン遺伝子の突然変異誘発のために非常に適しせる側面を持っています。半数体酵母細胞では、4つのコアヒストンの各々は、二つの非Aによりコードされますllelicと相同性の高い遺伝子は、たとえば、ヒストンH3はHHT1とHHT2遺伝子によってコードされ、そして2つの遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）は、シーケンス内の90％以上同一です。相同性のこの高度に特異的突然変異誘発のための2つのヒストンをコードする遺伝子のいずれかを標的とするように設計された実験を複雑にすることができます。上述の方法は、多くの場合、相同組換えを駆動するために、標的遺伝子のORF内の少なくともいくつかの配列の使用を必要とするのに対し、ここで説明する技術は、のために（非常に少ない配列相同性を共有する）ヒストン遺伝子のORFに隣接する配列を利用します組換え工程は、所望の遺伝子座に突然変異誘発の成功した標的化の可能性を高めます。また、再結合を駆動相同領域は、さらに効率的な標的相同組換えに貢献し、非常に広範であることができます。

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プロトコル

注： その場ヒストン遺伝子の突然変異誘発において標的とするための実験戦略は、（ 図1にまとめた）いくつかのステップを含んでいます。これらの手順は、（1）URA3遺伝子と標的ヒストン遺伝子の置換を、所望の変異を保有するプライマーを用いて標的ヒストン遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントに対応するPCR産物（2）の生成、精製、（3 ）融合統合のためにフルサイズのPCR産物を得るための2つの部分的に重複する断片のPCR、フルサイズのPCR産物と骨格プラスミドの（4）同時形質転換し、プラスミド上のマーカーの選択、（5）画面5-FOA耐性形質転換体、（6）5-FOA耐性コロニーの精製および骨格プラスミドの損失、および（7）分子は、突然変異対立遺伝子を適切に統合するためのアッセイに分析しています。

figure-protocol-1
図1：出芽酵母におけるヒストン遺伝子のその場突然変異誘発にターゲットを絞った戦略の概要。この例では、標的遺伝子はHHT2であるが、他のコアのヒストン遺伝子はまた、この方法を使用して突然変異誘発することができます。図に示すように、（A）半数体酵母細胞が配置された二つのヒストンH3をコードする遺伝子（HHT1とHHT2）と2つのヒストンH4をコードする遺伝子（HHF1とHHF2）を保有する（HHT1とHHF1遺伝子は染色体IIとHHT2上に配置されていますそしてHHF2遺伝子は染色体XIVに配置されている-それぞれの場合において、矢印は転写の方向を指します）。手順の最初のステップでは、HHT2遺伝子のORFはhht2Δ:: URA3株を生じさせる、URA3遺伝子と置換されています。 （B）第1部では、ゲノムDNA試料からHHT2遺伝子の野生型コピー属には、2つのPCR反応のテンプレートとして使用され遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントをTE。最初の反応のためのリバースプライマーは、ゲノム中に導入される所望の突然変異（単数または複数）に対応する（赤い円で示される）は、1つ以上のミスマッチのヌクレオチドを含みます。第二の反応のためのフォワードプライマーは（も赤い丸で示す）の逆相補的な構成で同等の不一致があります。フルサイズのPCRの世代にこの結果パート2に示した2つのPCR部1で生成された製品（製品AおよびB）、その後の方法で二つのプライマーアニーリングの製品にAとBを使用して、融合PCRのテンプレートとして使用されています製品（パート3の生成物c）所望の変異（複数可）を保有します。 （C）hht2Δは:: URA3株は、その後で同時形質転換欠く培地上で（フルサイズのPCR産物及び骨格プラスミド（HIS3-この例でプラスミドを表示）で、細胞がプラスミドの存在のために選択されます時間この例ではistidine）。形質転換体を5-FOA抵抗性に関してスクリーニングする-耐性細胞は、図示のように、URA3遺伝子のPCR産物および切除の統合をもたらす相同組換え事象を受けた候補です。有糸分裂細胞分裂によって骨格プラスミドのその後の損失は、最終的な所望のヒストン変異株をもたらします。我々は、骨格プラスミドの選択は、主に自発的なURA3変異を獲得した細胞を識別し、5-FOAプレート上で直接選択、と比較して、正しい組込み事象の識別のはるかに高い周波数では5-FOA抵抗性の結果を得るためのスクリーニングに続いていることを発見しました。 （この図は、基準14から変更されています）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

URA3とターゲットヒストン遺伝子の1交換遺伝子

  1. URA3遺伝子8、9でターゲットヒストン遺伝子のORFを交換する標準的なPCR媒介ワンステップの遺伝子破壊を実行します。
    注：この変異は、このようにURA3遺伝子座8にPCR産物の統合を回避し、全体の内在性URA3 ORFを除去するようura3Δ0を有する酵母細胞の使用が推奨されます。それはS.セレビシエ中で機能的であるが、S。cerevisiaeのURA3遺伝子を有するのみ部分的な配列相同性を有するあるいは、K.ラクティスURA3遺伝子は、任意のURA3バックグラウンドでヒストン置換を生成するために有効に利用することができます。株はまた、（本プロトコールのステップ4を参照）形質転換実験における骨格プラスミドの選択を可能にする少なくとも一つの化合物に対して栄養要求性であるべきです。 ターゲットヒストンgeneΔ:: URA3場合は、この手順は必要ありません株はすでに利用可能です。

2.生成および所望の変異を保有するプライマーを用いて、ターゲットヒストン遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントに対応するPCR産物の精製（複数可）

  1. 標的ヒストン遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントに対応するPCR産物を生成します。
    1. 次のように2つのPCR反応を準備します。
      1. 1μlの鋳型DNA、5μl10μMフォワードプライマー、5μl10μMリバースプライマー、0.5μlの（1.25 U）熱安定性：以下の反応を設定する遺伝子（ 図1Bの製品A）の最初の半分に相当するPCR産物を生成するにはDNAポリメラーゼ、10μlの5×ポリメラーゼバッファー、5μlののdNTP混合物（各2mM）、および23.5μlののdH 2 O.
        注：鋳型DNAは、標準的なプロを使用して単離し、標的ヒストン遺伝子のための株を野生型由来のゲノムDNAをすることができます10を cedures。 DNA濃度と異なるゲノム製剤中の不純物のレベルの変動を説明するために、それが希釈されていないDNAまたはゲノムの製剤の異なる希釈のいずれかを使用して反応を最適化することが推奨される（ 例えば、1時10分および1：100）。フォワードプライマーは、標的遺伝子の上流領域にアニールすべきです。逆方向プライマーは、ORF内のアニーリング長さが〜40ヌクレオチドであり、かつ（例については、 図1B-1および代表的な結果のセクションを参照してください）どこかの途中で所望の変異（複数可）を含める必要があります。高忠実度DNAポリメラーゼの使用は、PCR産物の合成中に望ましくない変異の割合を低減するために推奨されます。
      2. 2.1.1.1であるが、異なるプライマーを用いて示されているように遺伝子（ 図1Bにおける製品B）の第二の半分に相当するPCR産物を生成するには、反応を設定します。
        注：前方のpriマーは、ORF内でアニールする必要があります〜40ヌクレオチド長であること、そしてどこかの真ん中に所望の変異（複数可）を含有します。このプライマー中の変異（複数可）は、ステップ2.1.1.1で逆方向プライマー中の変異（複数可）の逆相補であることに注意してください。リバースプライマーは、標的遺伝子の下流領域にアニールする必要があります（例については、 図1B-1および代表的な結果のセクションを参照してください）。
    2. 次の設定でサーモサイクラーで反応を置き：94℃で30秒;次の設定の30サイクル：98℃で10秒、60℃5秒、72℃1.5分。そして72℃で10分。
      注：PCRパラメータの最適化は、特定のプライマーセットのために必要とヒストン遺伝子を標的とすることができます。
  2. 89 mMのトリス塩基、89mMのホウ酸、2.5 mMのEDTA（TBE）緩衝液中の0.9％低融点アガロースゲル上でPCR反応から材料50μlの - 20を実行します。
  3. PCR PRを含む切断アガロースゲル切片きれいなメスまたはカミソリ刃を用いてゲルからoductsを1.5 mlマイクロチューブにそれぞれを移します。使用する準備ができるまで-20℃でのPCR産物を含むアガロースのセクションを保管してください。

統合のためのフルサイズPCR産物を得るために、2つの部分的に重複断片の3融合PCR

  1. PCR反応のためのテンプレートを準備
    1. 5分間65℃のヒートブロックセット内のマイクロチューブを配置することによって、ステップ2.3からのアガロースゲル切片を融解（または完全に溶融するまで）。ボルテックスチューブ毎に1 - 溶融工程を容易にするために、2分間。
    2. 各試料からアガロース溶融の設定量を転送し（ 例えば 、50μlの各、100μlの合計）は、単一のマイクロ遠心チューブに、ボルテックスにより混和します。融合PCR反応におけるテンプレートとしてこれを使用してください。使用する準備ができるまで-20℃でチューブを置きます。
  2. フルサイズのPCR産物を大量に増幅する（製品C）図1Bの
    1. 6 PCR反応を設定し、次のコンポーネントを持つ各：2μlの鋳型DNA、10μlの10μMのフォワードプライマー、10μlの10μMのリバースプライマー、1μlの（2.5 U）耐熱性DNAポリメラーゼ、20μlの5倍DNAポリメラーゼ緩衝液、10μlのdNTP混合物（各2mM）、および47μlののdH 2 O
      注：反応の数は、PCRの効率に応じて変更することができます。鋳型DNAは、（3.1.2を参照）溶融するまで、65℃に加熱し、ボルテックスにより混合し、PCR反応混合物に最後に添加されるべきです。一度に加え、この溶液をピペットで数回上下穏やかに、しかし完全に混合します。異なる試料中のDNA濃度の変動を考慮するために、それは最初に希釈されていないテンプレートまたはテンプレートの異なる希釈のいずれかを使用して反応を最適化することが推奨される（ 例えば、1：10〜1：100）。病気などの標的遺伝子の2つの部分的に重複するフラグメントにアニーリングべき使用二つのプライマー図1B-2にustratedと（例については、代表的な結果のセクションを参照）、最終的なPCR産物は、相同組換えのステップを駆動するURA3 ORFに隣接する領域に両側相同で少なくとも40塩基対を有するように設計されます。高忠実度DNAポリメラーゼの使用は、PCR産物の合成中に望ましくない変異の割合を低減するために推奨されます。
    2. 次の設定でサーモサイクラーにチューブを入れる：94℃で30秒;次の設定の30サイクル：98℃で10秒、50℃15秒、72℃1.5分。そして72℃で10分。
      注：PCRパラメータの最適化は、特定のプライマーセットと標的ヒストン遺伝子のために必要とされてもよいです。

プラスミド上のマーカー4.フルサイズのPCR製品とバックボーンプラスミドの同時形質転換、および選択

  1. PCR産物の濃度
    1. プールの単一のマイクロ遠心チューブにステップ3.2.2から九PCR反応（600μlの合計）とボルテックスで混和します。
    2. マイクロ遠心チューブ内の3200μlのアリコートにサンプルを分割します。 3Mの酢酸ナトリウム（pH5.2）20μlの100％エタノール550μLを添加することによって、各チューブにDNAを沈殿させます。溶液を十分に混合し、少なくとも15分間氷上に置きます。 10分間〜14,000×gで遠心分離することによってDNAを回収し、70％エタノール、および空気乾燥200μlでペレットをすすぎます。
    3. dH 2 O25μlの中に各DNAペレットを再懸濁し、（75μlの合計）は、単一のチューブにプールします。
  2. 酵母共形質転換
    1. 酵母エキスペプトンデキストロース（YPD）11媒液中のセクション1で生成された株の一晩培養物の10ミリリットルを準備します。
    2. 翌朝、飽和一晩培養物の8ミリリットルでYPD液体培地の400ミリリットルを接種し、振盪することによりインキュベート4のため30℃で - 5時間後、細胞が対数増殖期に入ることを可能にします。
    3. 、10分間〜3,220×gでの遠心分離によって細胞を収集し、液体培地を捨て、そして10mMのトリス-HCl（pH8.0）の1体積で細胞を再懸濁し、1mMのEDTA、0.1 M酢酸リチウム溶液（TE / LiAc形質） 。
    4. 10分間〜3220×gの遠心分離により細胞を収集し、TE / LiAc形質を捨てます。
    5. 1ミリリットルTE / LiAc形質で細胞を再懸濁します。
    6. ステップ4.2.5からの細胞の800μlを、ゆで10 mg / mlでサケ精子DNA、バックボーンプラスミドDNAの12.5μgの合計、そして濃縮PCR産物75μlの40μlの：マイクロ遠心チューブに以下の反応カクテルを設定しますステップ4.1.3から。
      注：サケ精子DNAを5分間煮沸し、反応に使用する前に少なくとも5分間氷上に置くべきです。追加された骨格プラスミドDNAの総容量は最小（〜80μlあるいはそれ以下）に維持されるべきです。バックボーンプラズマの例については、代表的な結果のセクションを参照してくださいID。
    7. 徹底的に一定分量に均等に8マイクロ遠心チューブ（ - 8チューブ1）にカクテルチューブを混ぜます。
    8. 以下の二つの制御変換反応チューブを設定します。
      1. チューブ9（なしPCR産物コントロール）：ステップ4.2.5からの細胞100μl、ゆで10 mg / mlでサケ精子DNA（5分間煮沸し、ステップ4.2.6を参照してください。注）を5μl、1.56μgの合計バックボーンプラスミドDNA及びPCR産物を添加しました。
      2. チューブ10（無DNAコントロール）：ステップ4.2.5からの細胞100μl、ゆでの10mg / mLのサケ精子DNAの5μLは（ステップ4.2.6を参照してください。注）、何の骨格プラスミドDNAを添加していない、と何のPCR産物を添加していません。
      3. 上下に数回ピペッティングすることにより穏やかに、しかし完全に両方の管を混ぜます。
    9. 30分間30℃にて10チューブをインキュベートします。
    10. 各チューブに、TE / LiAc形質40％ポリエチレングリコール1.2mlの（PEG 3350）を追加します。溶液が均一になるまで、P-1000ピペットを用いて完全に混合。
    11. 30時10チューブをインキュベート30分間°C。静かに上下にピペッティングにより溶液を混合した後、15分間42℃でチューブをインキュベートします。
    12. 30秒間〜14,000×gで微量にチューブを回転させることによって細胞を収集します。液体を捨て、無菌のdH 2 O 1mlに細胞を再懸濁
    13. 30秒間〜14,000×gで微量にチューブを回転させることによって細胞を収集します。液体を捨て、無菌のdH 2 O500μlの細胞を再懸濁
    14. プール管1から8まで一緒に（合計4ミリリットルの容量）とピペッティングにより完全に混和します。
    15. プレート骨格プラスミドの選択のための20の完全な最小限のドロップアウト培地プレート11（プレート1月20日）のそれぞれに上記混合物200μlの。
    16. 独自の選択プレート（それぞれのプレート21および22、）上のチューブ10からの混合物のチューブ9と200μlのそれぞれからの混合物のプレートを200μl。
    17. 5日 - 3のため30℃で22プレートをインキュベートプラスミド形質転換体を選択。
    18. インキュベーションの5日 - 3後に形質転換プレートを点検します。約5000個のコロニーをプレート1-21（例えば代表的な結果を参照）上に表示されなければならないとはコロニーは、プレート22上に存在してはなりません。

5-FOA耐性形質転換体5.画面

  1. プレートから細胞を移す1から20（および変換制御などのプレート21）5-フルオロオロ酸（5-FOA）プレート11にすることにより、レプリカメッキの統合の結果として、URA3遺伝子の損失をスクリーニングするために、12を所望の位置にPCR産物。
    1. プレートの蓋を外し、滅菌ベルベットのコロニーを含むプレートを押してください。ベルベットのプレートを押して、5-FOAプレートにベルベットから細胞を転送します。 2日間30℃で培養します。
  2. 2日間のインキュベーション後、慎重グラムのための5-FOAプレートを検査owth。
    注：候補統合イベントは小さな非対称で表される「押しつぶさ"コロニー5-FOAプレート上- 5-FOAプレート上で成長し、逆に、小さな乳頭は上のコロニーの成長中に発生した自発的なURA3変異の可能性が高い代表的なものです形質転換プレート、および（この点について、さらに精緻化のための代表的な結果セクションの図3を参照し、いくつかの例のための）所望の組み込み事象を表現する可能性は低いです。

6. 5-FOA耐性コロニーの精製および骨格プラスミドの損失

  1. 滅菌つまようじを使用して、YPDプレート上に単一コロニーのためのステップ5.2とストリークに記載さ5-FOAプレートから候補コロニーを選択します。 30℃で3日間 - 2インキュベートします。
  2. インキュベーション後、レプリカ-新鮮なYPDプレートにプレート各YPD浄化プレート、ドロップアウトプレートウラシルを欠く損失をチェックしますURA3遺伝子 、及び第二のドロップアウトプレートの骨格プラスミドの有無を監視します。 30℃で2日間1 - インキュベートします。
  3. インキュベーション後、YPDプレート上で成長している各候補サンプルからコロニーを同定するがいずれかのドロップアウトプレート上で成長していない（そのようなコロニーは、組換え事象を介してURA3遺伝子を失っていると期待し、有糸分裂の間に骨格プラスミドを失われます細胞分裂）。新鮮なYPDプレート上のようなコロニーを画線。これらのコロニーは、統合候補であると、ステップ7でさらに分析されます。

変異対立遺伝子を適切に統合するためのアッセイ7.分子解析

  1. 標準的な手順10を使用して候補サンプルからゲノムDNAを分離します。
  2. 標的部位を含むゲノム領域を増幅します。
    1. 0.5μlの鋳型DNA、5μlの各サンプルについて、以下のPCR反応を設定します10μMのフォワードプライマー、5μlの10μMリバースプライマー、0.5μlの（2.5単位）のTaq DNAポリメラーゼ、5μlの10×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液、5μlののdNTP混合物（各2mM）、および29μlののdH 2 O
      注：テンプレートDNAは、候補サンプル由来のゲノムDNAです。元ヒストンgeneΔ由来のゲノムDNA :: URA3のテンプレートとして歪みやテンプレートとして野生型ヒストン株から別の用いてゲノムDNAを用いて、1：それは、2つのコントロール反応を含めることが推奨されます。 DNA濃度と異なるゲノム製剤中の不純物のレベルの変動を説明するために、それが希釈されていないDNAまたはゲノムの製剤の異なる希釈のいずれかを使用して反応を最適化することが推奨される（ 例えば、1時10分および1：100）。確認することが重要であると推定される統合されたPCR産物に包含される領域の外側のDNA配列にこれらのプライマーのアニーリング-このように、これらのRでのPCR産物のサイズeactionsは、（例えば、 代表的な結果を参照）が正しいゲノム位置での製品の統合のための診断ツールとして使用することができます。
    2. 次の設定でサーモサイクラーで反応を置き：94℃3分;次の設定の30サイクル：94℃45秒、50℃45秒、72℃2分。 72℃で10分間。
      注：PCRパラメータの最適化は、特定のプライマーセットと標的ヒストン遺伝子のために必要とされてもよいです。
  3. PCR産物の処理
    1. 0.8％TBEアガロースゲル上の各反応から20μlのを実行します。
    2. URA3遺伝子がうまく推定変異したヒストン遺伝子により置換されているかどうかを判断するための基準としてDNA標準を使用して、PCR産物の大きさを評価する（例えば、代表的な結果を参照のこと）。
      注：特定の場合には、所望の突然変異（s）は、ヒストン遺伝子に導入されたいずれかの作成や座る制限を破壊します電子。この場合、正確な統合を示す大きさのPCR産物中の所望の変異の存在は、ゲル電気泳動分析に続いて、対応する制限酵素で消化した製品を供することによって評価することができる（例えば、代表的な結果を参照のこと） 。
    3. 所望の突然変異（単数または複数）の存在を確認し、追加の突然変異がゲノムに導入されていないことを確認するためにDNA配列決定に適切な統合を示す大きさの対象PCR産物。

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結果

私たちは、 その場での突然変異誘発戦略において標的の代表例として、グルタミン酸（H3-R53E変異体）にアルギニンから53位での置換を保有するヒストンH3変異体タンパク質を発現するhht2対立遺伝子の発生を記載しています。

私たちは、HHT2のORF全体がURA3遺伝子（プロトコールのステップ1を参照）に置換された菌株を生成しました。この株は、yAAD156は、また、細胞がヒスチジンに対して栄養要求性であることが原因とhis3Δ200対立遺伝子を、保有します。プロトコルのステップ2に示された手順に従い、我々はその後HHT2の2つの部分的に重複するフラグメントを生成しました。フォワードプライマー（OAD20）：5 'GCGTTCATTATCGCCCAATGTG 3'及びリバースプライマー（R53E...

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ディスカッション

一倍体S.セレビシエ細胞における4つのコアヒストンタンパク質のそれぞれのコードは、具体的突然変異誘発のための2つの遺伝子のいずれかをターゲットにする研究者のための挑戦を表すことができる2つの非対立遺伝子間の配列相同性の高レベル。以前は頻繁に依存し、Delitto PERFETTO、サイト固有のゲノム（SSG）突然変異誘発、およびクローニングのないPCRに基づく対立遺伝子交換方法5、6、7、ならびにより最近の酵母CRISPRベースの技術15を含む、酵母の突然変異誘発法を説明少なくとも部分的には、最終的に最終的な変異対立遺伝子を生成するために、所望のゲノム部位への組換えまたは修理機械を募集する標的遺伝子のORF内の配列に。一方、ここで提示した戦略はhomologoを駆動するための標的ORFに隣接するDNA配列を利用します私たちの組換え事象変異の統合に必要な、そして、その結果...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

この原稿の準備中に有益なコメントをいただいたReine Protacioに感謝します。全米科学財団(助成金番号1243680および1613754)とヘンドリックスカレッジオデッセイプログラムの資金援助に感謝の意を表します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1 kb DNA ラダー (DNA スタンダード)New England BioLabsN3232L
Agarose SigmaA5093-100G
ホウ酸SigmaB0394-500G
dNTP ミックス (各 10 mM)ThermoFisher ScientificR0192
EDTA 溶液 (0.5 M、pH 8.0)AmericanBioAB00502-01000
エタノール (200 プルーフ)Fisher Scientific16-100-824
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物 (EDTA)SigmaE4884-500G
酢酸リチウム二水和物SigmaL6883-250G
MyCycler Thermal CyclerBioRad170-9703
ポリ(エチレングリコール) (PEG)SigmaP3640-1KG
PrimeSTAR HS DNA Polymerase(high fidelity DNA polymerase)  and 5x bufferFisher Scientific50-443-960
サーモン精子DNA溶液サーモフィッシャーサイエンティフィック15632-011
グマ7-9(トリスベース、粉末状)シグマT1378-1KG
酢酸ナトリウム三水和物シグマ236500-500G
スープラふるいGPGアガロース(低計量温度アガロース)AmericanBioAB00985-00100
Taqポリメラーゼおよび10xバッファーニューイングランドバイオラボM0273X
つまようじフィッシャー サイエンティフィS67859
Tris-HCl (1 M、pH 8.0)AmericanBioAB14043-01000
A-D(+)-グルコースフィッシャー サイエンティフィック サイエンティフィック ダイエン
寒天フィッシャー サイエンティDF0140-01-0酵母 培
ペプトンフィッシャー サイエンティフィックDF0118-07-2YPD中用
エキスフィッシャーサイエンティフィックDF0127-17-9YPD中用
-アミノ安息香酸シグマA9878-100G完全な最小ドロップアウト培地 
アデニンシグマA8626-100Gは、完全な最小ドロップアウト媒体です 
塩酸グリシンSigmaG2879-100G、完全な最小ドロップアウト培地 
L-アラニンシグマA7627-100G完全最小ドロップアウト媒体 
L-アルギニン一塩酸塩シグマA5131-100G、完全な最小ドロップアウト媒体 
L-アスパラギン一水和物シグマA8381-100G、完全な最小ドロップアウト培地 
L-アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物SigmaA6683-100G、完全な最小ドロップアウト媒体 
L-システイン塩酸塩一水和物SigmaC7880-100G、完全最小ドロップアウト培地 
L-グルタミン酸塩酸塩SigmaG2128-100G、完全最小ドロップアウト培地 
L-グルタミンΣG3126-100G完全低ドロップアウト培地 
L-ヒスチジン一塩酸塩一水和物シグマH8125-100Gの完全な最小ドロップアウト培地 
L-イソロイシンSigmaI2752-100G完全最小ドロップアウト媒体用 
L-ロイシンSigmaL8000-100G完全最小ドロップアウト媒体 
L-リジン一塩酸塩SigmaL5626-100G、完全最小ドロップアウト培地用 
L-メチオニンシグマM9625-100G完全最小ドロップアウト培地用 
L-フェニルアラニンΣP2126-100G完全低ドロップアウト培地用 
L-プロリンSigmaP0380-100G完全最小ドロップアウト媒体用 
L-セリンSigmaS4500-100G完全最小ドロップアウト媒体用 
L-スレオニンシグマT8625-100G完全最小ドロップアウト培地用 
L-トリプトファンΣT0254-100G完全低ドロップアウト培地用 
L-チロシンシグマT3754-100G完全最小ドロップアウト媒体用 
L-バリンシグマV0500-100Gは完全な最小ドロップアウト媒体用 
myo-イノシトールSigmaI5125-100G(完全な最小ドロップアウト媒体用) 
ウラシルシグマU0750-100Gの完全な最小ドロップアウト媒体 
硫酸アンモニウムフィッシャーサイエンティフィックA702-500の完全な最小ドロップアウト培地 
酵母窒素ベースフィッシャーサイエンティフィックDF0919-07-3完全最小ドロップアウト培地用 
5-フルオロロチン酸(5-FOA)AmericanBioAB04067-00005for  5-FOAミディアム
シック ティフィック AC170080025 酵母培地用フィック 地用 酵母4

参考文献

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