細胞内染色およびフローサイトメトリーは、高血圧のモデルにおけるマウス大動脈、腎臓及びリンパ節内のリンパ球サブセットを識別するために、

サマリー

この記事では、識別し、細胞内染色によって、マウス腎臓、大動脈およびリンパ節内に存在する機能性Tリンパ球サブセットを定量化し、フローサイトメトリーするための詳細な方法論を提供します。アンジオテンシンII高血圧のモデルは、説明ステップバイステップ、手順、およびフローサイトメトリーの基本的原則及び細胞内染色に選ばれました。

要約

Tリンパ球がいくつかの心血管疾患の発症に重要な役割を果たすことは、現在よく知られています^1,2,3,4,5。例えば、私たちのグループの研究では、高血圧は実験的高血圧症の発症中に血管や腎臓にT細胞が過剰に蓄積することと関連していることが示されています⁶。これらの組織に入ると、T細胞は血管機能と腎機能の両方に影響を与えるいくつかのサイトカインを産生し、血管収縮とナトリウムと水分の貯留を引き起こします^1,2。T細胞が心血管疾患や腎疾患を引き起こす仕組みを完全に理解するためには、これらの組織に存在する特定のT細胞サブセットを同定し、定量化できることが重要です。T細胞サブセットは、表面マーカー、それらが分泌するサイトカイン、およびそれらが発現する転写因子の組み合わせによって定義されます。T細胞集団は複雑であるため、フローサイトメトリーと細胞内染色は、組織に存在するリンパ球の表現型を解剖するための非常に貴重な技術となっています。ここでは、アンジオテンシンII誘発性高血圧のモデルでマウスの腎臓、大動脈および大動脈ドレナージリンパ節から単離されたT細胞の表面および細胞内マーカー(サイトカインおよび転写因子)を同定するための詳細なプロトコルを提供します。以下のステップが詳細に説明されています:組織の単離、単一細胞懸濁液の生成、ex vivo刺激、固定、透過化および染色。さらに、適切なコントロールや適切なゲーティング戦略の選択など、フローサイトメトリー解析のいくつかの基本原則についても説明します。

概要

最近の証拠は、適応免疫系、特にTリンパ球は、いくつかの心血管疾患^1,2,3,4,5の発症に重要な役割を果たしていることを示しています。例えば、アンギオテンシンII誘発性高血圧モデルでは、マウスの血管および腎臓におけるT細胞の蓄積を⁶に記載されています。血管の蓄積は、外膜と血管周囲脂肪に主にあります。腎臓では、T細胞は、髄質及び腎皮質の両方に蓄積します。関与するサブセットに応じて、これらのT細胞は、血管および腎臓の機能に影響を及ぼし、病理の発達をもたらすことができる別のサイトカインを生じる（マクマスターら ⁶で概説）。

その機能と署名インサイトに基づいてTヘルパー1（Th1）、Th2を、TH9、Th17細胞、TH22、T調節（Treg細胞）細胞、およびT濾胞ヘルパー（TFH）細胞：CD4 ⁺ Tヘルパーリンパ球は、複数のサブセットに分割することができますkines ^7。同様に、CD8 ⁺細胞傷害性T細胞はTc1は、Tc2を、TC17またはTC9 ⁸のように分類することができます。ダブルネガティブT細胞（CD4またはCD8 T細胞マーカーを発現しない、すなわち細胞）もあります。これらの細胞のサブセットは、代替ガンマデルタT細胞受容体（の代わりに古典的なαおよびβ受容体）を有し、したがって、ガンマデルタT細胞と呼ばれます。表面マーカー、サイトカインおよび転写因子のフローサイトメトリーによるマルチパラメータ分析は、これらの細胞を同定するための最適なアプローチを構成しています。この方法は、広く免疫学の分野で使用されるが、それはあまり固形臓器および心血管疾患の設定に記載されています。

歴史的には、組織中のリンパ球の同定は、免疫組織化学またはRT-PCRの手法に限定されていました。免疫組織化学および免疫蛍光は、int型の抗原の組織分布を決定するための強力な方法であるが、erest、彼らは表現型関連するサブセットを特定するには不十分です。 RT-PCR分析は、抗原、サイトカインまたは転写因子のmRNA発現を検出するのに有用であるがまた、それは、個々の細胞のレベルで、同時に複数のタンパク質の検出を可能にしません。

サイトカインおよび転写因子を検出するために、細胞内染色と組み合わせて、特にフローサイトメトリーの出現は、固形臓器における免疫細胞サブセットの単一細胞レベルでの同定および定量を可能にする強力な技術を持つ研究者を提供します。私たちは、アンジオテンシンII高血圧のモデルにおけるマウスの腎臓、大動脈および大動脈流入領域リンパ節内に存在する主要なT細胞サブセットをフローサイトメトリーによって識別するための細胞内染色アッセイを最適化しました。各ステップの最適化：組織消化、ex vivoでの活性化、透過処理、および表面および細胞内染色結果、高度で再他の心血管および腎疾患モデルに適用することができる製造可能検定。

プロトコル

ヴァンダービルト大学の施設内動物管理使用委員会は、本明細書に記載される手順を承認しました。マウスは、飼育し、実験動物の管理と使用に関する指針に従って世話されている（国立アカデミープレス。改訂2010）。

マウスからの大動脈水切りリンパ節、腎臓および大動脈の1の単離

1. CO ₂吸入によりマウスを安楽死させます。 70％エタノールで胸をスプレーし、慎重に心臓を露出するためにハサミで皮膚や胸壁を開きます。
2. 血管系を灌流するには、右心房に小さな切開を行い、着実に21または23 G針を使用して、左心室の頂点に冷PBS（約1ミリリットル/秒）の少なくとも10ミリリットルを注入。すべての臓器は湯通しするまで灌流します。心臓が最初に白く。肝臓の白化は、灌流が十分に行われていることを示しています。
3. 小さな鉗子と細かいハサミを使用して、静かにカットし、腸を引き出し、胃、脾臓、膵臓および肝臓はより良い大動脈を可視化しました。
   注：この手順は、胃腸管の損傷、汚染を誘発することができるように非常に正確に行う必要があります。
4. 切り出し、ハサミで各肺を削除します。無針注射器を用いてリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて胸腔をすすぎます。滅菌ガーゼを使用して、余分な血液や体液を削除します。
5. 細かい解剖ピンセットを用いて腹部大動脈流入領域リンパ節を削除してください。カプセルを破裂させないことを確認してください。解剖鉗子で各リンパ節の表面上の残りの脂肪を取り除きます。細かいハサミを持つ2つの腎臓を切り取ります。
6. 罰金、湾曲したハサミで大動脈全体（胸部と腹部大動脈）を解剖。心のレベルで開始し、慎重に離れて食道および大動脈に取り付けられ、周囲の血管周囲脂肪を維持することを確認すること腸骨分岐のレベルまでの椎骨から解剖。
   注：REMOする大動脈のさらなる解剖周囲の構造は、顕微鏡下で行うことができまし。具体的には、動脈枝（頸動脈、鎖骨下動脈、腹腔動脈、腸間膜、および腎動脈）とリンパ節を削除します。これは多くの炎症細胞が高血圧の設定に存在するサイトであるため、各大動脈の周りの血管周囲脂肪の一貫性のある層を保つようにしてください。冷PBSを含む別々のチューブ内の各組織を置きます。

各組織からの単一細胞懸濁液の2世代

1. 腎臓
   注：腎臓は、機械的解離に加えて、酵素消化を組み合わせることにより、単一細胞懸濁液中に解離させることができます。
   1. （5％ウシ胎児血清（FBS）を補充した）RPMI1640培地へのコラゲナーゼD（2mg / ml）を添加し、DNアーゼI（100μg/ mlの）によって腎消化溶液を調製します。腎臓サンプルあたり10ミリリットルを準備します。
   2. 腎臓ダイジェストの10ミリリットルを含む解離チューブに2腎臓を転送するために鉗子を使用して、イオン溶液。
   3. 製造業者の指示に従って、半自動化された解離装置を用いた機械的解離を行います。
   4. 機械的解離後、デバイスからチューブを切り離し、酵素消化を行います。連続回転下37ºCで20分間サンプルをインキュベートします。すぐに、5％FBSを補充した冷たいRPMI 1640培地を加えることによって、酵素消化を停止します。
   5. 40μmのストレーナーを通して濾過した後、50ミリリットルコニカルチューブにピペッティングすることにより溶液を転送します。 1mlシリンジのプランジャーで押して離れて残りの組織をいじめます。細胞（500×gで、8分、4ºC）をペレット化。
   6. 36％の密度勾配遠心分離媒体を3mlの中にペレットを再懸濁します。 15ミリリットルコニカルチューブにサスペンションを転送します。静かに中断することなく、3ミリリットル36％の細胞懸濁液の下に72％密度勾配遠心分離培地の3ミリリットルを追加します。遠心分離（ブレーキなし千×gで、20分、4℃）。
   7. 免疫細胞は、界面に位置します。細胞破片を含む最上位の黄色がかった層を除去した後、冷PBSを使用して15ミリリットルにボリュームを起動します。内訳によく勾配を振ります。細胞（300×gで、8分、4℃）をスピンし、5％FBSを含むRPMI 3mlにペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。
2. 大動脈
   1. （5％FBSを補充した）RPMI1640培地へのコラゲナーゼA（1mg / mlの）、コラゲナーゼB（1 mg / mlで）、およびDNアーゼI（100μg/ ml）を添加することによって、大動脈消化溶液を調製します。
   2. 微細な鉗子を使用して、大動脈消化溶液1 mlを含む2mLの管に大動脈を移します。 1ミリリットル消化液中の微細なハサミで非常に小さな断片に全体の大動脈をみじん切りに。氷の上に保管してください。連続回転下、37℃で30分間、サンプルをインキュベートします。
   3. 組織培養皿にソリューションを移し、enzymaを停止5％FBSで5回コールドRPMIのボリュームを追加することによってチック消化。
   4. 40μmのストレーナーを通して濾過した後、50ミリリットルコニカルチューブにピペッティングすることにより溶液を転送します。 1mlシリンジのプランジャーで押すことにより、単一細胞懸濁液に離れて残りの組織をいじめます。ストレーナーをフラッシュし、細胞（300×gで、8分、4ºC）をペレット化。
   5. 5％FBSを含むRPMIの10ミリリットルを追加することにより、ペレットを洗浄。細胞（300×gで、8分、4℃）をスピンし、5％FBSを含むRPMI 3mlにペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。
3. 大動脈流入領域リンパ節
   1. 組織培養皿（60ミリメートル×15 mm）の中で40μmのストレーナーを配置します。ストレーナ上のリンパ節を配置し、1mlシリンジのプランジャーで押すことにより、単一細胞懸濁液中にそれらを離れていじめます。 5％FBSを含むRPMIの2ミリリットルでストレーナーを洗浄します。シャーレ内の細胞を収集します。
   2. 移転15ミリリットルファルコンチューブに細胞と細胞（300×gで、8分、4ºC）をペレット化。 5％FBSを含むRPMI500μlのペレットを再懸濁。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器で生細胞数をカウントします。

フローサイトメトリーによるサイトカイン検出のため3. 生体外刺激

1. 5％FBS、非必須アミノ酸、0.1ミリモル、50μMのβメルカプトエタノールおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI：細胞培養培地を準備します。
2. 遠心分離機腎臓、大動脈およびリンパ節（300×gで8分間、4ºC）から得られた各細胞懸濁液。 1mlあたり1×10 ⁶細胞の濃度で細胞培養培地で各ペレットを再懸濁します。
3. 細胞培養の1個毎mlのため（ホルボール12-ミリステート13-アセテート（PMA）、カルシウムイオノフォアのイオノマイシンを含む、およびゴルジ阻害剤ブレフェルジンA）細胞活性化カクテルを2μlを加えることによって細胞を刺激します。
   注：最終濃度各コンポーネントのsがある：PMAおよびイオノマイシンとPMAの81 nMの、イオノマイシンの1.33μMおよびブレフェルジンA.治療を5μg/ mlのは、サイトカインを産生する細胞を活性化します。サイトカインは、検出される細胞内で捕捉されなければならない分泌タンパク質です。ブレフェルジンAは、小胞体とゴルジ装置で正常に分泌タンパク質の蓄積を引き起こします。したがって、ここで説明する技術は、フローサイトメトリーによるサイトカイン産生リンパ球の検出能を向上させます。
4. 12ウェル2万個の細胞（大動脈または腎臓）または24ウェル（リンパ節）、低付着プレートにプレート1。 3時間、37℃の加湿CO ₂インキュベーターでプレートを置きます。
   注：播種した細胞の数は、対照マウスからのリンパ節に低くてもよいです。また、刺激の時間は、実験的に研究された各細胞集団とサイトカインのために決定されなければなりません。大動脈、腎臓またはリンパ節から単離されたT細胞のケースでは、3〜4時間の刺激をお勧めします。長く刺激ワット病気のサイトカイン分泌を増大させ、CD3、CD4およびCD8のようないくつかのT細胞表面マーカーのさらなるダウンレギュレーションを誘導するわけではありません。 （でも、3-4時間の刺激はこれらのマーカーのいくつかのダウンレギュレーションを誘導することに注意してください。）

4.表面染色

1. ポリスチレンFACSチューブ遠心（300×gで、8分、4℃）に細胞を移します。 （FACS緩衝液で2回（ ^の Ca ²⁺およびMg ⁺フリーPBS 4％FBS及び2mMのEDTAを含む）に細胞を洗浄し、所望の抗体パネルの数と必要な制御管の数に基づいて、異なるFACSチューブに均等に細胞懸濁液を分割下記参照）。
2. 各パネルの補償を行うために、各組織型および抗体パネルのために染色していない対照チューブと、単一の染色されたチューブを準備します。また、全てが、抗体の一つを添加することにより、各抗体パネルの蛍光マイナス1（FMO）対照チューブを準備します。
3. FACSで2ミリリットルに各チューブの音量を調整しますバッファ。遠心分離機は、細胞懸濁液（300×gで、8分、4℃）、氷上で10分間万個の細胞あたりの抗CD16 / CD32抗体0.5μgので細胞をインキュベートすることにより上清とブロックのFc受容体を除去します。
   注：CD16は、低親和性のIgG Fc受容体III（FcRでIII）であり、CD32は、FcRでIIです。 CD16 / CD32は、顆粒球、マスト細胞、単球/マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、B細胞、樹状細胞およびいくつかの活性化された成熟したT細胞上で発現されます。
4. 生存性染色を実行します。1×PBS 1,000μlの1×PBS、遠心分離（300×gで、8分、4℃）し、再懸濁して細胞を洗浄。細胞非透過性アミン反応性色素（生存能力染色）の1μLを加えます。光から保護して4℃で15分間インキュベートします。
5. インキュベーションの間、FACS緩衝液の適切な量で（表面染色のための）抗体のカクテルを用意。 FACS緩衝液1-2 mlの細胞を2回洗浄し、遠心分離（300×gで、8分、4℃）し、100μlの各ペレットを再懸濁抗体混合物。光から保護して4℃で30分間インキュベートします。
   注：抗体サイトメトリー各フローのために、用量滴定曲線を実行することによって、必要とされる抗体の最適量を決定するために有用です。
6. 細胞（300×gで、8分、4℃）をFACS緩衝液2mlで細胞を2回洗浄し、ペレット。

5.固定、透過処理および細胞内染色

1. 製造元の指示に従うことによって、適切な緩衝液を含む固定および透過処理キットで細胞内染色を実行します。適切なバッファに再懸濁することにより細胞を固定し、透過処理。光から保護して4℃で40分間サンプルをインキュベートします。
2. 1倍の透過性の1ミリリットルを追加し、固定し、透過性細胞に直接洗浄緩衝液。遠心分離（500×gで、8分、4℃）、上清を除去します。 1×洗浄緩衝液2mlでペレットを再懸濁します。
3. antibの混合物を準備します1×洗浄バッファー（チューブあたり通常100μl）を、適切な体積でodies（細胞内染色の場合のみ）。
   注：上記のように、最適な抗体濃度は、パネル中の各抗体について決定する必要があります。例えば、IL-17AまたはIL-17Fに対する抗体について、私たちは、1：30の希釈率を使用しますが、IFNγとのT-betに対する抗体について、我々は1の希釈係数を使用します。100。
4. 細胞を遠心（500×gで、8分、4℃）および抗体混合物100μlの各ペレットを再懸濁。光から保護して4℃で40分間インキュベートします。
5. 細胞（500×gで、8分、4℃）を1×洗浄緩衝液2mlで細胞を2回洗浄し、ペレット。 1×300μlの洗浄緩衝液でペレットを再懸濁し、適切なフィルタを用いて、フローサイトメーターで分析します。
6. 組織サンプルあたりの細胞の総数の定量化のために、計数ビーズを使用します。買収に先立ち、各チューブに計数ビーズの推奨量/数を追加します。

6.報酬、ゲーティング、正規化、およびヒント

1. 補償とゲーティング
   1. スペクトルの重なりを調整するための補償のために染色されていないと、単一の染色された対照試験管を実行します。
      注：補償ビーズではなく、セルベースの報酬コントロールの使用は、試料中の対象または細胞集団の抗原が補償用いて、細胞は困難であろうこのような低レベルで存在する場合に必要です。タンデム染料を使用した場合、タンデム色素がロットロットにし、毎日で変わるので、またノートの、各実験のための補償を準備することをお勧めします。
   2. 新しい多色実験を開始するときに、蛍光マイナスパネル内のすべてのフルオロフォアのための1つのコントロール（のFMO）を実行します。
      注：FMOのコントロールは、1以外のパネルですべての抗体を含むサンプルです。これらのコントロールは正しくadjusに省略抗体のための負のシグナル対正の正確な識別を可能にしますゲートをtは。これらのコントロールは、発現レベルは、標的集団の分離が悪い場合、または（例えば、標的は、サイトカインまたは転写因子である）、低い場合に特に重要です。必ずしも必要ではないが、いくつかの場合において、アイソタイプ対照は、FMOの代わりに好まれ得るそれらは抗原の特異性なし抗体アイソタイプとフルオロフォアコンジュゲートのための適切な補償を提供するように制御します。
   3. 第一のゲートを設定します。白血球集団を検出するために、前方散乱面積（FSC-A）および側方散乱エリア（SSC-A）の電圧を調整します。
   4. 死細胞を除外します。
      注：生存率汚れが表面と細胞の内部の両方に存在する遊離のアミンと反応します。細胞を生きるとは対照的に、（損なわれた膜を有する）死んだ細胞は、タンパク質標識の量を増加させる、色素が細胞質に入ることを可能にします。このように、死んだ細胞が容易に識別を可能にする生きた細胞よりも明るくなります。ライブ上のゲート細胞。
      注：大動脈および腎臓からの細胞懸濁液の生存率は、追加の消化工程にリンパ節からの細胞懸濁液の生存率よりも低くてもよいです。
   5. プロット前方散乱面積（FSC-A）[Y軸]と前方散乱高さ（FSC-H）[x軸]。シングレットは、このドットプロット上の対角線として表示されます。ダブレットを除外するには、この対角線上のゲート。そして、SSC-【y軸]およびCD45 [x軸]をプロットします。
   6. CD45 ⁺白血球集団を容易に識別することができます。この集団上のゲート。その後の集団は、この集団から識別することができます。
2. 細胞数の正常化
   1. カウントビーズは、低FSCおよび高いSSCになる特性を有しています。 50,000ビーズを単一細胞懸濁液を300μlに添加する場合、例えば、以下のように、チューブあたり任意の所与の細胞型の絶対数を計算するための式です。
      細胞数p計数した細胞の小胞体管=（フローサイトメーターによって計数ビーズの50,000 /数）x個。
      この計算を使用して、チューブ当たり任意の細胞型の絶対数を決定することができます。各器官から生成されたどのように多くのチューブに基づいて、器官あたりの細胞数を算出することができます。
      注：プロトコル中4℃で全ての細胞および試薬を保管してください。それは、細胞に損傷を与えることができるので、激しくボルテックスを避けてください。細胞をペレットに最小限の力を使用してください。それは、細胞死を沈殿させることができるため、FACSチューブに気泡を避けます。ペレットは、いつでも乾くせてはいけません。

結果

プロトコルは、許可をアンジオテンシンII誘発性高血圧モデルにおいて、マウス腎臓、大動脈および大動脈流入領域リンパ節から単離したT細胞における表面および細胞内マーカーの同定を記載しました。代表的な結果を以下に示します。

図1は、高血圧を誘導するために、アンジオテンシンIIを注入したWTマウスの大動脈から調製した単一細胞懸濁液中のT細胞集団を同定するために使用されるゲーティング戦略を示しています。同様の戦略は、腎臓およびリンパ節で使用されています。前方散乱面積（FSC-A）および側方散乱領域（SSC-A）の電圧は、白血球集団（G1）を検出し、破片を除外するように調整しました。生細胞（G2）は、太平洋青と結合した生存能力のマーカーについて陰性です。生細胞は、その後のみにゲートに前方散乱高さ（FSC-H）と前方散乱面積（FSC-A）でゲートしました一集団（G3）。白血球は、その後SSC-AおよびCD45（G4）にゲーティング...

ディスカッション

本明細書に記載されているプロトコルは、マウスの腎臓、大動脈およびリンパ節内に存在するT細胞サブセットを適切に同定するように最適化されている。このプロトコルは、Bリンパ球や自然免疫細胞などの他の免疫細胞サブセットを調べるために容易に適応することができ、他の組織型を含めるように変更することができます。消化ステップは重要であり^{、組織ごとに}変更および最適化する必要があります9。消化ステップの延長や不適切な酵素の使用は、抗原発現の安定性に影響を与える可能性があります。同様に、消化が不完全なと結果に影響を及ぼし、陽性細胞の数が減少する可能性があります。さらに、細胞毒性を最小限に抑えて最適な刺激を可能にするために、細胞型/サイトカインごとに ex vivo 刺激の時間を慎重に調整する必要があります。

フローサイトメトリー分析と組み合わせた細胞内染色は、血液や組織の細胞レベルで免疫プロセスを分析するための最も強力な方法の 1 つですが、この技術には限界があります。これらの制限には、心血管および腎臓組織における免疫細胞の数が比較的少ないことが含まれます。した...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コラゲナーゼ D	ROCHE	11088882001
コラゲナーゼ A	ロシュ	10103586001
コラゲナーゼ B	ロシュ	11088815001
Dnase	ロシュ	10104159001
1x 赤血球溶解バッファー	eBioscience	00-4333-57
RPMI Medium 1614 1x	Gibco	11835-030
カルシウムとマグネシウムを含まないDPBS	Gibco	14190-144
Percoll	GE Healthcare	17-5445-02	密度勾配遠心分離用
GentleMACS™Cチューブ	Miltenyi Biotec	130-096-334
GentleMACS 解離装置	Miltenyi Biotec	130-093-235	プログラムを使用
SPLEEN_04 細胞活性化カクテル (ブレフェルジンA付き)	Biolegend	423303
抗CD16/32	eBioscience	14-0161-81	希釈 1:100
LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit	Life Technologies	L34955
転写因子バッファーセット	BD Pharmingen	562725
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
123 count eBeads	eBioscience	01-1234-42
CD45 AmCyan (クローン 30-F11)	BioLegend	103138
CD3 PerCP-Cy5.5 (クローン 17A2)BioLegend		100218
IL-17A FITC (クローン TC11-18H10.1)	BioLegend	506910
IL-17F APC (クローン 9D3.1C8)	BioLegend
CD4 APC-Cy7 (クローンGK1.5)	BD Biosciences	560181
CD8 APC (クローン 53-67)	eBioscience	17-0081-82
T-bet PE-Cy7 (クローン 4B10)	BioLegend	644823
IFNγFITC(クローンXMG1.2)	BDバイオサイエンス557724