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DOI:

10.3791/55272

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2017年7月30日

 ,  , 
1Biochemical Sciences Division, CSIR-National Chemical Laboratory

この記事について

サマリー

ここでは、農業における害虫防除のための「最良適合」昆虫病原菌、 Metarhizium anisopliaeの単離、同定、スクリーニング、および選択を含む、効果的な除草剤の知識ベース開発に関わる様々な段階を報告する。

要約

商業的な殺菌剤を開発する際の大きな懸念は、殺虫剤と比較して死滅速度が速いことである。従って、速効性の非常に毒性の昆虫病原性真菌の選択のための単離およびスクリーニングは重要な工程である。接触によって作用するMetarhizium、Beauveria、およびNomureaのような昆虫病原性真菌は、昆虫の害虫によって摂取されなければならないBacillus thuringiensisまたは核多核体病ウイルス（NPV）よりも適している。本研究では、土壌希釈および餌法を用いて、感染した昆虫からMetarhizium株68株を単離した。分離株は、ITS1-5.8S-ITS2および26S rDNA領域の増幅および配列決定によって同定した。最も有毒なMetarhizium anisopliae株は、 Helicoverpa armigeraのIII-齢幼虫に対する昆虫バイオアッセイで得られた致死濃度の中央値（LC 50 ）および時間（LT 50 ）に基づいて選択した。選択された菌株による胞子の大量生産は、基質としてコメを用いた固体発酵（SSF）を用いて14日間行った。 0.1％tween-80を用いて胞子形成されたバイオマスから胞子を抽出し、胞子の異なる製剤を調製した。 ハトピースにおけるH.アルゲララ感染の制御のための製剤の実地試験は、無作為ブロック設計によって実施した。油および水性配合物（それぞれ78.0％および70.9％）で得られた侵襲制御レベルは、化学的農薬で得られた63.4％より良好であった。

概要

インドでは1940年代に有機塩素系農薬の導入から、農薬の使用は、作物害虫は依然として農業生産の歩留まり損失の観点から、毎年ルピー2の十億の原価計算で、多くの倍1が増加しています。人工合成農薬の広範囲かつ非慎重な使用は、環境と人間の健康に絶え間ない脅威である1 。農薬の無差別な使用は、土壌中の残留物および天然害虫捕食者の枯渇を招く。それはまた、害虫個体群の遺伝的構成を変えるための強力な選択圧力として働き、抵抗性の発達につながる1 。肥料や農薬のような高投入が必要な緑色革命の巨大な利益にもかかわらず、害虫は依然として主要な生物的制約となっています。インドおよび世界の年間作物喪失量の概算は、120億ドル2億米ドル3となった。

化学農薬が害虫を防除するのに悪影響を及ぼす場合、生態学的に健全で、信頼性が高く、経済的で、持続可能な代替方法を探すことが不可欠になります。生物学的防除は、適切な選択肢を提供し、寄生虫、捕食者、および微生物病原体の使用を含む4 。真菌は、例えば、鱗翅類、扁桃体、鞘翅目および双翅目を含む広範な害虫に感染し、しばしば自然流産を引き起こすことが知られている。さらに、他の細菌およびウイルスの昆虫防除剤とは異なり、昆虫病原性真菌の作用様式は接触によるものである5 。これらの真菌は、100以上の属の異種群を含み、異なる昆虫の間で約750種が報告されている。重要な真菌病原体は： Metarhizium sp。、 Beauveria sP。、Nomuraeaのrileyi、Lecanicillium のlecanii、およびHirsutella sp が 。、6数名に。 M. anisopliae （Metchnikoff）ソロキンは、生物防除における第2の最も広く使用されている昆虫病原菌である。 200種以上の昆虫を攻撃することが知られている7 。

この研究では、 M. anisopliaeを用いたマイコプラズマの知識ベース開発に関わるさまざまな段階が提示されている。これには、1）有毒な昆虫病原体の源（ すなわち、土壌または菌類の昆虫）の同定、2）昆虫病原体の同定および選択、3）実験室バイオアッセイおよび現場での毒性および有効性を維持するための戦略）感染性繁殖体の費用対効果の高い製剤、5）毒性調製のための独特の品質管理パラメータの開発、および6）バイオプローブおよび付加価値。

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プロトコル

昆虫病原菌の単離

  1. 土壌希釈法
    1. 異なる作物畑から土壌サンプルと菌糸昆虫を収集する（ 表1 ）。土壌希釈メッキ法を用いて土壌試料から昆虫病原性真菌を単離する8 。
      注：この調査では、プネー（18°31'13''N; 73°51'24''E）およびブルダナ（19°58'36''N 76°30'30''E ）地区、マハラシュトラ州、インド。
    2. 各土壌サンプル10gを秤量し、90mLの滅菌0.1％（w / v）Tween-80に別々に加える。
    3. 磁気スターラーを用いて60分間サンプルを徹底的に混合して、土壌粒子に付着した胞子を放出させる。
    4. 混合後、（g / L）：ペプトン、10：1を含む選択培地上に、各試料から100〜200μLのアリコートを広げる。グルコース、20;寒天、18;ストレプトマイシン、0.6;テトラサイクリン、0.05;サイクリングロヘキサミド、0.05;およびドジン、0.1mL; pH 7.0 9 。プレートを28℃で3〜7日間インキュベートする。
    5. 純粋な培養物を得るために、個々の胞子形成コロニーを同じ培地上で選択し、継代培養する。
  2. 真菌の昆虫から
    1. フィールドから菌糸を集めます。
      注：幼虫の体は昆虫病原菌に感染する可能性が高い。細菌やウイルスに感染すると死んだ虫体は柔らかくなります。
    2. 異常な行動、貧弱な調整、ぎこちない動きで生きている昆虫を集める。
    3. 死ぬまで昆虫を飼育してから28℃、70〜80％RHで湿菌室に移し、さらに真菌症と胞子形成を起こさせます。
    4. 上記の選択培地上に芽胞形成した死体由来の胞子をストリークし、同じ培地上でさらに2〜3回継代培養することにより純粋な培養物を得る。
  3. ベイト法
    1. 〜でバイアル（3.85 x 6.0 cm）に60 gの土壌サンプルを入れ、4匹の蛾の幼虫（ Corcyra cephalonica ）を加え、バイアルを25±2℃に14日間保つ。
    2. バイアルを毎日逆さまにする。 14日後、土壌試料をスクリーニングして、イネの蛾の幼虫の存在についてスクリーニングする。選択培地上で胞子形成する死体から胞子をストリークすることによって昆虫病原性真菌を単離する。
    3. 純粋な培養物を得た後、単離物をポテトデキストロース寒天（PDA）スラントに移し、28℃および70〜80％RHで7日間インキュベートして胞子形成させる。胞子形成後、使用するまで8℃で母培養を維持する。

2.陸上病原菌の同定

  1. 形態学的特徴（ すなわち、無胞子の大きさおよび形状ならびに分生子胞子上の胞子の配置）を観察することによって昆虫病原性真菌を同定する。 3つの主要属、 Metarhizium 、 Beauvの分離株 ERIA、およびNomuraea、識別することができます。
  2. Metarhizium株の分子同定のために、DNA単離キットを用いて菌糸バイオマスからゲノムDNAを抽出する;製造元の指示に従ってください（ 材料表を参照）。 0.8％アガロースゲル上で電気泳動を行うことによってゲノムDNAの品質をチェックする。
    1. ITS1-5.8S-ITS2および26S rDNA領域をPCR増幅する。 （TCCTCCGCTTATTGATATGC）プライマー10を前後進ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）およびITS4を用いて、鋳型としてゲノムDNAを使用します。
    2. ゲル抽出キットを使用して、予想されるサイズのアンプリコンをゲル溶出および精製する。製造元の指示に従ってください（ 材料表を参照）。精製されたアンプリコンおよび配列を定量する。
    3. ソフトウェアを使用して配列を読み取り、編集し、NCBI GenBankデータライブラリーのヌクレオチド配列のBLAST検索を行って、近い相同性を分析する= "xref"> 11。
    4. 受託番号を検索するために、同定された微生物病原性単離物の配列をNCBI GenBankデータベースに寄託する。

3. H. armigeraに対するMetarhizium分離株のスクリーニング

  1. 昆虫の飼育
    1. 野生の幼虫と昆虫の蛹を畑から採集することにより、 H. armigeraの初期培養を確立する。
    2. 飼育のために、10分間12 0.5％（v / v）の次亜塩素酸ナトリウムで消毒オクラの断片を含有する滅菌ポリプロピレンバイアル（3.85 X 6.0センチメートル、50mLの容量）で個別幼虫を育てます。
    3. 飼育中の虫卵を集め、0.5％（v / v）次亜塩素酸ナトリウムで表面殺菌する。
    4. 25±2℃および65±5％RHで幼虫を維持する。
  2. 昆虫バイオアッセイ
    注：昆虫バイオアッセイのために、胞子、フィールドパフォーマンス研究では、別段の記載がない限り、菌根菌H. armigera幼虫のMetarhizium株の最初の継代培養を使用した。
    1. 昆虫バイオアッセイのために、 H。armigeraのIII-齢幼虫を使用する。
    2. 3つの30匹の幼虫を、個別にMetarhizium単離物の10mL胞子懸濁液（別に言及しない限り1×10 7胞子/ mL;生存率> 90％）に5秒間浸漬する。
    3. 処理後、それぞれの幼虫を別々の滅菌バイアルに移し、食肉連鎖を回避する。それぞれのバイアルに湿ったWhatmann濾紙1号と消毒したオクラを飼料として加えます。別の日に用紙とフィードを変更します。
    4. 幼虫を25±2℃、65±5％RH、および16：8の明暗で14日間または死ぬまで保ちます。
    5. 死んだ幼虫を湿った綿棒を入れた滅菌ペトリ皿に移し、28℃および70〜80％RHで3〜7日間保ち、菌糸および胞子死体の上に形成される。
    6. 対照のために、滅菌蒸留水中の0.1％（w / v）Tween-80を用いて30匹の幼虫を3連で処置する。
    7. 新たに調製した胞子懸濁液を用いて、すべての実験を3回実施する。平均値を得るために、3回の実験からの死亡率に関するデータを収集しプールする。 Abbottの式13を用いて補正された死亡率を計算する。
    8. ランダム化完全ブロック設計（RCBD）レイアウトを使用して実験を行い、各処理は30匹の幼虫のセットを三重に含む。 H. armigeraに対する死亡率のパーセントに基づいて、 Metarhizium分離株を選択して、商業生産のための最良の分離株をさらにスクリーニングする。
    9. H. armigera III-齢幼虫に対して> 90％の死亡率を示す分離株を選択する。
      注：ここでは、12の分離株が選択された。
    10. これらの分離株のLT 50を決定し、分離株を選択する最も短い死亡率を（短い時間で）評価する。
      注：ここでは、最も強力な12株から5株が選択された。
    11. 四つの異なる（すなわち、1×10 3、1×10 5、1×10 7、1×10 9個の胞子/ mL）の濃度の胞子懸濁液を用いて単離選択のLC 50値を決定します。
    12. H. armigeraの III齢幼虫に対するMetarhizium分離株のLC 50を測定し、単一用量のみを使用した場合には検出されない高い死亡率値を有する分離株の病原性の差異を同定する可能性を高める。

4.フィールドパフォーマンス研究のためのメタリジウム分離株の胞子の生産

  1. SSFによるMetarhizium胞子の生産
    1. SSFについては、 Metarhizium単離物の2×10 7個の胞子を添加して接種物を調製する。200mLのYPG（0.3％酵母エキス、0.5％ペプトン、および1.0％グルコース）培地。フラスコを振盪（180rpm）しながら28℃で48時間インキュベートする。
    2. SSFによる胞子の大量生産には、特に断りのない限り、基質として米を使用する。
    3. SSFの場合は、2kgの米を入れたオートクレーブバッグ（0.5μmの1つの微小濾過フィルターを備えたタイプ/ 14;容量2kg、64×36cm）を充填する。袋の中の米に蒸留水1000 mLを加え、 14晩浸します。 121℃で45分間浸漬した米で袋をオートクレーブする。15 。
    4. 48時間経過した菌糸接種物（10％接種物、2kgの米について200mL）を接種し、28℃および70〜80％RHで14日間インキュベートする。
    5. 0.1％Tween-80を用いて液体抽出により胞子を収穫する。このために、バッグの内容物を0.1％Tween-80（米1kgあたり3L）に加え、完全に混合し、遠心分離によって液体から胞子を分離し、37℃で2日間乾燥する< / li>
    6. あるいは、胞子といくつかの菌糸体を含む米を入れた袋を37℃で2日間乾燥させて含水量を減らす（<20％）。 myco-harvesterまたはvibro-sifterを使用して胞子を収穫する。
  2. 生存率調査
    1. 異なる方法を用いて収穫した胞子の生存率を決定する15 。このために、0.1％（w / v）Tween-80中で胞子懸濁液を調製し、1×10 3個の胞子/ mLに調整する。
    2. 胞子懸濁液（0.1mL）をPDAプレート上に三重に広げ、28℃および70-80％RHで72時間インキュベートする。
    3. 単離されたコロニーを手動で数え、それぞれのサンプルの生存可能な総数を決定する。
  3. 胞子沈降速度
    1. 均一な投与量のためには、均質な胞子懸濁液が必要である。記載されているようにMetarhizium分離株の胞子沈降速度を決定する"xref"> 16。 0.2M硫酸アンモニウムおよび0.1％Tween-80中の胞子の沈降速度を調べる。
    2. 胞子懸濁液のカウントを約7×10 7胞子/ mLに調整して、540nmで0.6の初期吸光度を得る。胞子が沈降するためにキュベットを6時間静置する。
    3. 6時間まで吸光度を記録する。パーセントで沈降速度を発現し、50％の沈殿（ST 50）に要する時間を計算します。新たに調製した胞子懸濁液を用いて実験を3回繰り返す。

5. Pigeon PeasにおけるH. armigeraの防除のための選択M. M. anisopliae分離株の能力試験

  1. M. anisopliae M 34412胞子の水和剤
    1. 胞子をタルクと混合することにより、2.5〜5％の水和剤を調製する。
    2. 最終生存数（TVC）を1 x 10 12 spoに調整する製剤1kg当たりの経口投与量。
  2. M. anisopliae M 34412胞子のフィールドパフォーマンス研究
    1. ピジョンエンドウのH. armigera感染を制御するために選択されたM. anisopliae分離株の能力のフィールドパフォーマンス研究のために、4回の反復でRCBDを使用する。
      注：ここでは、Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth（MPKV）、Rahuri（19.3927°N、74.6488°E）で行われた。
    2. 胞子（5×10 12胞子/ 3Lのディーゼル：ヒマワリ油、7：3）およびTween-80（0.1％）中の水性製剤の2つの異なる噴霧製剤を使用する。ナップザック式噴霧器（5×10 12個の胞子、500L / ha）を用いて、水性処方物を超低容量（ULV）噴霧器（70分; 3L / ha）で噴霧する。
      注：ここでは、幼虫個体群はスプレー前日に記録され、3日後および7日後に無作為に選択された5つの植物にそれぞれ記録された。総人口はt統計解析のためにn + 1の平方根に変換されます。
      1. ピジョンエンドウ作物の農業慣行によると、卵を飼育した後10日から15日の間に最初の散布を行い、14日間隔で2回以上散布する。 16：00〜18：00 ISTの間に噴霧を行います。風の方向を監視し、必要に応じて布のカーテンを使用して、胞子の隣接するプロットへのドリフトを避けます。
    3. 比較のために、化学的殺虫剤に手圧縮ナップザック噴霧器をスプレーする。
    4. 噴霧後0日、3日、5日、7日、および14日目のH. armigera幼虫を収集することによって、現場での接種物の持続性を判定する。
    5. これらの幼虫を14日間観察し、死後に湿らせた濾紙を入れたプラスチックバイアルに移す。真菌症を観察するために、25±2℃および70±10％RHでインキュベートする。
    6. pに基づいて幼虫個体群における接種物の持続性を決定する。噴霧後に圃場から採取した幼虫の死亡率のデータ。
    7. 効力パーセント17 、ポッドダメージパーセント、歩留まりパーセント18に基づいて現地調査を評価する。
      注：ここでは、温度、湿度、風速（km / h）、日照（h）、降雨（mm）、雨の日、蒸発（mm）などのパラメータのデータは、農業大学（Mahatma Phule Krushi Vidyapeeth、Rahuri、19.3927°N、74.6488°E）。
  3. 農民参加型プログラム
    1. デモンストレーショントライアルの農家数を選択します。鳩の種子（BSMR - 736）と肥料を農家に供給します。
      注：この調査では、20人の農民が関与していた。村：Deolali Pravara、（19.473°N 74.6°E）。
    2. 手順5.2と同じスプレー配合とスプレー数を使用してください。
tle "> 6。非標的生物への影響

  1. ミコシン系殺虫剤の噴霧があれば、それをハトの葉につけてください。
  2. 未処理の区画およびM. anisopliaeで処理した区画で、各処理の1日後に土壌の節足動物および葉に生息する昆虫を収集する。
  3. 処理後24時間以内に落下トラップを有する土壌棲息節足動物を収集し、処理後の午前中（ すなわち、処理後約15〜18時間）掃除用ネットで葉に生息する昆虫を収集する。
  4. 直径3.5cm、高さ4.0cmの円筒形プラスチック製箱に個々に保管してください。昆虫に毎日感染がないか調べ、適切な食物を与えてください。
  5. M. anisopliaeの存在を記録し、真菌を単離する。

7.品質管理パラメータの特定

  1. 28℃でPDA上の胞子発芽を測定することにより、胞子の生存率をチェックする。; C。
  2. 前述の15のように、キチン分解酵素活性、例えばキチン分解酵素、キチン脱アセチル化酵素、キトサナーゼ、プロテアーゼ、リパーゼをYPGとキチン培地で測定する。
  3. 実験室のバイオアッセイでH. armigeraの死亡率を決定する15 。
  4. 毒性はM.のanisopliae属性として、そのようなキチナーゼのPCR-RFLPパターン（ チット 1、2、および4）およびプロテアーゼ（PR1A）遺伝子の分子マーカーを使用します。
    1. DNA単離キット15を使用して、菌糸バイオマスからゲノムDNAを抽出する。プライマー対Chit1F / Chit1R（CTCTGCAGGCCACTCTCGGT / AGCCATCTGCTTCCTCATAT）およびChit2F / Chit2R（GACAAGCACCCGGAGCGC / GCCTTGCTTGACACATTGGTAA）を用いて、ゲノムDNAを鋳型として、 Chit1およびChit2遺伝子断片をPCR増幅する。 Chit4については、プライマー対Chit4F / Chit4R（ATCCGGCAGCACGGCTAC / CTTGGATC CGTCCCAGTTG）。
    2. Pr1A遺伝子の増幅には、METPR2およびMETPR5プライマー対（AGGTAGGCAGCCAGACCGGC / TGCCACTATTGGCCGGCGCG）を使用します。
    3. BsaJI 、 BstUIおよびScrFIを用いてChit1遺伝子の制限消化19を実施する。 Chit2遺伝子のAluI 、 HpyCH4IV 、およびHpyCH4V 、およびChit4遺伝子のBstUI 、 HaeIII 、およびMboIとの相互作用を示す 。 Pr1A遺伝子の消化には、 RsaI 、 DdeI 、およびMspI 20を使用します。
    4. 大部分の毒性株（> 90％死亡率）の各遺伝子の電気泳動による1.5％アガロースゲル上の制限断片長多型（RFLP）パターンを観察する。これはM. anisopliaeの選択のためのビルレンスマーカーとして使用することができる。

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結果

調査中、 メタリジウム、ボーベリア 、及びNomuraeaの異なる株は、 メタリジウム株として14が Hのオオタバコガ 、パルス6に恐ろしい害虫、14の制御で、より効果的であることが見出された（データは示していない）6、様々な単離方法により単離しました異なる作物畑および昆虫からMetarhizium株を単離するためにさらなる単離を標的とした（ 表1 ）。得られたMetarhizium分離株の合計は、文化的および形態学的特徴およびITS 1-5.8S-ITS 4配列決定によって同定された。実験的バイオアッセイにおけるH. armigeraの> 90％の死亡率に基づいて、12のMetarhizium分離株を、胞子生成、生存率、L...

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ディスカッション

1880年代に、最初の試みでは、 スガラ・ビートル、 Anisoplia austriaca、およびサトウダイコンcurculio、 Cleonis punctiventris 21をコントロールするためにMetarhiziumを使用しました。このプロトコルでは、前提条件の1つは、土壌または感染した昆虫のいずれかから有毒株を単離することであった。実際、このようなLC 50、LT 50、およびST 50などの他のパラメータは、著しく製品22、23の費用対効果に貢献しました。胞子産生の最適化のために、胞子数、生存率、病原性の間の微妙なバランスが維持された24 。

農業は大量かつ低コストの製品であるため、品質の認識、エンドユーザ...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

著者は、ニューデリーのバイオテクノロジー部門のインド・スイス共同研究（ISCB）プログラムと、スイスのベルンの開発協力のためのスイス機関からの共同研究者の貢献を認めています。 Vandana Ghormade、Pallavi Nahar、Priya Yadav、Shuklangi Kulkarni、Manisha Kapoor、Santosh Chavan、Ravindra Vidhate、Shamala Mane、Abhijeet Landeを含む、マイコン殺虫剤の開発に関与するプロジェクトの学生とスタッフの貢献は認められています。 EKPとSGTは、それぞれインドの大学助成委員会、インドの科学産業研究評議会（CSIR）、研究フェローシップに感謝します。 MVDはニューデリーの工業科学研究評議会から名誉科学者制度の支持を表明しています。著者は、ISCBおよびSBIRIプログラムの下での資金援助のために、インドのニューデリーにあるBiotechnology Departmentに感謝しています。私たちは感謝しています査読者にその入力を知らせる。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
寒天地 Hi-MediaRM666試薬
硫酸アンモニウム Thomas Baker11645試薬
DNA 分析装置 応用生命体ABIプリズム3730  楽器
DNA統合キットQiagen69104試薬
DodineSigma45466試薬
ゲル抽出キットQiagen28604試薬
GlucoseHi-MediaGRM077試薬
Knapsac sparyerKaypeeHY-16L (1004)機器
PeptoneHi-MediaRM006-500G試薬
ポリプロピレンバイアル LaxbroSV-50プラスチック製品
ポテトデキストロース寒天培地(PDA) Hi-MediaM096-500G試薬
Tween-80SRL28940試薬
超低容量スパイヤーマタビINSECDISK機器
ユニコーンバッグ ユニコーンUP-140024-SMBオートクラバルベバッグ
Hi-MediaRM027-500G試薬
Chromas 2.1ソフトウェア
培 SSF酵母抽出物用

参考文献

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