原発性前立腺細胞の分化のための迅速なフィルターを挿入ベースの3D培養システム

サマリー

ここでは、初代前立腺上皮細胞の三次元培養とその後の管腔分化を支援する迅速なin vitroシステムを確立する方法を提示します。

要約

条件付きで再プログラムされた細胞（CRCが）初代培養細胞と患者由来細胞株の大規模な「生きたバイオバンク」を開発する能力のための持続可能な方法を提供します。上皮細胞の多くのタイプのために、様々な3次元（3D）培養アプローチは、改善された分化状態をサポートすることが記載されています。 CRCが、それらが分離されている、そこから組織への系統コミットメントを保持するが、それらは通常の2次元（2D）培養条件下で増殖させた場合起源の組織に関連分化マーカーの多くを発現しません。前立腺癌の研究のための患者由来のCRCのアプリケーションを強化するために、3D培養形式は、正常および腫瘍由来の前立腺上皮細胞の両方の急速な（2週間合計）管腔細胞分化を可能にするように定義されています。ここで、フィルタインサートベースのフォーマットは、正常および悪性の前立腺のCRCの両方の培養および分化のために記載されています。デ免疫組織化学および免疫蛍光染色のための細胞の収集および処理に必要な手順の尾説明が提供されます。総称して、プライマリCRCラインと組み合わせて説明した3D培養フォーマットは、生物試料ベースの前立腺研究のためのスループットモデルシステムを高するための重要な中長期を提供します。

概要

個人にパーソナライズされた癌治療の同定および使用は、癌研究における第一の目標です。最近、新しいアプローチが開発されており、潜在的に識別し、パーソナライズされた治療法をテストし、両方の方法を提供し、初代細胞培養の確立でより容易にするために可能にします。例えば、Rスポンジンベース前立腺オルガノイドアプローチ^1は、セルの条件付き再プログラミング（CRC）法が、商業外マトリクス（ 例えば 、マトリゲル）中の正常および転移性前立腺癌細胞の三次元（3D）培養を可能にしますジョージタウン^2、3で開発は、より標準的な2D培養条件を利用します。具体的には、Rhoキナーゼ阻害剤（Y-27632）、照射J2マウス線維芽細胞フィーダー細胞の組み合わせは、ケラチノサイトのCRC ²の不定培養をもたらします。 CRC方法であります極めて堅牢、初代細胞株が正常に確立し、前立腺癌および他の多くの正常および悪性上皮組織³から無期限に維持したまま。重要なことは、私たちのCRC技術は、以前の薬物治療の数を失敗していた患者における再発性呼吸器乳頭腫症のための病因の基礎の迅速な同定を可能にしました。また、正常および腫瘍由来のCRCを使用して、FDAの成功同定は、薬物、ボリノスタットは、初期の組織生検の2週間以内に行われた承認されました。患者は、その病気⁴の成功した治療の結果、ボリノスタット上に置きました。

正常な前立腺は管腔、基底と希少な神経内分泌細胞⁵から構成されています。管腔細胞が腺の円柱上皮層を形成し、アンドロゲン受容体（AR）、ならびにサイトケラチン8と18とプロのような他の管腔マーカーを発現します状態特異的抗原^{（PSA）6。}逆に、基底細胞が管腔層の下に局在し、サイトケラチン5およびP63が、AR ⁵を低レベルで発現しています。私たちは^{、7、8、9、}その他^10が正常^に前臨床メカニズムの薬剤感受性調査で前立腺CRCを使用しています。標準2D組織培養条件下で増殖させた場合しかし、これらの細胞は、完全に^{10シグナリング} ARに係合することができません。免疫不全マウスの腎被膜下に置かれたとき重要なのは、CRCは許容する環境に置かれたとき、前立腺CRCがその系譜コミットメントを維持していることを示す正常前立腺腺のアーキテクチャと機能を取り戻しました。ここで説明したフィルタインサート基づく細胞培養系の開発が急速に（2週間）のために証明さbと前立腺のCRCのインビトロ分化を可能にします増加したARとAR標的遺伝子の発現と同様には、P63のレベルを減少させたY。

使用されるフィルタインサートは、哺乳動物細胞の培養を支持することができるポリカーボネート膜（孔径0.4μm）を含みます。システムは、開発され、正常および悪性前立腺のCRC、6ウェル培養皿とフィルタインサートを利用します。 J2セル¹¹によって調整細胞培養培地を上部チャンバーに下部チャンバと前立腺分化培地中に置かれます。本明細書に記載の技術は、個別化医療の目標と一致して2週間の時間枠内に前立腺管腔細胞分化をサポートしています。文化の総合的、分子遺伝学および細胞プロファイリングを可能にする方法論を開発することも不可欠でした。フィルター表面から放出された細胞からのDNA、RNAおよびタンパク質を単離するための手法が開発され、正確な反復サンプル処理のための合理化されています。フィナLLY、埋め込みを有効にするフィルタを削除切片とH＆E、免疫組織化学および免疫蛍光染色のために必要な方法論は、完全に記載されています。

プロトコル

3D細胞培養インサートシステムの1.設立

1. 6ウェルプレート（ 図1A）にダウン逆方向（フィルタ側まで）で2ポリカーボネート細胞培養インサートを配置します。
2. インサートの底面側に水中0.1％ゼラチンの薄い層を適用し、無菌性を維持するために、生物学的安全キャビネットの中で（10〜20分間）乾燥させます。
3. 手順を繰り返し1.2インサートに0.1％ゼラチンの3アプリケーションの合計2回以上。
   注：ゼラチンコーティングは、チャンバ間の拡散を制限するのに役立ちます。
4. 培養フラスコを洗浄するためのPBS 5 mLを加え、標準的な培養条件から主CRCを収集します。
   1. 37℃で5分間、0.25％トリプシン-EDTA（T-75のためのT-25及び2mLのために1 ml）を用いて細胞をトリプシン処理。細胞を穏やかに取り除くのを助けるために、フラスコの側面をタップします。その後トリプシン反応を停止し、完全DMEMを5ml加えることにより細胞を収集するために進みます。
   2. 集めます 15 mLチューブ内の細胞。 4℃、188×gでチューブを遠心し、自動細胞カウンターまたは血球計数器を使用してカウントされます。
   3. メディア（CM）を条件付け250μL60万CRCを再懸濁し、適切に配向（フィルタ側を下に）カルチャーインサート（ 図1B）に追加します。これは、内部チャンバと呼ばれています。
      注：CMは、照射J2細胞によって条件付けF-メディアであると以前に^{7、8、9、11を}説明したように10μmのY-27632が含まれています。
5. 6ウェルプレートの外側室にCMの2ミリリットルを適用し、（少なくとも18時間）、37℃で一晩インキュベートします。
6. 慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットを用いて内部チャンバにCMを削除して、ゆっくりと完全になるまで1 mLのピペットで内室に分化培地（DM）を追加します。細胞層を乱さないように注意してください。

3Dの文化のル "> 2。メンテナンス

1. 毎日文化を確認してください。 図2に示すように、健康な細胞が出現します。
2. 外側チャンバ内のCM毎日または細胞の代謝に応じて一日おきに変更します。
3. 内部チャンバのメディアは、色（黄色）を変更する場合は、慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内部フィルター室にメディアを削除します。
4. 吸引先端を有する外側6ウェルプレート室でメディアを吸引除去します。
5. 1 mLのピペットを使用して、ゆっくりと完全になるまで、内側室に新鮮なDMを適用します。こすりまたはその他の細胞層を落とさないように注意してください。
6. 新鮮なCM 2mLで外側室でメディアを交換してください。
7. 2週間の文化を維持し、目的の生体分子の分離のための処理に進みます。
   注：6ウェルプレートの各行は、6インサート（ 図1B）の合計は、DNのための十分な細胞を取得するために、実験ごとに処理する必要があります分析のために、RNAまたはタンパク質。
8. 外側チャンバ内を吸引メディアとは、2 mLのリン酸緩衝生理食塩水（PBS）ですすいでください。
9. 慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内側チャンバからメディアを取り出し、500μLのPBSを追加します。スクレイピングまたはそうでなければ、膜上の細胞を乱すことは避けてください。
10. 吸引除去し、PBS外側チャンバから、慎重に1ミリリットルまたは200μLピペットで内部チャンバーからPBSを削除します。 PBSを除去した後、以下に詳述する適切なアプリケーションに直接進みます。膜を乾燥させないでください。アプリケーションを開始する準備ができるまで、文化はPBSで簡単に維持することができます。

3.ペレットバンキング用フィルターの処理

1. 各内部チャンバ100μL、0.25％トリプシン-EDTAを加え、37℃で5分間インキュベートします。
2. （puncを避ける上下にピペッティングとしながら、200μLピペットで膜表面上の細胞をこすり/簡単に言えば、慎重に攪拌）膜をチューリング。 37℃で1分間インキュベートします。
3. フィルターを洗浄するために静かに上下最初の内室とピペットにCMの250μLを追加します。
4. 転送は、同じメディア条件が含まれており、上下にピペッティングを繰り返し、隣接するフィルタ室に細胞を再懸濁しました。
5. 単一条件の挿入ごとに、この手順を繰り返します。収集し、1.5 mL遠心チューブに細胞を移します。
6. 残りの細胞を収集するために、CMの追加の100-200μLで各内側チャンバを洗い流します。ステップ3.5で1.5 mLの遠心分離管に追加します。
7. 5分間、4℃で微量で423×gで細胞をスピン。
8. 上清を吸引除去し、1000年μLPBSで一度細胞ペレットを洗浄します。
9. 5分間、4℃で微量で423×gで再びスピン。
10. 吸引し、PBS、後で使用するために-80℃で凍結。

4. RNAまたはDNAの単離のためのフィルタの処理

1. 内室にグアニジンチオシアネート - フェノール - クロロホルムまたは類似の抽出試薬の200μLを加え、簡単に上下にピペッティングすることにより、膜表面上の細胞を攪拌。
2. 外室の乾燥を用いて室温で5分間抽出試薬でインキュベートします。
   1. フィルタは、挿入から解離することができるように、上下に抽出溶液をピペットで解離し、フィルター膜を洗浄してください。 6ウェルプレートを傾けると、残留液体を吸引することにより、可能な限り抽出試薬をできるだけ多く収集します。
3. 精製およびDNA、RNAまたはタンパク質の回収のための製造業者のプロトコルに従ってください。

5.タンパク質単離のためのフィルタの処理

1. 氷上で6ウェルプレートにフィルタインサートを置きます。内側チャンバーに、10μLの1mMフッ化ナトリウム（NaF）、1mMのバナジン酸ナトリウム（NAV）、100mMのdithiothreを補充したタンパク質の溶解緩衝液を追加ITOL（DTT）および抗プロテアーゼカクテルの100μL。
2. /攪拌上下にピペッティングしながら20μLピペットで膜表面上の細胞をこすり取ります。溶解緩衝液中に気泡を発生させることは避けてください。
3. 10分間氷上でフィルターインサートで6ウェルプレートをインキュベートします。
4. 掻き繰り返し、次いで溶解緩衝液で膜表面をすすぎます。
5. 6インサートからの溶解物を収集し、氷上で1.5 mL遠心管に移します。
6. 溶解緩衝液の追加の10μLと第一の膜をすすぎ、次のフィルタに転送します。
7. すべての挿入を繰り返しステップ5.6、任意の残留溶解緩衝液を収集し、1.5 mLのチューブ（ステップ5.5）に追加します。
8. さらに5分間氷上でサンプルをインキュベートします。
9. 4℃で15分間、最高速度（テーブルトップ遠心分離機で16873×gで）でスピン。
10. 新鮮な1.5 mLのチューブにピペット溶解液上清。
11. タンパク質濃度やSTOの分析に進みます-80℃での溶解物の再。

6. H＆Eの処理及び免疫染色

1. 内側と外側のチャンバーに500μL、10％NBF（中性緩衝ホルマリン）の1 mLを加え、4℃で一晩インキュベートしましょう。
2. 外側室からNBFを吸引し、1 mLのヒドロキシエチルアガロース（HEA）1.5 mL遠心に処理ゲルを追加します。ゆっくりと低消費電力を使用して電子レンジでアガロースを融解し、アガロースが溶けるまで、10から20秒のパルスを繰り返しました。
3. 使用する準備ができるまでの凝固を防ぐために、37℃の温浴中でHEAを保管してください。
4. 内側チャンバからNBFを外し、内部チャンバに溶融HEAの25μLを適用し、アガロースは、2-5分間固化することができます。
5. ウェット2発泡組織学パッドを10％NBF中と包埋カセットに一つのパッドを配置する（ 図3Dを参照）。
6. インサートの底面側からフィルタを獲得するために（非常に鋭い、微尖った刃を持っている）＃11ブレードメスを使用しますチャンバーは、部分的にプラスチック製のインサート室からそれを解放します。
7. ペトリ皿にNBFの少量（100〜200μL）を配置し、NBF（ 図3A）で部分的に外れフィルタを浸します。
8. ＃10ブレードメスで、静かに完全に挿入バレル（ 図3B）からフィルタを取り除くために、インサートチャンバーの内側から、フィルタの中央押し付けます。まだバレルに取り付けられているフィルタの任意の部分がある場合には、メスを用いてそれを切断します。
9. ＃10ブレードメス（ 図3C）で半分にHEAコーティングされたフィルタをカットします。
10. ステップ6.4（ 図3D）で作製した組織学カセットにフォームパッドの上にフィルタの各半分を置きます。
11. フィルタを挟んで、カセットに2つ目の10％NBF浸したスポンジを追加します。
12. スナップNBFカセット、場所を密封し、一晩インキュベートします。
13. 切片や染色などのためにパラフィンブロックへのプロセスフィルター以前¹²記載。

結果

細胞培養インサートに基づくシステムは、管腔細胞分化をサポートしている前立腺のCRCの3D培養物を作製するための比較的単純かつ迅速な方法です。システムの概略フィルタインサートの下面にゼラチンコーティングの適用を強調し（ 図1A）が示されています。インサートはゼラチンのみの適用のために覆されています。 図1Bにフィルタが培養のための適切な向きです。透明セルの挿入を使用して、健康的な3D前立腺CRC文化の代表画像は（10X）（ 図2）に示されています。実証健康のCRCの密な階層化は、設立後典型的であり、標準的な光学顕微鏡を用いて可視化することができます。最初の確立時に、この方法は、所定の細胞株およびその適切な添付ファイルやラと互換性があることを確認するために形成された細胞の層を可視化することが重要です細胞のイエリングが発生しています。

上記のようにHEAはイ...

ディスカッション

初代細胞株は癌研究のための重要かつ急速に発展プラットフォームです。カルチャーインサートベースの3D培養系は、2週間の期間内に原発性前立腺のCRCの分化をサポートしています。 CRCフィルタ法は、前立腺の研究のための新しい媒体スループット法を表します。既存のマウスPDXモデルは時間がかかり、非常に高価であり、PDXサンプルの多くは、研究者によって開始実験とその有用性を制限し、培養物中で成長させることができません。また、PDXの確立の成功率が大きく^13を変化しながら、CRC方法は、細胞株^3の確立の成功率が高いです。我々は、我々のシステムは、Rスポンジンベースの前立腺オルガノイドアプローチに相補的であるように考慮します。しかしながら、原発性前立腺癌からオルガノイドの確立に関しての成功の欠如は^14報告されています。さらに、メディア、設立の方法、そして、のCRCのメンテナンスは、Rスポンジンベースの前立腺オルガノイドのアプローチよりも大幅に簡素化されています。追加の利点として、CRCは確立さ直接分子比較の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Corning Costar Snapwell Culture Inserts	Corning	3801
Millicell Cell Culture Inserts	Millipore	PIHP01250
Multiwell 6 Well	Falcon	353046
ゼラチン0.1% 水中	Stemcell Technologies	7903
Sterile Saftey Scapel 10 Blade	Integra Miltex	4-510
滅菌標準メス 11 ブレード	インテグラ ミルテック	4411
RIPA 溶解および抽出バッファー	サーモフィッシャー サイエンティフィック	89900
フッ化	フィッシュサー サイエンティフィック	S299-100
バナジウム酸	フィッシュサー サイエンティフィック	13721-39-6
ジチオスレイトール	シグマ-アルドリッチ	3483123
プロテアーゼ阻害剤カクテル(AEBSF、アプロチニン、ベスタチン、E-64、ロイペプチン、ペプスタチンA)	Sigma-Aldrich	P8340
0.25%トリプシン-EDTA(1x)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200-056
DMEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11965-092
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィ	25030081
ペニシリンストレプトマイシン	サーモフィッシャーサイエンティフィ	15140-122
F-12栄養素ミックスメディア	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11765054
Y-27632二塩酸塩ロック阻害剤	エンツォ	ALX-270-333-M025
ドロコルチゾン	シグマアルドリッチ	H0888
EGF	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHG0315
Insulin	Thermofisher Scientific	12585-014
コレラ毒素	Sigma-Aldrich	C3012
Gentamicin	Thermofisher Scientific	15710-064
Fungizone	Fisher Scientific	BP264550
Trizol Reagent	Invitrogen	15596026
Histogel Specimen Processing Gel (ヒドロキシエチルアガロース(HEA))	Thermo Scientific	HG-4000-012
非接着性ドレッシング	Telfa	KDL2132Z
細胞培養ディッシュ	Sigma	SIAL0167
HISTOSETTE II 組織処理・包埋カセット	Crystalgen	CG-M492