シンプルな攪拌槽を用いたアルギン酸ビーズにおける哺乳類細胞のカプセル化

サマリー

このビデオと原稿は、簡単な撹拌容器を用いて大きなバッチで製造することができるアルギン酸ビーズ0.5％〜10％の哺乳動物細胞をカプセル化するエマルジョンベースの方法を記載しています。カプセル化された細胞は、インビトロで培養され得るか、または細胞治療用途のために移植され得る。

要約

アルギン酸ビーズにおける細胞のカプセル化は、インビトロでの固定培養およびインビボでの免疫隔離のために用いられてきた。膵島のカプセル化は、同種異系移植または異種移植における膵島生存を増加させる手段として広範囲に研究されている。アルギン酸塩カプセル化は、一般に、ノズル押出および外部ゲル化によって達成される。この方法を使用して、ノズルの先端に形成された細胞含有アルギン酸液滴は、液滴中に拡散する際にイオン性アルギン酸ゲル化を引き起こす二価カチオンを含む溶液に落ちる。ノズルチップにおける液滴形成の要件は、達成可能な容積スループットおよびアルギン酸塩濃度を制限する。このビデオでは、哺乳類の細胞を70％〜90％の細胞生存率で0.5％〜10％のアルギン酸塩にカプセル化するスケーラブルな乳化方法について説明します。この代替の方法により、細胞および炭酸カルシウムを含有するアルギネート液滴を鉱油中で乳化し、内部カルシウム放出およびイオノトロピックアルギン酸塩ゲル化をもたらすpHの低下によって低下した。現在の方法は、乳化の20分以内にアルギン酸ビーズの生成を可能にする。カプセル化工程に必要とされる装置は、大部分の実験室で利用可能な単純攪拌容器からなる。

概要

哺乳動物細胞のカプセル化は、免疫拒絶¹から移植された細胞を保護する手段として、または固定化された細胞培養のための三次元支持体を提供するための手段として広く研究されている^2,3,4 。アルギン酸ビーズ中の膵島封入は、同種異系の^5,6または異種7,8,9,10,11,12齧歯類における糖尿病を逆転させるために使用されている。 1型糖尿病を治療するためのカプセル化された膵島移植の前臨床試験および臨床試験が進行中である13,14,15。移植用途またはより大きいスケールのためにインビトロで固定化された細胞生産では、ノズルベースのビーズ発生器が一般に使用される。典型的には、アルギン酸塩と細胞との混合物をノズルを通してポンプ輸送して、二価カチオンを含有する攪拌溶液に落ちる液滴を形成し、液滴の外部ゲル化をもたらす。同軸ガス流^16,17 、ノズル振動¹⁸ 、静電反発力¹⁹または回転ワイヤ²⁰は、ノズル先端での液滴形成を容易にする。

従来のビーズ発生器の主な欠点は、スループットが限られていることと、十分なビード形成をもたらす溶液粘度の限定された範囲であることである²¹ 。高い流速では、ノズルを出る流体は、ノズル直径よりも小さい液滴に砕かれ、サイズ制御を減少させる。スループットを向上させるためにマルチノズルビードジェネレータを使用できますが、ノズル間の流れの均一な分布と溶液> 0.2 Pasの使用は問題である²² 。最後に、使用されるノズルの直径が100μmと500μmの間であり、人間の島の〜15％が200μmより大きくてもよいため、ノズルベースのデバイスのすべてが島にいくらかの損傷を与えると予想される。

このビデオでは、1滴ずつではなく、1回の乳化ステップで液滴を形成することによって、哺乳動物細胞をカプセル化する別の方法について説明します。ビーズ製造は単純な撹拌容器で行われるため、この方法は、設備コストが低くても、小（〜1mL）から大規模（10 3L範囲）のビーズ製造に適しています。この方法は、ビーズ生成時間が短い（ 例えば、 20分間）広範囲のアルギン酸塩粘度を用いて、高い球形度を有するビーズの製造を可能にする。この方法はもともとPoncelet et all。 ^{DNA27 、}インスリン²⁹を含むタンパク質²⁸ 、および細菌³⁰を固定化するために使用された。私たちは、最近、これらの方法を、膵β細胞株^31,32および一次膵臓組織³²を用いた哺乳動物細胞のカプセル化に適用した。

この方法の原理は、鉱油中のアルギネート液滴からなる油中水型エマルジョンを生成し、続いてアルギン酸塩液滴を内部でゲル化させることである（ 図1 ）。最初に、封入剤（ 例えば、細胞）を、初期プロセスpHにおいて低い溶解度を有する微粒子カルシウム塩を含有するアルギン酸塩溶液に分散させる。次いで、アルギン酸塩混合物を撹拌した有機相に添加して、通常は界面活性剤。哺乳類細胞のカプセル化の場合、血清中に存在する成分は界面活性剤として作用することができる。次に、水相に分配する油溶性酸を添加することによってカルシウム塩を可溶化するためにpHを低下させる。鉱物油/水分配係数<0.005〜33を有する酢酸は、油中に予め溶解され、次いで乳濁液に添加され、油相中で混合され、水相^34に急速に分配される。 図2は、酸性化および内部ゲル化工程中に起こる化学反応および拡散を示す。最後に、カプセル化された細胞は、転相、遠心分離によって加速された相分離、繰り返し洗浄工程および濾過によって回収される。次いで、これらの工程の後に、品質管理分析、 インビトロ細胞培養および/またはカプセル化細胞の移植のためのビーズおよび細胞サンプリングを行うことができる。

図1：哺乳動物細胞をカプセル化するための乳化に基づくプロセスの概略図。ビーズは、鉱油中のアルギン酸塩、細胞およびCaCO ₃混合物を乳化させることによって（酢酸塩を添加することにより内部ゲル化を誘発する（工程3））、最初に製造される（工程1および工程2）。次いで、ゲル反転ビーズを水性緩衝液を添加して転相（工程4）、次に遠心分離および油吸引（工程5）、次いで濾過（工程6）を加えることにより、油から分離する。最後に、フィルター上に集められたビーズは、インビトロ培養または移植のために細胞培養培地に移される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

図2：内部ゲル化中に起こる反応および拡散ステップ。 （1）酢酸を有機相に添加し、対流によってアルギン酸塩小滴に輸送する。 （2）酢酸が水相に分配される。 （3）水の存在下では、酸が解離して拡散して濃青色のCaCO ₃粒子に達する。 （4）H ⁺イオンはCaCO ₃中のCa ²⁺イオンと交換され、Ca ²⁺イオンを放出する。 （5）カルシウムイオンは、未反応アルギン酸塩に遭遇するまで拡散し、アルギン酸鎖のイオン化架橋をもたらす。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。

従来のノズルベースの細胞カプセル化装置とは対照的に、広いビーズサイズ分布が達成される攪拌乳化における液滴形成のメカニズムのために、このプロセスから生じる。アプリケーションのサブセットでは、このビードサイズの分布に問題がある可能性があります。例えば、細胞のより大きな部分が、より小さいビーズのビーズ表面に露出され得る。栄養素（ 例えば酸素）の制限が懸念される場合、これらの制限は、より大きなビーズで悪化する可能性がある。撹拌乳化法の利点は、平均ビーズサイズが、乳化工程の間の撹拌速度を変えることによって容易に調節できることである。広範なビーズサイズ分布は、カプセル化された細胞性能に対するビーズサイズの影響を研究するために利用することもできる。

乳化および内部ゲル化による哺乳動物細胞のカプセル化は、ビーズ発生器を備えていない研究室にとって興味深い代替物である。さらに、この方法は、処理時間を短縮するか、非常に低いまたは非常に高いアルギネート濃度でビーズを生成するという選択肢をユーザに与えるations。

10mMの4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）緩衝液中で調製した10.5mLの5％アルギン酸溶液中に細胞をカプセル化する方法を下記に概説する。アルギン酸塩は、移植グレードLVM（低粘度高マンヌロン酸含量）およびMVG（中粘度高グルロン酸含量）アルギン酸塩の50:50混合物からなる。物理的架橋剤として、最終濃度24mMの炭酸カルシウムを使用する。軽質鉱物油は有機相を構成し、酢酸はエマルジョンを酸性化し、内部ゲル化を誘発するために使用される。しかしながら、選択されるアルギン酸塩の種類および組成、ならびにプロセス緩衝液は、所望の用途^32に依存する。このプロトコールを用いて様々なアルギネート型（表の表を参照）を使用してビーズを作製した。

プロトコル

アルギネート溶液、CaCO ₃懸濁液および酸性化された油を調製する

1. プロセスバッファーと培地を準備する。
   1. 10 mM HEPES、170 mM NaClを使用して高濃度アルギン酸ビーズを生成するために使用される典型的なプロセスバッファーを調製します。 pHを7.4に調整する。
   2. 10％ウシ胎仔血清（FBS）、6mMグルタミン、100U / mLペニシリンおよび100mg / mLストレプトマイシンを含むダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）を用いて典型的な培地を調製する。
2. ビーズ中の最終所望濃度の1.17倍でアルギン酸ストック溶液を調製する。
   1. まず、適切な量のアルギン酸塩粉末を計量する。例えば、50:50のLVMおよびMVGアルギン酸塩を含む5％アルギネートの最終濃度を得るために、0.583gのLVMアルギネート粉末および0.583gのMVGアルギネート粉末を合わせることによって、合計1.17gのアルギン酸ナトリウムを計量する。
   2. 20 mLのプロセスバッファをautoc磁気攪拌プレート上でガラス張りガラス容器に入れ、約200rpmで攪拌する。溶液にアルギン酸ナトリウム粉末を徐々に加える。
   3. 溶液を一晩低速で撹拌したままにします。必要に応じて、フラスコを攪拌プレートに固定します。
   4. 溶液が完全に溶解していない場合は、ボトルを回転ミキサーに固定し、さらに24時間37℃で混合を続けます。
   5. 半分以下の容量の容器で30分間溶液をオートクレーブすることによりアルギン酸塩溶液を滅菌する。溶液を回収する前に、温度を60℃以下に下げてください。
   6. 必要に応じて、室温に達する前にオートクレーブ直後にアルギン酸溶液をろ過することにより粒子を除去するが、粘度は十分に低いままである。
3. 内部ゲル化のための最終的な所望の濃度の21倍で炭酸カルシウム懸濁液を調製する。
   1. CaCO ₃粉末を秤量する。たとえば、広告d 1 g CaCO ₃を20 mLプロセス緩衝液に添加して、最終ゲル化剤濃度として24 mM CaCO ₃を得る。
   2. CaCO ₃懸濁液を30分間オートクレーブ処理する。
      注：CaCO ₃濃度は、重炭酸塩-CO ₂平衡のために経時的に変化する。同じストックCaCO ₃サスペンションを10回以上のカプセル化手順に使用することは避けてください。
4. 乳化プロセスのために使用された撹拌容器をオートクレーブする。使用する前に、スピナーフラスコ内に残っ​​ている凝結水の痕跡を取り除いてください。
5. 乳化プロセスの直前に、酸性化油を調製する。 50mLコニカルチューブに入れた11mLの鉱油あたり44μLの酢酸を溶解する。
   注記：一般的な間違いは、酢酸の溶解が不完全であることです。少量の酢酸をピペッティングすることを避け、ボルテックスを繰り返して酢酸が完全に油に溶解するようにしてください。
   注意：酢酸は有毒であり、揮発性酸。この試薬はフュームフードの下で取り扱い、乳化ステップまで酢酸/油溶液を密閉容器に入れてください。詳細については、この試薬に関するMSDSの情報を参照してください。
6. 細胞のカプセル化に進む前に、すべての溶液が室温に達するようにしてください。

2.乳化および内部ゲル化によるアルギン酸ビーズの生成

1. スピンナーフラスコに軽い鉱物油10 mLを入れ、低回転速度（ 例：このビデオで使用したスピナーフラスコの場合は250 rpm）で攪拌を開始します。
2. プロセスに使用される細胞が接着性培養由来である場合、細胞を懸濁させるためにトリプシンを適用する。 FBS含有培地またはトリプシンインヒビターを添加して反応を終了させ、細胞計数のためのサンプルを収集する。
   1. トリパンブルー染色後の細胞濃度および生存率を、前述したように、血球計または自動セルカウンターを用いて決定するass = "xref"> 32。
3. 細胞を300xgで7分間遠心分離し、細胞固定化のために所望の培地で1回それらを洗浄する。この培地にFBSやウシ血清アルブミン（BSA）などの乳化剤が含まれていることを確認してください。たとえば、10％FBSを含むDMEMを使用します。
4. ビーズ中の所望の最終濃度の10.5倍を得るために、同じ培地中で細胞ペレットを再懸濁する。
5. 9.9mLのアルギン酸溶液に1.1mLの10.5倍濃縮細胞ストックを加える。次に、550μLのCaCO ₃懸濁液を添加し、CaCO _3の均一な分布を確実にするために滅菌スパチュラを用いて攪拌することによって混合する。
6. 直ちに、アルギン酸塩、細胞およびCaCO ₃混合物10.5mLをシリンジを用いて撹拌油に移す。
   注意：粘性の高い溶液の場合、気泡を避けるために非常にゆっくりと混合物を吸引して排出してください。ある場合には、混合物をフラスコに添加しながら撹拌を停止してアルギン酸塩の羽根車軸への同伴。
7. アルギン酸塩、細胞およびCaCO ₃混合物を油に添加した直後に、撹拌速度を増加させる。
   注：ここで使用した5％LVM：MVGアルギン酸塩については、1025rpmの回転速度を適用して、in vitro培養に適した約900μmのビーズを生成させた³⁵ 。以前の刊行物25,32に記載されているように、より高い回転速度およびより低いアルギン酸塩濃度は、平均ビーズ直径を低下させる。インペラーおよび血管の幾何学的形状のわずかな変化、ならびにアルギン酸塩の特性は、平均ビーズ直径に大きく影響し得る。血管構成またはアルギン酸塩ロットの各変化について、表面積モーメント平均ビーズ直径と回転速度とを関連付ける標準曲線を生成する必要がある³² 。
8. タイマーをスタートさせ、アルギン酸塩を12分間乳化する。
9. 10mLのtエマルジョンを酸性化し、CaCO ₃を溶解させ、したがってアルギン酸塩をゲル化したビーズに物理的に架橋させる。この酸性化工程では8分を要する。

ビーズの回復

1. 撹拌速度を400 rpmに下げる。 10％培地と混合したプロセス緩衝液40mLを添加してpHを上昇させ、転相を起こさせる。
2. 1分後に攪拌を停止し、混合物を50mLの遠心管に移す。スピナーフラスコをさらに20mLの培地ですすぎ、これをチューブに加える。ビーズと油相との接触を最小限にするために、油相を吸引する前にスピナーフラスコからできるだけ多くの水相を吸引する。
   注：ビーズの損傷を避けるために、この段階で大口径ピペット（ 例： 25 mLピペット）を使用してください。小容量の場合、ビーズ懸濁液を切断ピペットチップで操作することもできます。このようなヒントを得るには、ハサミでピペットチップの端を切る眼の保護具を着用してください。
3. ビーズの沈降および相分離を加速するために、チューブを630xgで3分間遠心分離する。
4. パスツールピペットで吸引して油分と過剰の水溶液を除去する。
5. ビーズを培地で少なくとも1回洗浄する。ビーズ懸濁液を40μmナイロンセルストレーナーで濾過し、ビーズに付随する余分な液体をストレーナーの下から吸引する。滅菌スパチュラを使用してビーズを既知量の培地に移す。
   注：目標最小ビーズ径に応じて、この段階でより小さいまたはより大きい孔径のフィルターを使用することができます。しかし、ビーズの損傷を避けるために、サブミクロンの孔サイズのフィルターによる圧力駆動による濾過ではなく、重力濾過が推奨されます。
6. ビーズの容量を容積変位（ビーズ添加後の容量からビーズを添加する前の容量から引いた量）で測定し、媒体を上にして、所望のビーズ：全容量比（典型的には1：5）またはビーズ培地4mL。この時点から、大きなビアピペットを使用してビーズを損傷しないようにしてください。
7. インビトロ培養または移植実験のために 、カプセル化された細胞をTフラスコに移す。

4.品質管理とアプリケーション

注：カプセル化された細胞およびビーズの品質を確実にするために、ビーズサイズ分布およびプロセス後の細胞生存を定量化する必要があります。さらなる分析のためにビーズ内から細胞を回収するためにゲルを逆転させるのが一般的に行われる。

1. ビーズサイズ分布を評価するために、ビーズをトルイジンブルーOで染色する。
   1. 10％完全培地を含む4mLのプロセス緩衝液に0.5mLのビーズを入れる。
   2. プロセスバッファーで調製した1 g / Lトルイジンブルー溶液500μLを加えます。
   3. 50rpmの回転シェーカー上のコニカルチューブ中で60分間インキュベートする。
   4. 10％完全培地を含有する5mLのプロセス緩衝液を添加し、ビーズおよび溶液をペトリ皿に移し、低倍率顕微鏡または手持ち式デジタルカメラを用いて画像を取得する。必要に応じて、ライトボックスにペトリ皿を置き、手持ち式のカメラで画像を取得してコントラストを向上させ、影を避けます。
   5. 前述の^32のように、例えば画像解析フリーウェア³⁶を使用して、ビーズサイズ分布を定量化するために画像解析を行う。
2. 細胞生存を定性的に評価するために、エチジウムホモダイマーを用いて細胞を染色し、死細胞およびカルセインAMを同定して生細胞を同定する。
   1. 10容量％の完全培地を含む4容量のプロセス緩衝液に1容量のビーズを加える。
   2. 適切な量​​のカルセインAMおよびエチジウムホモダイマー原液を加えて、それぞれ4μMおよび2μMの濃度を得る。いくつかのビーズサンプルに試薬の1つだけを加えることによって、単一染色コントロールを生成します。
   3. ビーズを氷上で20分間インキュベートする。
   4. ビーズの圧縮を避けるために、Oリングなどのスペーサーを使用してスライドとカバーガラスの間に溶液を置きます。
   5. 蛍光顕微鏡に進む。蛍光ブリースルーを評価するために、単一の染色コントロールを使用します。カルセインAM（494/517 nm）およびDNAに結合したエチジウムホモダイマー（528/617 nm）に関連する励起/発光波長に基づいて、適切な蛍光フィルターを選択する。
3. さらなる分析のためにビーズから細胞を回収するために、クエン酸塩または別のキレート化溶液を用いてアルギン酸塩を脱気する。
   1. pH7.4で55mMのクエン酸塩、10mMのHEPESおよび95mMのNaClを含有する脱ゲル溶液を調製する。
   2. この溶液を10％培地と混合し、次いで混合物9mLにアルギン酸ビーズ1mLを加える。
   3. ビーズを75rpmで20分間氷上で脱ゲルする。
      注：細胞は、分析のために使用することができ、またはアルギネート溶菌液から取り出すことができますイオンを遠心分離により除去する。例えば、脱泡後の細胞生存率は、トリパンブルー染色によって定量することができる。あるいは、細胞を遠心分離し、洗浄し、続いてmRNA、DNAおよび/またはタンパク質のサンプリングおよび分析を行うことができる。

結果

乳化および内部ゲル化プロセスの終わりに、最初のアルギネートおよび細胞混合物の体積と同様のビーズ容量を回収する必要がある。ビーズは非常に球状であり、欠陥はほとんどありません（ 図3 ）。ビーズは、大口径ピペットを介したピペッティングに耐えるほど十分に強くなければなりません。高いアルギン酸塩濃度では、カプセル化された油または空気小滴がビーズ中に観察され得る。これは、乳化段階（油/水/油の二重乳濁液）中のアルギン酸塩小滴への油の捕捉のために起こりそうである。本発明者らの手では、これらのビーズはビーズ体積の小さい部分（<5％）を表し、これらのビーズの大部分は、その低い密度のためにビーズ回収段階の間に油を吸引しながら除去された。

ディスカッション

内部ゲル化反応中の様々なステップ（ 図2に図示）は、全体的な反応速度を制限する可能性がある。 〜2.5μmより大きい炭酸カルシウムの場合、炭酸塩の溶解速度は速度制限26,44であることが示されている。内部のカルシウム放出をもたらす酸性化段階もまた、細胞生存に影響を及ぼす重要なプロセス変数であることが示されている³² 。したがって、内部ゲル化をもたらす条件は、ビーズ品質および細胞生存の両方にとって決定的に重要である。ビーズの最終用途に応じて、異なる最適プロセス条件を選択することができる。例えば、ビーズの長期安定性が重要である移植用途には、より高いpH低下（ 例えば 、アルギン酸塩溶液を緩衝するための10mM HEPESの使用）が望ましいことがある。一方、より低いpHの低下（ 例えば 、60mMのMOPSを用いてバフアルギン酸塩溶液）は、インビトロの用途には好ましい可能性がある。

酸性化のレベルおよび持続時間を調整することに加えて、他のプロセス改変も想...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
<ストロング>試薬および消耗品
LVMアルギン酸塩(移植グレード)	ノバマトリックス	適用不可	結果では「アルギン酸塩#1」と呼ばれています。
MVGアルギン酸塩(移植グレード)	Novamatrix	適用不可	結果では「アルギン酸塩#2」と呼ばれています。
アルギン酸塩(細胞培養グレード)	Sigma	A0682(低粘度)またはA2033(中粘度)	A2033は、結果では「アルギン酸塩#3」と呼ばれています。
DMEM	Life Technologies	11995-065
ウシ胎児血清、特徴付け、カナダ原産	サーモフィッシャーサイエンティフィック	SH3039603
グルタミン	Life Technologies	25030
ペニシリンおよびストレプトマイシン	Sigma	P4333-100ML
HEPES、細胞培養試験	済み Sigma	H4034-100G
NaCl	サーモフィッシャーサイエンティフィック	S271-1
細粒CaCO3	Avantor Materials	1301-01	CaCO3懸濁液を調製した後、超音波処理して1ヶ月以内に使用してください。
軽鉱物油	サーモフィッシャーサイエンティフィック	O121-4	滅菌フィルターを0.22 μ使用前にM孔径の膜。
氷酢酸	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A38-500	取り扱いには注意が必要です:MSDSを参照してください。
滅菌ヘラ	シグマ	CLS3004-100EA
滅菌ナイロンセルストレーナー、40 & マイクロ;m	サーモフィッシャーサイエンティフィック	08-771-1
血清ピペット (2 mL、5 mL、10 mL、25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
パスツールピペット	VWR	14673-043
トルイジン Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mLマイクロキャリアスピナーフラスコ	Bellco	1965-00100	最近のモデルのインペラ構成は、適切な乳化には適していない可能性があります。フラスコの底から0.5cmまでオイルをスイープできるブレードは、テフロンシートからカスタムメイドできます。
速度調整可能な磁気攪拌板	Bellco	7760-06005	回転速度は、使用前に校正する必要があります(例:タコメーターを使用)。
セルカウンター	Innovatis	Cedex AS20	このシステムは、ロシュ社から販売されています。この自動セルカウンターは、血球計算盤を使用したトリパンブルー染色後の手動細胞列挙に置き換えることもできます。
LEDライトボックス	Artograph	LightPad®長所	このアイテムは、他のタイプのイルミネーターと交換できます。
ハンドヘルドカメラ	Canon	PowerShot A590 IS	さまざまなハンドヘルドカメラを使用して、トルイジンブルー-oの染色ビーズ画像をキャプチャできます。画像を取得する前に、ビーズが入ったペトリ皿の隣に定規を配置する必要があります。
位相差と適切な蛍光フィルターを備えた蛍光顕微鏡	オリンパス	IX81	ビーズのイメージングには、いくつかの顕微鏡システムを使用しました。ここに示す結果は、GFPおよびTRITC蛍光フィルターを装備したIX81顕微鏡で得られたものです。ビーズ全体を捕捉するために、攪拌速度に応じて4倍から20倍の対物レンズを使用しました。生/死染色画像は、通常、20倍から40倍の対物レンズで撮影されました。
画像取得ソフトウェア	Molecular Devices	Metamorph	差や蛍光画像を取得するために、様々な画像取得ソフトウェアを利用することができます。
画像解析フリーウェア	CellProfiler	該当なし	をオブジェクトとして識別し、ビーズサイズを解析するために、さまざまな画像解析ソフトウェア(ImageJなど)を使用することができます。