方法論記事

新規の表面マーカーの組み合わせで識別離および肝前駆サブセットの濃縮

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DOI：

10.3791/55284

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2017年2月18日

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1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

この記事について

サマリー

肝臓損傷は、不均一な細胞集団を表し、前駆細胞の増殖を伴います。この細胞区画の新規分類は、複数のサブセットの区別を可能にします。ここで説明する方法は、分析し、さらなるアッセイのために使用することができる種々のサブセットの高純度分離、フローサイトメトリーを示します。

要約

慢性肝臓傷害の間、前駆細胞は、炎症性細胞浸潤および上皮細胞の活性化の出現を伴う小管反応と呼ばれるプロセスで展開します。そのような炎症反応中に前駆細胞集団は、大部分の組織学的分析によって、またはフローサイトメトリーベースの技術のいずれかによって、単一の表面マーカーを使用して研究されています。しかしながら、新規な表面マーカーは、細胞コンパートメント幹/肝前駆細胞内の種々の機能的に異なるサブセットを同定しました。ここで紹介する方法は、新規の表面マーカーの組み合わせを使用して、前駆細胞サブセットの分析サイトメトリー分離と詳細な流れを説明しています。また、種々の前駆細胞のサブセットは、自動磁気及びFACSソーティングに基づく方法を用いて高純度で単離することができる方法を示します。重要なことは、小説や肝臓の単純化された酵素的解離は高い生存率これらの希少な細胞集団の単離を可能にしますそれは、他の既存の方法に比べて優れています。これは、さらに、インビトロで前駆細胞を研究するため、または遺伝子発現プロファイルを分析するために、高品質のRNAを単離するために特に適切です。

概要

肝臓再生は、主に肝細胞の自己再生能と関連しています。それにもかかわらず、慢性肝損傷は、肝細胞及び胆管1、2、3、4に分化する能力と関連している前駆細胞の活性化および拡大で起こります。慢性傷害の間、肝細胞増殖が有効でない場合、これは特に重要です。前駆細胞を標的とする多数の遺伝的追跡研究にもかかわらず、肝臓再生におけるそれらの役割は、5、6、7、8議論の余地。また、前駆細胞の活性化は、負傷9の間にそれらの正確な役割について疑問を提起肝臓で増加した線維化反応、にリンクされています、10。

前駆細胞コンパートメントの不均一な性質は、長い顕微解剖または細胞選別に基づく方法1、11を使用して単一の表面マーカーを発現する前駆細胞を単離し、遺伝子発現研究によって示唆されています。実際、最近、GP38（ポドプラニン）を使用して、新規な表面マーカーの組み合わせは明確種々のサブセット12に前駆細胞の前の単一のマーカーを結合されました。重要なことは、これらのサブセットは、それらの表面マーカー発現が異なるだけでなく、怪我12の間に機能的変化を示しただけではなく。

多数の動物モデルは、前駆細胞の活性化及び肝再生を研究するために利用されています。様々な損傷の種類は、前駆細胞12の異なるサブセットの活性化を促進すると思われます。これは、pHを説明するかもしれません人間4で観察された小管反応のenotypic発散。このように、前駆細胞の複雑な表現型および機能解析は、怪我や肝疾患における小管反応の真の意義における役割を理解することが極めて重要です。

表面マーカーの組み合わせの他に、細胞単離プロトコールにおける重要な違いは、さらに、以前の研究2に基づいて結論を複雑にします。研究のかなりの量が大きく、それらの単離プロトコルが異なる前駆細胞（ 例えば、肝臓解離（酵素の組み合わせと処理の持続時間）、密度媒体、及び遠心分離スピード）の役割に対処2。希少な細胞集団とサブセットの組成物の反射のためのより良い生存可能性を提供する最適化された分離技術は、開発され、最近12公開されています。この記事の目的は、より多くのDETを提供することです技術の適切な再現を可能にするために、この肝細胞の単離手順およびサブセット解析のプロトコルをailed。さらに、プロトコルは、新しいプロトコルと比較して違いを示すために、以前の分離法との比較を含んでいます。

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プロトコル

全ての実験手順は、ホンブルク大学医療センターの倫理や動物管理委員会の承認を得て行きました。

材料およびバッファの作製

  1. たての細菌汚染を避けるために、無菌のコンポーネントと層流フードを使用して、肝臓の消化のために必要なすべてのバッファを準備します。
  2. 1％（v / v）の溶液を達成するために、RPMI培地49.5 mLおよびウシ胎児血清（低エンドトキシン、熱不活性化FBS）を0.5mLを混合することにより収集バッファ（CB）を準備します。さらに使用するまで氷上でソリューションを保存してください。
    注：CBの約25mLのは、一つ肝臓全体を消化することが必要です。
  3. RPMI培地、1％（v / v）のFBS（低エンドトキシン、熱不活化）、コラゲナーゼP（0.2 mg / mlで）、DNアーゼI（0.1 mg / mlで）以下の成分を使用して消化緩衝液（DB）の調製、およびディスパーゼ（0.8 mg / mlで）。
    注：DBの約25mLのは、一つ肝臓全体を消化することが必要です。トンで事前暖かいDB使用前に彼は、37℃の水浴。
  4. またはDNアーゼI緩衝液中、ハンクス平衡塩溶液（collagense PとディスパーゼHBSS）に到着時に酵素を再構成する（50％（v / v）のグリセロール、1mMのMgCl 2、および20mMトリス-HCl、pH7.5）で、それを分注し、-20℃で保管してください。 4℃でのDNase-Iバッファを保存し、2カ月以内にそれを使用。

肝臓単一細胞懸濁液の調製

  1. 地元の倫理や動物管理委員会に合わせて頸椎脱臼により未処理の野生型マウスを安楽死させます。
  2. 解剖ボード上にマウスを置き、70％エタノールで毛皮を濡らします。はさみを使用して、手足に向かってY-切開に続いて皮膚の正中切開で腹部を開きます。はさみを使用して胸骨に腹膜を開きます。肝臓を明らかにするために、綿棒を使用して、右側に優しく腸を移動さ。
  3. はさみや鉗子の助けを借りて、肝葉を削除し、背後に胆嚢を残し、および結合組織による汚染を避けます。肝臓を計量し、HBSSを含むペトリ皿に氷の上に置きます。
  4. 乾燥ペトリ皿上の肝葉を置き、メスを使用することにより、均質な立方体に約2ミリメートル側を肝組織を切断。 15-mLコニカル遠心管に駒を転送します。
  5. 肝臓片を含む15 mLのコニカル遠心管にDBの2.5 mLを加え、消化プロセスを開始するために37℃の水浴に入れ（健康な肝臓は60~70分かかり、硬変した肝臓は、80〜90分を要します）。
    注：ある全肝臓は消化されている場合、肝臓は、良好な細胞生存率を確保するために、2つの15 mLのコニカル遠心管に分離されるべきです。
  6. 放出された肝臓細胞を収集するために、新しい15 mLコニカル遠心チューブを準備します。チューブの上にポリアミド100μmのフィルターメッシュを配置し、CBの800μLとメッシュを濡らします。氷上のコニカル遠心チューブを置きます。
  7. SAMを混ぜますples肝臓片を含む15 mLのコニカル遠心管を振盪することによって、消化プロセスをサポートするために、5及び10分後に37℃の水浴です。
  8. 消化開始後15分で、静かに肝臓片を容易に通過することができますカットの先端で1,000μLピペットを用いて、肝臓片を混ぜます。バックウォーターバスにチューブを置き、作品は2分間沈降することを可能にします。
  9. （典型的には、700μL2倍）播種性細胞を含有する上清を除去し、ステップ2.6で調製したチューブに追加します。 DB（2×700μL）で削除された上清を交換し、戻って37℃の水浴中に入れてください。
  10. 約60〜70分は消化の開始以来経過するまで（典型的には30、40、50、55、および60分で）ステップ2.8で説明した手順を繰り返します。以降40分からは、残りの肝臓片をノーカット1,000μLピペットチップを通過するのに十分小さくなければなりません。
    注：健康な肝臓はDIGEです線維性肝臓は通常、80〜90分を必要としながら、60〜70分以内に完全にSTED。この時点では、肝臓組織は、肝臓片を含む円錐形の15-mL遠心管に見えてはならない、とすべて放出された細胞は、ステップ2.6で作製したチューブに転送する必要があります。
  11. 消化プロセスの最後に、細胞を回収し、180×gで8分間4°Cのためにそれらを遠心分離（使用して還元加速/ 4及び減速/ 2）。
  12. 赤血球を溶解するために塩化アンモニウム - カリウム（ACK）溶解緩衝液1mlに細胞ペレットを再懸濁し、室温で1分間それをインキュベートします。 CBの5ミリリットルを加えて反応を停止し、180×gで4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）で8分間、細胞を遠心してください。 CBの4 mL中に細胞を再懸濁し、氷上で保管してください。ステップ3で説明したように、細胞をカウントします。
    注：細胞ペレットが緩んでいるため、上清をデカントしているのではなく、離れてピペットで。

フローサイトメトリーを用いた細胞数の3決意

注：細胞数を決定するために、自動細胞カウンターまたは、理想的には、以下に説明するフローサイトメトリーに基づく細胞の定量化は、代わりに、古典的ノイバウアー室ベースの方法を提案しています。ステップ2で説明した肝臓単一細胞懸濁液を大幅に異なるサイズや粒度で実質および非実質細胞（NPC）が含まれています。フローサイトメトリーを用いたNPCのゲーティングオン前方散乱、側方散乱（FSC-SSC）特性と共に、細胞破片の適切な除外が記載されているプロトコル12の成功を保証します。

  1. 肝細胞懸濁液（20μL）のアリコートを準備し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の174μLとヨウ化プロピジウムの6μL（PI;最終濃度0.375μgの/ ml）を追加します。細胞の定量化を可能にカウントビーズを追加します。
  2. S上のゲート破片を回避し、さらにFSC-HとFCS-Aを使用してダブレットを除外するには、SC-A-FSC-A。
    注：これは、 図2に示したゲート戦略に従うことが重要です。
  3. ゲートアウトPI陽性の死細胞は、あなたのサンプルから30μLを測定し、イベントを記録します。細胞数を計算するために、メーカーのガイドラインに従ってください。
    注：フローサイトメトリー測定のための手順4に従い、磁気ベースの前駆細胞の単離のために5と6ステップ、及び前駆亜集団のフローサイトメトリーのソートに7を繰り返します。

前駆サブセットのFOWサイトメトリー分析のために肝臓の単一細胞懸濁液の4染色

抗体 クローン ホスト/アイソタイプ ストック濃度[mg / mlで] 希釈
CD64 X54-5 / 7.1 マウスのIgG1、κ 0.5 1：100
CD16 / 32 93 ラットIgG2aで、λ 0.5 1：100
CD45 30-F11 ラットのIgG2b、κ 0.2 1：200
CD31 MEC13.3 ラットIgG2aで、κ 0.5 1：200
ASGPR1 ポリクローナルヤギのIgG 0.2 1：100
ポドプラニン 2001年1月8日シリアのハムスターのIgG 0.2 1：1400
ポドプラニン 2001年1月8日シリアのハムスターのIgG 0.5 1：1400
CD133 Mb9-3G8 ラットIgG1 0.03 3μL
CD133 315-2C11 ラットIgG2A、λ 0.5 1：100
CD34 RAM34 ラットIgG2aで、κ 0.5 1：100
CD90.2 53-2,1 ラットのIgG2、κ 0.5 1：800
CD157 BP-3 マウスのIgG2b、κ 0.2 1：600
EpCAMの G8.8 ラットIgG2aで、κ 0.2 1：100
SCA-1 D7 ラットIgG2aで、κ 0.03 10μL
マウスのIgG2b、κ MPC-11 0.2
ラットIgG1 RTK2071 0.2
ラットのIgG2b、κ RTK4530 0.2
ラットIgG2aで、κ RTK2758 0.5
ラットIgG2aで、κ RTK2758 0.2
シリアのハムスターのIgG SHG-1 0.2
シリアのハムスターのIgG SHG-1 0.5
正常ヤギIgGをコントロールポリクローナルヤギのIgG 1
ロバ抗ヤギIgG ロバのIgG 2 1：800
ストレプトアビジン 1 1：400

表1。

抗体 1 2 3 4 5
CD45 APC / Cy7のラットのIgG2b、κ
0.5μL 		+ + + +
CD31ビオチン + ラットIgG2aで、κ
0.5μL 		+ + +
ASGPR1精製 + + 正常ヤギIgGをコントロール
0.2μL 		+ +
ポドプラニンAPC + + + シリアのハムスターのIgG
1時14希釈の1μL 		+
CD133 PE + + + + ラットIgG1
0.45μL
ロバ抗ヤギ
アレクサフルオロ488 		+ + + + +
ストレプトアビジン
アレクサフルオロ405 		+ + + + +

表2。

  1. ステップ3で説明したように決定し、2.5×10 5個の細胞を含む反応チューブ（1.5 mL）にステップ2.11から細胞懸濁液のアリコートを置きます。
  2. 遠心機微量を使用して、300×gで、4℃で3分間細胞。
    注：この時点で、真空ポンプは、慎重に上清を除去するために利用することができます。
  3. Fcをブロックミックスに細胞ペレットを再懸濁し、氷上で5分間静置します。染みあたり50μLの総容量を有するFc-ブロックミックスを調製します。 1を追加します。FcRブロッキング試薬の0μL、精製した抗CD64の1μL（1：100; 0.5μgの/染色）、および染色緩衝液の40μL（STバッファ：HBSS、1％（v / v）のFBS、および0.01％染色あたりアジ化ナトリウム）。
    注：アジ化ナトリウムは、非常に有毒です。ニトリル手袋、白衣、およびフェイスマスクとして、適切な個人保護具を使用します。
  4. 細胞にミックスを染色の50μLを追加します（セルの合計容量は現在100μLである）、および抗体混合物を有する細胞、光から保護し、氷上で20分間インキュベートします。
  5. 染みあたり50μLの総容量を有する抗体ミックスを調製します。 STバッファー50μLのために、基本的な染色のために、以下のコンジュゲート抗体を追加：CD45（0.5μL; 1：200; 0.1μgの/染色）、CD31（0.5μL; 1：200; 0.25μgの/染色）、ASGPR1（1μLを; 1：100; 0.2μgの/染色）、ポドプラニン（1午前1時14希釈のμL; 1：1400のエンド希釈; 0.014μgの/染色）、およびCD133（3μL; 0.09μgの/染色）。
    注： 表1は、基本的な汚れのためにと様々なサブセットの追加の表面マーカーのために利用する抗体クローンおよび希釈液をまとめました。 表2に示すように、対応するアイソタイプコントロールおよび/または蛍光マイナス1のコントロール（のFMO）を含む抗体混合物のための余分な細胞懸濁液を準備します。
  6. 300×gで4分間、細胞を各試料および遠心分離機にSTバッファの400μLを加え、4°C.Discardに上清をし、ロバ抗ヤギIgGの0.125μL（1を含む二次抗体混合物の100μLで細胞を再懸濁： 800; 0.25μgの/染色）、蛍光結合ストレプトアビジンの0.25μL（1：400; 0.25μgの/染色）のST緩衝液100μLインチ
  7. 光から、氷上で20分間、抗体混合物で保護しながら、細胞をインキュベートします。各サンプルにSTバッファの400μLを加え、300×gで4分間、細胞を遠心分離し、4°C。上清を捨て、STバフの300μLで細胞を再懸濁ERを0.25μg/ mLのPIを含みます。
    注：前駆細胞の細胞生存率は時間とともに減少します。したがって、できるだけ早く新鮮なサンプルを測定することが提案されています。

前駆細胞の5磁気マイクロビーズベースの濃縮

  1. 新しい15 mLコニカル遠心管に、ステップ3で説明したように決定された細胞数に基づいて、1.5〜2×10 6個の細胞を含む肝単一細胞懸濁液のアリコートを移します。
  2. 180×gで8分間4℃で、細胞を遠心（縮小用いた加速度/ 4及び減速/ 2）。
    注：典型的には、1つの健康なC57BL / 6マウスの肝臓（または肝臓組織1gの）は、3つの15 mLコニカル遠心分離管に分離される必要があります。
  3. HBSS、0.5％（v / v）のウシ血清アルブミン（BSA）の400μLで細胞を再懸濁し、抗CD31マイクロビーズの40μLおよび抗CD45マイクロビーズの30μLを追加します。 4℃で15分間、細胞をインキュベートします。
    注：トンを超えないようにしてください分離の純度が大幅に削減されるように彼は、時間をインキュベーション
  4. 細胞に5mLのHBSS、0.5％（v / v）のBSAを追加し、180×gで8分間4°Cのためにそれらを遠心分離（使用して還元加速/ 4及び減速/ 2）。
  5. 死細胞の除去ビーズ100μlに細胞ペレットを再懸濁し、室温で15分間、それらをインキュベートします。一方、LS分離カラムを準備し、HBSS、0.5％（v / v）のBSA 3mLでそれを較正します。
    注：分離の純度が大幅に削減されるように、インキュベーション時間を超えないようにしてください。
  6. 、細胞に900μLのHBSSの0.5％（v / v）のBSAを追加し100ミクロンのポリアミドフィルターメッシュを使用してそれらをフィルタリングし、LS分離カラム上にロードします。
    注：1のLS分離カラムに1肝臓全体をロードします。
  7. HBSS 3mLの0.5％（v / v）のBSAでカラムを3回洗浄し、フロースルーを収集します。
  8. 180×gで8分間、4℃のフローをスルー遠心（縮小ACCEを使用して、leration / 4及び減速/ 2）。
  9. バッファ（RB）（PBSおよび2mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA））さらなる実験手順に応じて、（v / v）のBSAまたはST緩衝液、0.5％を含有するすすぎのいずれかで細胞ペレットを再懸濁します。

複数の肝臓からの結合前駆細胞サブセットの6磁気マイクロビーズベースの自動細胞精製

注：前駆細胞のサブセットは、希少細胞集団を表しているので、複数の肝臓から細胞を結合することは、多くの場合、さらなる実験のために十分な細胞数を達成するために必要とされます。一例として、CD133 +及びGP38 +細胞の分離について説明します。

  1. CD133 +前駆細胞の単離
    1. ステップ3で説明したようにステップ5.9の後、細胞をカウントし、RBの100μLに10 6個の細胞（典型的には4-6健康な肝臓の試料をプール）まで再懸濁します。
    2. 追加抗CD64 1：100および抗CD16 / 32 1：細胞とincubへ1005分間氷上でそれらを食べました。細胞に100抗CD133ビオチン化抗体、さらに10分間氷上でインキュベート：1を追加します。
    3. RBの5 mLを加え、180×gで8分間遠心分離し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。
    4. RBの400μLで細胞を再懸濁し、抗ビオチンマイクロビーズの10μLを追加します。 4℃で15分間サンプルをインキュベートします。これはサンプルの純度を低下させるように、インキュベーション時間を超えないようにしてください。
    5. RBの5 mLを加え、180×gで8分間遠心分離し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。 RB 1 mLにペレットを再懸濁。
  2. GP38 +前駆細胞の単離
    1. ステップ3で説明したようにステップ5.9の後、細胞をカウントし、RBの100μLに10 6個の細胞（典型的には4-6健康な肝臓の試料をプール）まで再懸濁します。
    2. 追加抗CD64 1：100および抗CD16 / 32 1：細胞への100と5分間氷上でインキュベートします。次に、1を追加します。100細胞に対する抗GP38ビオチン化抗体、さらに10分間氷上でインキュベートします。
    3. RBの5 mLを加え、180×gで8分間遠心分離し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。
    4. RBの400μLで細胞を再懸濁し、抗ビオチンマイクロビーズの5μLを追加します。 4℃で15分間サンプルをインキュベートします。これはサンプルの純度を低下させるように、インキュベーション時間を超えないようにしてください。
    5. RBの5 mLを加え、180×gで8分間遠心分離し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。
    6. RBの1mLに細胞ペレットを再懸濁します。
  3. ステップ6.1または6.2後の一般的な手順
    1. 正と負の画分を収集するための2つの追加の空の管を有するチル5ラックの磁気標識した細胞懸濁液を含む15 mLのコニカル遠心チューブを置きます。セパレータの分離プラットフォーム上で冷却ラックを配置します。
    2. ポジティブ選択プログラムを使用します各サンプル（リンスオプション）との間に大規模な洗浄工程で（Possel_d2）。
      注：代わりに自動セパレータのセルの列ベースのマニュアルの分離を使用することにより、試料の純度が低下します。
    3. 180×gで8分間の陽性率と遠心分離機を収集し、4°C（還元加速/ 4および減速/ 2を使用して）。
    4. さらに実験手順に応じて、いずれかのRBまたはSTバッファに細胞ペレットを再懸濁します。
    5. 純度チェックのために、細胞のアリコートを取り、ステップ4で説明したように、それらを染色します。

7.フローサイトメトリー細胞選別

注：任意の前駆細胞サブセットの高純度のソートは、以下に記載のプロトコルを用いて達成することができます。細胞の全体的な収率は、ステップ6に記載されたものよりもはるかに低く、遺伝子発現解析に最適です。

パラメーター 設定
ノズルサイズ 85ミクロン
周波数 46.00から46.20
振幅 38.30から55.20
段階 0
ドロップディレイ 28.68から28.84
減衰オフ
最初のドロップ 284から297
ターゲットギャップ 9.-14
圧力 45 psiの

表3。

  1. （ステップ5で説明した）磁気ベースの濃縮から細胞を取得します。ステップ3で説明したように、それらを数えます。ステップ4で説明したように、前駆細胞マーカー（CD133、GP38）、CD31、ASGPR1およびCD45のためにそれらを染色します。
  2. フェノールレッドフリーのDulbec：ソート培地（SM）を準備0.5％（v / v）のBSAおよび0.01％（v / v）のアジ化ナトリウムを含むコ改変イーグル培地（DMEM）。 、SMで染色された細胞を再懸濁ポリプロピレン丸底チューブにそれらを転送し、氷の上に置きます。
    注：アジ化ナトリウムは、非常に有毒です。ニトリル手袋、白衣、およびフェイスマスクとして、適切な個人保護具を使用します。選別された細胞は、機能的アッセイのために使用されている場合はアジ化ナトリウムを使用しないでください。
  3. 細胞の単離に使用するソーターのタイプのための適切なソフトウェアを使用してください。ソフトウェアを開いて、並べ替えパラメータおよび機械の仕様を設定するには、製造元の指示に従ってください。
    注：機械の仕様を表3にまとめます。マシンの仕様は、様々な機関で異なる可能性がありますが、（45 PSIおよび85μmのノズル）がpopulat前駆細胞の生存率を高めるためにソート圧力の低減と、より大きなノズルサイズが必要であることに注意することが重要ですイオンと分類された細胞から調製したRNAの品質。補償を設定するための濃縮された肝前駆細胞を使用することが重要です。他の肝臓や白血球集団は間質人口の次善の解像度で、偽ゲーティング戦略の異なる自家蛍光との結果を持っています。
  4. マシンを校正し、ソート収集装置にSMの350μLを含む5 mLのポリプロピレン丸底チューブを配置します。サンプル取得およびソートを開始します。亜集団の千のイベントを収集し、サンプルの流れを止めます。
  5. 選別装置の外管を取り、フローサイトメーター上で選別された細胞を測定します。生きている細胞間に存在するソートされた細胞集団の割合を特定します。この割合は、選別された細胞の純度を与えます。
  6. ソート純度が95％を超える場合、ソート収集装置にRLT溶解緩衝液350μLを含む5 mLのポリプロピレン丸底チューブを置きます。
  7. 並べ替えを起動し、収集し7,000-間質亜集団あたり10,000事象。
  8. DNase-とRNaseフリーの反応チューブで選別された細胞を含むRLT溶解緩衝液を移し、さらなる分析まで-80℃でサンプルを記憶。

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結果

実質及び非実質肝細胞（ 図1および図2A）を含む単一細胞懸濁液中の酵素の結果の新規な混合物を使用して、肝臓の消化のためにここに提示手順。赤血球のACK-溶解後、単一細胞懸濁液の分析サイトメトリー直接流れが（ 図1及び2）が可能です。ゲーティング戦略はダブレットと死細胞（ 図2a）の排除を伴います。 CD45、CD31、およびASGPR1のために陰性である細胞がゲートされます。この集団は、肝臓前駆細胞を含み、それらのGP38及びCD133発現（ 図2A）に基づいて分類することができます。 GP38 + CD133 +およびGP38 - CD133 +細胞はCD45の中で最も豊富な細胞集団表す- CD31 - ASGPR1 -

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ディスカッション

肝臓の炎症と異なる起源の損傷は、前駆細胞の増殖および活性化2、3を伴う肝臓での再生プロセスをトリガーします。これらの肝前駆細胞は、細胞性幹有し、おそらく、様々な肝疾患の病理学的機序において重要な役割を果たす。

肝臓前駆細胞の不均一性は、長い間示唆されています。異なる表面マーカーを運ぶサブセットを識別し、肝損傷12の間の炎症関連遺伝子の固有のセットを表現できるCD133およびGP38の新たな表面マーカーの組み合わせを使用して、肝前駆細胞サブセットの再評価。ここで説明する方法は、稀な細胞の直接のフローサイトメトリー分析および種々の肝障害モデルでの直接比較を可能にします。種々の傷害は、複数の前駆体の活性化をトリガーするように、これは、特に適切です小管反応...

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開示事項

著者には、競合する金融利害関係を持っていません。

謝辞

この作品は、VLKにアレクサンダー・フォン・フンボルト財団Sofja Kovalevskaja賞によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RPMILife Technologies21875-034
フェノールレッドフリー DMEMLife Technologies31053-028
FBSLife Technologies10270-106
コラゲナーゼ PSigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseLife Technologies
ACK Lysing BufferLife TechnologiesA10492-01
HBSSLife Technologies14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
アジ化ナトリウムSigma-AldrichS20021% ストック溶液
10% BSAMiltenyi Biotec130-091-376
autoMACSすすぎ液Miltenyi Biotec130-091-2220.5% (v/v) BSA を加え、氷上に保存します
フェノールレッドフリー DMEMSigma-AldrichD1145
カウント ビーズ カウント ブライトライフ テクノロジーズ C36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
FcR ブロッキング試薬Miltenyi Biotec130-092-575
抗CD31マイクロビーズMiltenyi Biotec130-097-418
抗CD45マイクロビーズMiltenyi Biotec130-052-301
死細胞除去キットMiltenyi Biotec130-090-101
抗ビオチンMicroビーズMiltenyi Biotec130-090-485
CD64バイオレジェンド139302希釈:1:100
CD16/32精製されたBioLegend101302希釈率:1:100
CD45 APC/Cy7BioLegend103116希釈率:1:200、造血細胞をマーク
CD31 BiotinBioLegend102504希釈率:1:200、内皮細胞をマーク
ASGPR1 精製バイオテクネAF2755-SP希釈率:1:100、肝細胞
ドプラニン APCBioLegendをマーク127410:1:1,400、前駆細胞ポ
ドプラニンBiotinBioLegend127404希釈:1:1,400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-2103 & マイクロを使用します。L, marks progenitor cells
CD133 BiotinBioLegend141206希釈率: 1:100
CD34 BiotineBioScience13-0341-81希釈率: 1:100
CD90.2 Pacific BlueBioLegend140306希釈率: 1:800
CD157 PEBioLegend140203希釈率: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225希釈:1:100
SCA-1 BiotinMiltenyi Biotec130-101-88510 & マイクロを使用します。L
マウスIgG2b、&κ;PEBioLegend400311
ラット IgG1 PEBioLegend400407
ラット IgG2b, & カッパ;APC/Cy7BioLegend400624
ラット IgG2a, & κ;ビオチンバイオレジェンド400504
ラットIgG2a、およびカッパ;ブリリアントバイオレット421レジェンド400535
シリアハムスターIgG APCBioLegend402012
シリアハムスターIgGビオチンBioLegend402004
正常なヤギIgG制御精製バイオテクネAB-108-C
ロバ反ヤギIgGアレクサフロー488ライフテクノロジーズA11055:1:800
ストレプトアビジン アレクサ フルーア 405ライフ テクノロジーズ S32351希釈: 1:400
100 & マイクロ;m フィルターメッシュA. HartensteinPAS3
LS カラムMiltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACS セパレーターMiltenyi Biotec130-090-976
MACSQuant Analyzer 10Miltenyi Biotec130-096-343
AutoMACS Pro セパレーターMiltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBDBiosciences
FACSDiva sofwareBD Biosciences
ポリプロピレン丸底チューブFalcon352063
Rneasy plus mini kitQiagen74134RLT 溶解バッファーが含まれています
17105041精製ポ希釈バイオ希釈

参考文献

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