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Summary

この論文では、凍結耐性植物の氷結合タンパク質の同定について、氷再結晶阻害活性の評価とその後の氷親和性精製を用いた天然IBPの単離について概説する。

Abstract

アイス結合タンパク質（IBPS）は、氷点下の温度にさらされ、特定の生物によって合成されるストレス誘導タンパク質のファミリーに属しています。細胞外の氷の結晶が成長する際の植物では、凍結による損傷は、形質膜と可能な細胞死の破裂が生じ、発生します。氷晶のIBPSの吸着は、それによって細胞の損傷を減少させる、氷再結晶化阻害（IRI）として知られるプロセスによって、さらなる成長を制限します。 IBPSはまた、平衡融点以下の溶液の凝固点を低下させる能力、熱ヒステリシス（TH）活性として知られている特性を実証します。これらの保護特性は、産業用、医療や農業用途におけるその潜在的な使用のために小説IBPSの同定に関心を高めてきました。この論文は、1）を通じて誘導およびIBPSの抽出植物組織、2）IRI活性の抽出物のスクリーニング、および3）単離およびpurifを植物IBPSの同定を記載しますIBPSのication。低温暴露によってIBPSの誘導後、抽出物は、標準的な光学顕微鏡を使用して氷の結晶成長の観察を可能にする「スプラットアッセイ」を使用して、IRIの活性について試験されます。このアッセイは、低タンパク質濃度を必要とし、迅速に得られ、容易に氷結合活性のための初期画面を提供し、解釈された結果を生成します。 IBPSは、「アイスアフィニティ精製」と呼ばれる技術により、氷に吸着するIBPSの性質を利用して汚染タンパク質から単離することができます。植物抽出物から採取した細胞溶解物を使用して、氷の半球はゆっくりと真鍮のプローブ上に成長させることができます。これは、多結晶氷の結晶構造にIBPSが組み込まれています。 IBPのない先験的生化学的または構造的知識を必要とする、この方法は、活性タンパク質の回収を可能にします。氷精製されたタンパク質画分は、PEPの識別を含む下流の用途に使用することができます質量分析および天然タンパク質の生化学的分析によって潮配列。

Introduction

アイス結合タンパク質（IBPS）は、植物^1、昆虫^2、魚^3、および微生物⁴を含む多くの生物で発見されている保護タンパク質の多様なファミリーです。これらのタンパク質の重要な特徴は、特異的かつ効率的に彼らの成長を修正、氷の結晶に吸着する独自の機能です。 IBPSは、いくつかの文書のプロパティを持つ2つの最もよく特徴付けられる熱ヒステリシス（TH）と氷再結晶化阻害（IRI）を有します。 TH活動がより容易に凍結不寛容な動物で生産さIBPSで観察されます。凍結を防ぐために、生物の循環又は間質液の凝固点の低下のこの活性は、結果。これとは対照的に、必然的に氷点下の温度で凍結する凍結耐性の生物では、IBPSが低いTH活性を有すると思われます。低TH活動にもかかわらず、高IRIの活動は、氷の叫びを制限しますスタル成長は、多くの場合、これらのタンパク質で観察されます。凍結耐性の生物の場合、このIRIの活動は、おそらく外区画中の氷の制御不能な成長から細胞を保護するのに役立ちます。

「マットレスボタン」モデルはIBPS氷結晶⁵の成長を防止するメカニズムを説明するために使用することができます。このモデルでは、IBPSは、具体的には水分子のみバウンドIBPSの間の空間に成長する氷の結晶格子と組み込むことができるように、間隔を置いて氷結晶表面に吸着します。これは、追加の水の分子の取り込みが不利になり、曲率、ギブズ-トムソン効果⁶によって説明することができるイベントを作成します。アンカー包接水仮説は、氷の結晶の表面にIBPSの特異的結合のための機構を提供することにより、REO中の特異的にタンパク質氷結合部位に位置する荷電残基の存在は、結果水分子のrganizationので、氷の結晶格子⁷の一つ以上の面を一致させます。

TH活性は、溶融の間の差を測定し、IBPの存在下で単氷結晶の温度を凍結することによって定量することができます。 TH活性はIBPS、（程度の典型的には一部のみ）植物IBPSによって生成ローTHギャップの活性を評価する広く受け入れられている方法であるが、通常は、高タンパク質濃度、特殊な装置やオペレータの経験を必要とします。非IBPS氷結晶成長を制限することができるが、それはすべてのIBPSによって共有性であり、したがって、IRI活性について試験することは、特に低TH活性を有するものについて、IBPSの存在のために有効な初期画面です。この活性を試験するために使用される方法は、タンパク質試料がフラッシュするかどうかを決定するための時間の期間にわたって観察される小さな氷結晶の単分子層を生成するために凍結させる「スプラットアッセイ」として知られています氷の結晶の成長が制限されています。 IBPSの存在のソース組織試料をスクリーニングするために使用される他の方法とは異なり、この技術は10〜100 ngの範囲で低タンパク質濃度にも適用することが、容易に製作装置を利用し、迅速かつ容易に解釈されるデータを生成します。しかし、このアッセイはTHの決意と氷晶成形によって従うべきIBPSの初期画面を提供することを強調することが重要です。

天然タンパク質の単離は、多くの場合、目的のタンパク質の構造的および生化学的特性に関する情報を必要とする、困難です。氷のためのIBPSの親和性は、精製目的のための基質として氷を使用して、これらのタンパク質の単離を可能にします。分子の大部分は、大quantitを欠いて、氷の結晶の成長、高度に精製された試料中のIBPサンプル結果の存在下で氷半球の遅い成長中に先に氷 – 水境界に押されているのでタンパク質および溶質を汚染するIES。この方法は、昆虫^{8、9、10、11}の細菌、魚¹²および植物^13、14からIBPSを同定するために使用されてきました。また、この方法によって達成IBP富む画分はまた、下流の生化学的分析のために使用することができます。本稿では、タンパク質の存在、および氷アフィニティー精製を用いてタンパク質の単離を確認するIBPS、IRI活性の分析の誘導および抽出により植物におけるIBPSの識別を概説します。

Protocol

1.スプラット装置のセットアップ

1. エチレングリコール（水中50％v / v）を有する温度プログラム可能な循環水浴を埋めます。
   注：緑の自動車のエチレングリコールを使用することができます。
2. 外部チャンバを組み立てるために、二重壁のガラスボウルに水浴を接続する絶縁プラスチック管を使用します。発泡スチロールでガラスボウルを絶縁し、プラスチックシャーレのふたでカバーしています。光源はガラスチャンバーを通して見ることができるようにポリスチレン容器の底に3-4インチの穴を開け。
3. 10倍の接眼レンズをカメラポートと4X偏光対物レンズを取り付けた解剖顕微鏡の外部チャンバーを、マウント。外部チャンバの底部における偏光フィルムの追加の部分を配置します。
4. レトルトスタンドの基部にチューブの下に位置する冷却ブロックと共に、大型ポリスチレン容器内レトルトスタンドと場所に1〜1.5メートルチューブ（〜5cmの直径）をクランプします。

IRIの解析のためのネイティブのタンパク質抽出物の調製

1. 微光条件（6時間明/ 18時間暗）下で、4℃で最大1週間凍結耐性草または他の凍結耐性の植物種、冷順応植物におけるIBPSの発現を誘導します。これは、すでに低い温度条件と順化期間にさらされているフィールドから採取されたサンプルには適用されません。
2. 茎の基部に切断することにより、葉組織の約0.1グラムを得、次いで1.5 mLチューブに入れます。すぐに使用するまで-80℃で液体窒素や店舗でサンプルを凍結点滅。
3. 細胞を溶解するために、液体窒素下で乳鉢と乳棒を用いて微粉末に組織サンプルを挽きます。液体窒素は、均質化プロセス中に蒸発していないことを確認してください。
4. 直ちに氷上に地面サンプルを配置し、液体窒素が完全に蒸発することができます。天然タンパク質extractiの1 mLを加え10mMトリス – 塩酸を含む緩衝液に、25mMの塩化ナトリウム（pH7.5）を、使用直前に追加した2つのEDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤有します。ピペットは、混合します。渦ありません。
   注：溶解物二次代謝産物が含まれている場合は、追加の添加剤は、（説明を参照）を使用する必要があります。
5. 穏やかに4℃でサンプルを一晩（18-24時間）を振ります。 4℃での残りのステップを行います。
6. 5分間〜16,000×gでサンプルを遠心分離することにより、細胞破片を除去します。可溶性画分を保持し、細胞残屑が続く場合、さらに5分間遠心します。清澄化サンプルは使用するまで-20℃で保存することができます。

3.スプラットアッセイ事前実験を設定します

1. 偏光フィルムと設定外部チャンバーにヘキサン100mLを注ぎ、水分がスライド上に構築防ぐために5~6乾燥ビーズを加えます。浴をカバープレートに真空グリースを少量加え、密封を確保し、ヘキサンの蒸発を防ぐためにねじれ。 </lI>
2. 実験を開始する前に、間-4℃から-6°Cプログラマブル水浴を用いて約2~3時間のヘキサン浴を冷却します。実験を開始する前に温度計をヘキサンの温度を確認してください。
3. 直接プラスチックチューブ以下ポリスチレンボックスに冷却ブロックを配置し、ドライアイスで完全に実験を開始する前に40分を覆います。
4. アッセイを開始する前に、チューブが水平であることを確認してください。決定するために、ここで、冷却ブロック上のサンプルを水で手順、最初のテストを削除して（後述のように）サンプルがマーカーで低下する場所を示すであろう。
5. 冷たいブロックの上からドライアイスを除去し、水で決定されたドロップマークをガラス顕微鏡カバースライドを置きます。
6. 直ちにアッセイを開始する前に、光源をオンにし、ガラス容器の底部に形成された任意の氷を掻き取ります。ない限り、氷の結晶に光源を維持しないでくださいヘキサンを加熱防止するために可視化されています。

スプラットアッセイを行う4。

1. 余分な油を除去ペーパータオルを使用して、液浸油自動ピペット（1-20μL）に固定された使い捨てチップを浸し。このステップでは、サンプルが落ちるのではなくピペットの外側に付着することができます。
   注：ピペットから余分な油を削除するには、油滴が可視化が困難、氷の結晶の上に形成されないことを確実にするために重要です。
2. 直接サンプルを解放する前に、プラスチック製のチューブを超えるサンプルと場所ピペットのピペット10μL。サンプルは、氷の結晶の単層を作成し、ガラスカバースライドに当たったときの異なる「スプラット」音が聞こえるする必要があります。
3. 迅速かつ慎重にピンセットを使用して、コールドブロックから顕微鏡スライドを削除し、偏光フィルムの上に、ヘキサン浴に置きます。
4. 顕微鏡で見ると、ビューや広告の分野に顕微鏡スライドを置きますちょうど対物レンズ交差分極は、高コントラスト氷晶の可視化を可能にするようになっています。 40倍に倍率を調整します。
5. 顕微鏡にカメラを取り付け、氷の結晶の明確な可視化を可能にし、画像をキャプチャするために、「マクロ」に設定を調整します。
   注：氷の結晶が成長できるようにするために1時間まで待機して鮮明な画像を与えることができます。
6. 繰り返しは、すべてのサンプルに対して4.1から4.5を繰り返します。典型的には、ヘキサンチャンバ内の異なる試料で最大6枚のスライドを置きます。
7. 光源をオフにし、ヘキサン浴上でプラスチック板を配置し、密封を保証します。氷の結晶が（特定のアッセイ内で一貫アニーリング期間を維持しながら、12〜24時間）を一晩アニールすることを可能にします。上記のようにインキュベーション後、氷のフィルムの画像をキャプチャします。
   注：一部のサンプルは、より迅速に他より再結晶化します。いかなる再結晶は12時間後に明らかでない場合は、24時間までないrecrystalliことを保証するために結晶をアニールすることを可能にしますzationが発生します。

5.スプラットアッセイデータ分析

1. コンピュータに写真をアップロードして、直接、アニール前と後の氷の結晶の大きさを比較します。ないIRIの活動なしのサンプルが著しく大きい氷結晶を形成する再結晶であろう一方、氷の再結晶化活性を有するサンプルは、成長しないであろう。光の干渉は、大きな氷の結晶がわずかに異なる色合いで表示されますので、参照しやすいようになります。

6.アイスアフィニティ精製機器のセットアップ

1. エチレングリコールとの温度プログラム可能な循環水浴を記入してください。グリーン自動車エチレングリコールを使用することができます。
2. 絶縁プラスチックチューブ^15を用いて、中空、黄銅プローブにバスを接続します。
3. 150mLのビーカーは、ぴったり合うことができるそこにポリスチレン容器を構成します。真鍮コールドフィンガーのために中央に穴の開いた容器用の蓋を作成します。

7。アイスアフィニティ精製のための試料の調製

1. 2.1節で説明したように冷たい順応植物組織。
2. 20 mLチューブに接地バイオマス（ステップ2.3）の〜100〜150グラムを収集し、直ちに凍結点滅。サンプルは、使用前に-80℃で保存することができます。
3. セクション2.3から2.5に記載されたサンプルを準備します。葉組織の再懸濁のために：1つの比（天然のタンパク質抽出バッファーmLの組織のMG：1）を使用します。内因性プロテアーゼによってIBPSの劣化を避けるために、追加のプロテアーゼ阻害剤錠剤を使用してください。
   注：2または1：3（組織のMG：天然のタンパク質抽出緩衝液のmL）で組織サンプルがあまりに濃厚である場合、1の比を調整します。
4. 細胞破片を除去し、チーズクロスの2層、3回通って溶解物をふるいです。 4℃で40分間30,000×gで遠心分離することにより破片をペレット。
5. 天然のタンパク質抽出緩衝液を用いて120 mLに試料の体積を増加させます。アイスアフィニティ精製のために直ちにに溶解産物を使用してください氷結合活性の損失を避けます。

アイスアフィニティ精製を実施8.

1. 精製前に、-0.04℃/ hの速度で-0.5℃〜-3℃で冷却するためにプログラム可能な水槽セット。
   注：冷却速度は、サンプルの初期量に応じて調整することができます。
2. -0.5℃に氷の指を冷却し、続いて冷たい蒸留水を含む50 mLチューブにそれを沈めます。氷の核形成を促進するために、いくつかの氷片を追加し、指の上に形成する氷の薄い層を許容します。このプロセスは、典型的には20〜30分を要します。
   注：氷でコーティングされた指の上の任意の塊が前にサンプルに置くことに手袋をはめた手で平滑化されなければなりません。氷層が-0.5°Cで形成していない場合は、-0.75°Cまで温度を下げます。
3. マグネチックスターラーの上にポリスチレン容器に小さな磁気撹拌棒を含む150mLのガラスビーカーに試料を置き。氷の指があることを確認します中心と液体試料中に少なくとも半分を下げました。コンテナを封印。
4. 24時間ごとにチェックし、プログラムは約2日間実行を許可します。サンプルの50％が凍結されたら、プログラムを停止します。氷の半球へのIBPSの取り込みは、「アイス・エッチング」になります。
   注：精製実験は、プログラムの実行は、それに応じて調整する時間の長さより大きなサンプル量を使用して行うことができます。
5. 、氷の半球を除去し、4℃にプローブを温めるために、非結合タンパク質を除去し、次いで4℃で解凍し、蒸留水で半球をすすぎます。
   注：ほとんどのIBPSは、水中で安定ではなく、適切な緩衝液（ すなわち、50mMトリス-HCl、pHが8または50 mMの重炭酸アンモニウム、pHを8）を解凍処理（約1mL / 2時間）の間、定期的に追加する必要があります。氷の半球は、アルミホイルで包み、前解凍に-20℃で保存することができます。
6. 氷の半球はまだ含まれている場合sの顔料は、またはサンプル精製を高めるために、繰り返しが8.1から8.5に2-3回を繰り返します。
   注：IBPの濃度は、精製の複数回以下の低くてもよいが、精製されたサンプルはMSを用いて分析される場合、純度が収率よりも価値があります。十分な材料が使用可能である場合、アイスアフィニティ精製の3ラウンドをお勧めします。

IBPS 9.識別

1. IBPSを氷半球の解凍以下大量に含まれているので、サンプルを濃縮します。小さなタンパク質の損失を回避するために、3,000 Daの分子量カットオフを有する遠心濃縮管を用い〜1-3 mLに組織の〜100グラムを含むサンプルを濃縮しました。
2. MSのためのサンプルを送信する前に、このようなBCAやBradfordアッセイのようなタンパク質定量アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。そのようなSDS-PAGE等の電気泳動によってサンプルの純度を推定します。 SEへ前IRI活性の精製タンパク質を試験活性タンパク質は、精製および濃縮工程を経て保持されていることを確認するために、MSのためnding。
3. 質量分析¹⁰のために直接濃縮サンプルを使用します。

Representative Results

Discussion

IBPの分析および精製を成功させるためには、これらのタンパク質のいくつかの温度感受性を理解することが重要である。特定の植物IBPは、0℃以上の温度では不安定になり、アンフォールディング、沈殿および不活性が生じる。活性なIBPを得るためには、植物を低温室（〜4℃）で処理し、実験中に試料を氷上に置くことがしばしば重要である。全細胞粗溶解物を使用する場合に考慮すべきもう一つの要因は、内因性プロテアーゼによるタンパク質の分解である。植物において、IBPの発現は一般的に低く、したがってタンパク質収量の損失は、将来の実験または分析に不十分な物質をもたらす可能性がある。信頼性の高いプロテアーゼ阻害剤カクテルを添加することで、タンパク質抽出中に迅速に作業することで、このようなタンパク質の損失を減らすことができます。さらに、低温馴化期間は、実験室で成長させたIBPの最大蓄積について最適化することが重要である植物。

IBPSでの作業別の一般的な問題は、アッセイの多くは温度と湿度に敏感であるということです。 IRIの分析に関しては、顕微鏡カバースライド上の水分の蓄積は、氷の結晶の可視化を困難に氷の層をもたらすことができます。除湿機を使用して、余分な乾燥ビーズは、この問題を解決することができます。しかしながら、実験室の相対湿度が70％を超えている場合に、このアッセイを行わないことが推奨されます。

スプラットアッセイは、提示され、定性的です。分析前に希釈系列を実行することにより、IRIエンドポイントはIBPSがもはや氷の結晶の成長を制限することが可能な濃度範囲を決定するために確立することができます。様々なラボはまた、氷結晶粒子¹⁸の平均粒径を測定するためにコンピュータソフトウェアを使用しています。先に示したように、IRI活性について試験しつつ、効率的な初期画面の確認は、氷結合活性はTHのレベルを決定することによって、または直接氷結晶¹⁶にIBPSの吸着を可視化することによって確立されるべきです。 IRI解析の顕著な制限は、いくつかの非IBP分子が模倣IRI活性が同定されていることです。これらの分子は、嵩高いタンパク質、フェノール配糖体、及びポリビニルアルコール^19、20、21のような合成ポリマーを含むことができます。その結果、バッファ制御は、常に任意の汚染物質や添加物が観測されたIRIの活動をもたらさないことを確実にするために、サンプルを実行する必要があります。

アイスアフィニティ精製が容易である一方で、正しく行われていないとき、他のタンパク質、溶質及び代謝物が優勢ことができます。考慮すべき重要な点は、氷の結晶の成長率です。 （ つまり、-0.02°C / hまで）の冷却速度を低下させることで、氷の半球は、よりゆっくりと成長し、任意の非氷結合molecuレは、氷の結晶格子に取り込まれる可能性は低いです。汚染分子の存在はまた、溶解物の50％のみが半球（ すなわち 50:50、氷比への液体）に組み込まれることを確実にすることによって回避することができます。先に述べたように、氷の親和性の複数のラウンドはまた、氷分画を明確にし、より高純度の試料をもたらすことができます。特に、二次代謝産物は、多くの場合、植物中の生物的および非生物的ストレス条件下で過剰生産されています。フェノール豊富な植物組織の精製中に、暗褐色顔料が続く場合、（PVPP）（w / v）の1.5％（v / v）のポリビニルピロリドン（PVP）及び1.5％のポリビニルポリピロリドンは、二次中和するために、抽出緩衝液に添加することができます代謝物。そのようなチオ尿素（5-10 mM）のような酸化防止剤の添加はまた^{、21は 19を}使用することができます。

関心対象のIBPに関する情報は、高圧Liなど、追加の精製工程を、知られている場合頭の良いクロマトグラフィー（HPLC）を使用することもできます。氷アフィニティ精製の修飾も考慮することができ、タンパク質の収率を最適化し、高速氷シェル精製²³と蛍光ベースの氷面親和性^（FIPA）24を含むIBP特性に付加的な洞察を得ることが報告されています。

最適化されたときに、上述の技術はIBPSの同定のための精製タンパク質プールを得ることができます。しかし、他の非常に豊富なタンパク質の非特異的な取り込みは避けられないかもしれません。異なる生物からのIBPSとの間に高い多様性に起因するPooideaeファミリー配列相同性を共有する²⁵からIBPSが、それだけでは配列相同性によりIBPを識別するために、一般的には不可能です。 IBPSの共通の特徴は、スレオニン、セリンおよびバリン²⁶を含む氷に結合することが知られているアミノ酸の存在です。目の豊富なペプチド配列を同定セケンス・ダタマイニングするときESE残基が有用である可能性があります。

Materials

1.5 mL microcentrifugetubes	Fisher	05-408-129
Adjustable lab jack	Fisher	S63080
Benchtop centrifuge	Desaga MC2
Brass probe	Custom built
Camera/camera port	Canon		Canon Power Shot SX110 digitial camera; custom built microscope port
Cheesecloth	Purewipe/Fisher Scientific	06-665-25A
Concentration tubes (0.5 mL)	EMD Millipore	UFC501008
Concentration tubes (15 mL)	EMD Millipore	UFC900308
Conical tubes (50 mL)	Thermo Fisher	AM12502
Cooling block	VWR	13259	Use a metal heating block
Dehumidifier	Whirlpool		50 pint Energy Star dehumidifier; purchase from local supplier
Dessciation beads	t.h.e. Dessicant/VWR	EM-DX0017-2	6-8 mesh size; 100% indicating
Dissection microscope	Olympus Tokyo
Double walled glass bowl	Generic		Purchase from local lab glassware supplier
Dry ice	Generic		Use local supplier; hazardous 
EDTA-protease inhibitor tablets	Sigma Aldrich	11836170001	Roche cOmplete mini
Ethylene glycol	Generic		Green automotive ethylene glycol can be purchased from any local hardware store (<em>i.e.</em> Home Depot)
Hexane	Sigma Aldrich	296090	Anhydrous, 95%; hazardous
Immersion oil	Sigma Aldrich	56822
JA10/20 centrifuge	Beckman
Large plastic Petri dish	Generic
Liquid nitrogen	Generic		Use local supplier; hazardous&nbsp;
Magnetic stir plate	Hanna Instruments	HI190M
Microscope cover slides	Fisher	12-542A
Plastic tube	Generic		Purchase PVC pipe from local hardware store
Polarized film	Edmund Optics	43-781
Polystyrene foam	Generic		Can be constructed from polystyrene shipping boxes
Poreclain mortar and pestle	Fisher	FB961
PVPP	Sigma Aldrich	77627	110 &micro;m particle size
Retort Stand	Fisher	12-000
Small stir bar	Fisher	14-513-51
Temperature-programmable water bath	VWR	13271-118
Vacuum grease	Dow Corning/Sigma Aldrich	Z273554
Vinyl tubing	Generic