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3Dで栽培ネイティブ腸とのCaco-2細胞において上皮輸送タンパク質の機能および発現を研究するための方法

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

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1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

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我々は、3次元で増殖させたCaco-2細胞のインビトロ細胞培養モデルおよびマウス腸のex vivoモデルを使用して腸のセロトニントランスポーター（SERT）の機能および発現の調節を研究するための簡単な方法を記載します。これらの方法は、他の上皮輸送体の研究にも適用可能です。

Abstract

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腸上皮は、異物に対するバリアを提供しながら、体の正常な生理機能において重要な役割を果たす重要な輸送およびバリア機能を有します。障害上皮輸送（イオン、栄養素、または薬物）は、多くの疾患に関連しており、上皮の完全性と腸のmicrobiomeに影響を与えることによってのようなトランスポーターの正常な生理機能を超えて拡張結果をもたらす可能性があります。輸送タンパク質の機能および調節を理解することは、改良された治療的介入の開発のために重要です。上皮輸送の研究における最大の課題は、天然の腸上皮細胞の重要な特徴を再現する適切なモデルシステムを開発しています。かかるたCaco-2、T-84、およびHT-29 Cl.19A細胞などのいくつかのin vitro細胞培養モデルは、典型的には、上皮輸送研究で使用されています。これらの細胞株は、電子をモデル化への還元主義的なアプローチを表しますpitheliumとは、上皮 - 微生物相互作用の彼らの検査を含む多くの機構研究に使用されています。しかし、細胞単層を正確に細胞間相互作用およびin vivoでの微小環境を反映するものではありません。 3Dで増殖した細胞は、薬物透過性研究のためのモデルとして有望であることが示されています。我々は、3DでのCaco-2細胞は、上皮輸送を研究するために使用できることを示します。 Caco-2細胞での研究は、細胞特異的な効果を除外すると、アカウントにネイティブ腸の複雑さを取るために他のモデルを補完していることも重要です。いくつかの方法は、以前に、このような単離された上皮細胞または単離された細胞膜小胞で裏返し嚢および取り込みとして、輸送体の機能を評価するために使用されてきました。モデルへの尊敬と輸送機能の測定に考慮分野における課題を取って、私たちはここに3DでのCaco-2細胞を増殖としてウッシングチャンバーの使用を記載するプロトコルを実証しますこのような無傷の偏腸管上皮におけるセロトニン輸送を測定するための効果的なアプローチ、。

Introduction

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腸上皮は、栄養素、電解質、および薬物の吸収からルーメン内の流体およびイオンの分泌に至るまで多数の機能を実行する様々な輸送タンパク質（チャンネル、ATPアーゼ、共同輸送および交換）が装備されています。輸送タンパク質は、ベクトルの様式でイオンや分子の運動を可能にする電気化学的勾配を生成します。これは、分極した上皮細胞の頂端および側底膜における輸送系の非対称分布によって達成されます。また、隣接する上皮細胞テザータイトジャンクションは、頂端及び側底膜ドメイン間の成分の膜内の拡散に対するバリアとして働くことによって、このプロセスにおいて重要な役割を果たす。ネイティブ腸（ すなわち極性、分化、およびタイトジャンクションの整合性）のこれらの特徴を模倣し、適切なモデル系はfunctioの研究のために重要です上皮輸送システムのナリティ。

モデルに関しては、腸上皮輸送研究において現在使用される典型的な細胞株は、のCaco-2、完全に分化したモデルであり、小腸上皮細胞吸収性。そして、T84細胞またはHT-29サブクローン、陰窩由来の大腸上皮細胞のモデル1。従来は、これらの細胞株は、プラスチック表面で単層として、またはコーティングされたトランスウェルインサートで増殖させます。ある程度のトランスウェル細胞培養インサートを、偏細胞が基底外側に供給できるようにすることで、 生体内環境に似ています。しかしながら、従来の2D培養系の制限は、細胞が、人工....

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Protocol

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ゼラチン状のタンパク質混合物に成長する3DのCaco-2細胞培養：のCaco-2の3次元培養システムにおける腸管トランスポーターの1研究

  1. 4°Cで8時間（またはO / N）氷上でゲル状のタンパク質混合物を減少融解成長因子。解凍したら、後の使用のために-20℃で使用または保管のために1ミリリットルまたは500μLアリコートを作ります。
  2. 文化の日に、氷の上で培養（RNAとタンパク質抽出のための）プレートまたは（免疫染色用）チャンバースライドを予冷。 8ウェルチャンバー・スライドガラス（または6ウェルプレートのウェルあたり120μL）の各ウェルにゲル状のタンパク質混合物の30μLを加え、均一に広げます。処理中に気泡を発生しないように注意してください。
  3. 15、37℃で細胞培養インキュベーター内部のスライド/プレートを置き - 30分とゼラチン状のタンパク質混合物が固化することができます。
  4. ゼラチン状タンパク質混合物が凝固している間、のCaco-2細胞のコンフルエントなフラスコをトリプシン処理。
  5. 数を数えます細胞のと5分間卓上遠心機で500×gでそれらをスピン。必要に応じて、3DのCaco-2培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
  6. （プレート、ウェル当たり20,000）ウェルあたり4000細胞でのガラスチャンバースライドをシード。細胞は37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で成長させます。 4日間 -....

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Results

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3DのCaco-2嚢胞における免疫染色は、 図1に示されています。ファロイジンアクチンで染色された3次元嚢胞においてよく区画内腔を示すXY平面内の代表的な画像が図1Aに示されています。内腔に面する側には、頂端面を示しています。 3D環境で培養上皮細胞は、堅牢な上皮表現型をもたらします。アクチンおよびSERTを共染色した12日目、上異なるのCaco-2嚢胞は、 図1Bに示されています。 XY平面（ 図1（a）に示す平面とは異なる）のこの表現では、SERT染色はサブ頂端染色と共に、主に管腔側膜に、表示されます。 図2は、12日目のpostplatingで単層として増殖させたCaco-2細胞と比較して、SERTタンパク質レベルが3D嚢胞に高いことを示しています。これらのデータは、Caco-2細胞の3D培養はNAを模倣するシグナル伝達事象を誘発し得ることを示唆しています的な上皮および増加S.......

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Discussion

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完全に分化したCaco-2細胞単層を15、腸管輸送10、11、12、13、14を研究するために、分極した上皮単層として広く用いられてきました。しかし、腸上皮細胞の生理的な組織を模倣するために、3DでのCaco-2文化の発展に大きな関心がありました。腸上皮細胞のための三次元細胞培養モデルの数は、最近、2次元システム16よりも大きな生理的関連性を有する天然の細胞-細胞及び細胞-細胞外マトリックス（ECM）の相互作用を模倣するが開発されています。したがって、（例えば、ラミニン、コラーゲンIV、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンなどの）一般的な成分を含有するECMベースの天然ヒドロゲルは、広範囲の3D細胞培.......

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Disclosures

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著者らは開示するものは何もない。

Acknowledgements

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私たちは、原稿の編集と校正を手伝ってくれたRKG研究室の医学博士/博士課程の学生であるクリストファー・マンゼラ氏に感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCCATCC®HTB­37&トレード;細胞
10xPBS Carl Zeissマイクロソープ 共焦点イメージング
用<.sup>3[H]-5-HT LabtekII152453顕微鏡用細胞培養
5-HT Gibco70013-032有害物質ではない
95% O2- 5% CO2 シリンダーKPL71-00-27有害物質ではない
寒天(寒天プレート用)FischerBP151-100急性毒性、オラ
寒天(電極用)SigmaG7126-1KG有害物質ではない
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VL有害物質ではない
牛血清アルブミン (BSA)ΣP6148-500G飲み込んだり吸い込んだりすると有害
CaCl2LifeTechnologiesA12380有害物質ではない
Caco-2 細胞Σ A8806-5G有害物質ではない
細胞溶解バッファーフィッシャーBP337-100有害物質
Chabered スライドSigmaS5886-1KG有害物質ではない
コラーゲン Type-1 ソリューションSigmaS8045-500G
電極SigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
ウシ胎児血清 (FBS)コーニング356234細胞外マトリックスとして使用
フルオキセチンキアゲン74104
ゲンタマイシンATCC30-2003細胞培養培地
グリシン細胞シグナル伝達, ダンバース, マサチューセッツ
州 Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco by Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOH Gibco by Life Technologies15630-080
L-アスコルビン酸 ライフテクノロジーズのGibco10082147
液体シンチレーションカウンター Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
MannitolPhysiologic Instruments、カリフォルニア州サンディエゴ P2304
MatrigelPhysiologic Instruments, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2>Physiologic Instruments、カリフォルニア州サンディエゴ DM MC6
マルチチャンネル電圧/電流クランプ生理機器、カリフォルニア州サンディエゴ P2300
NaClPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2023-100
NaClフィッシャーサイエンティフィック、ハンプトン、ニューハンプシャー州BP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリS5886
ノーマル ヤギ血清 (NGS、10%)フィッシャーサイエンティフィック、ハンプトン、NHS233
パラホルムアルデヒド (PFA)Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州 P288
Pen-StrpSigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイスC3881
プロテインアッセイ試薬Sigma-Aldrich, St Louis, MO10420
プロテイナーゼ阻害剤カクテルMEDOX, Chicago, IL style G- 12300
RNA easy Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
シングルチャンネル電極入力モジュール Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
スナップウェルチャンバー用スライダーSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
リン酸ナトリウム (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
水酸化ナトリウム (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β1Perkin-Elmer,Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (chamber only)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing Chamber SystemsSigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州A1296
州 Tween-20

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

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