方法論記事

3Dで栽培ネイティブ腸とのCaco-2細胞において上皮輸送タンパク質の機能および発現を研究するための方法

DOI：

10.3791/55304

⸱

2017年3月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

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サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我々は、3次元で増殖させたCaco-2細胞のインビトロ細胞培養モデルおよびマウス腸のex vivoモデルを使用して腸のセロトニントランスポーター（SERT）の機能および発現の調節を研究するための簡単な方法を記載します。これらの方法は、他の上皮輸送体の研究にも適用可能です。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腸上皮は、異物に対するバリアを提供しながら、体の正常な生理機能において重要な役割を果たす重要な輸送およびバリア機能を有します。障害上皮輸送（イオン、栄養素、または薬物）は、多くの疾患に関連しており、上皮の完全性と腸のmicrobiomeに影響を与えることによってのようなトランスポーターの正常な生理機能を超えて拡張結果をもたらす可能性があります。輸送タンパク質の機能および調節を理解することは、改良された治療的介入の開発のために重要です。上皮輸送の研究における最大の課題は、天然の腸上皮細胞の重要な特徴を再現する適切なモデルシステムを開発しています。かかるたCaco-2、T-84、およびHT-29 Cl.19A細胞などのいくつかのin vitro細胞培養モデルは、典型的には、上皮輸送研究で使用されています。これらの細胞株は、電子をモデル化への還元主義的なアプローチを表しますpitheliumとは、上皮 - 微生物相互作用の彼らの検査を含む多くの機構研究に使用されています。しかし、細胞単層を正確に細胞間相互作用およびin vivoでの微小環境を反映するものではありません。 3Dで増殖した細胞は、薬物透過性研究のためのモデルとして有望であることが示されています。我々は、3DでのCaco-2細胞は、上皮輸送を研究するために使用できることを示します。 Caco-2細胞での研究は、細胞特異的な効果を除外すると、アカウントにネイティブ腸の複雑さを取るために他のモデルを補完していることも重要です。いくつかの方法は、以前に、このような単離された上皮細胞または単離された細胞膜小胞で裏返し嚢および取り込みとして、輸送体の機能を評価するために使用されてきました。モデルへの尊敬と輸送機能の測定に考慮分野における課題を取って、私たちはここに3DでのCaco-2細胞を増殖としてウッシングチャンバーの使用を記載するプロトコルを実証しますこのような無傷の偏腸管上皮におけるセロトニン輸送を測定するための効果的なアプローチ、。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腸上皮は、栄養素、電解質、および薬物の吸収からルーメン内の流体およびイオンの分泌に至るまで多数の機能を実行する様々な輸送タンパク質（チャンネル、ATPアーゼ、共同輸送および交換）が装備されています。輸送タンパク質は、ベクトルの様式でイオンや分子の運動を可能にする電気化学的勾配を生成します。これは、分極した上皮細胞の頂端および側底膜における輸送系の非対称分布によって達成されます。また、隣接する上皮細胞テザータイトジャンクションは、頂端及び側底膜ドメイン間の成分の膜内の拡散に対するバリアとして働くことによって、このプロセスにおいて重要な役割を果たす。ネイティブ腸（ すなわち極性、分化、およびタイトジャンクションの整合性）のこれらの特徴を模倣し、適切なモデル系はfunctioの研究のために重要です上皮輸送システムのナリティ。

モデルに関しては、腸上皮輸送研究において現在使用される典型的な細胞株は、のCaco-2、完全に分化したモデルであり、小腸上皮細胞吸収性。そして、T84細胞またはHT-29サブクローン、陰窩由来の大腸上皮細胞のモデル1。従来は、これらの細胞株は、プラスチック表面で単層として、またはコーティングされたトランスウェルインサートで増殖させます。ある程度のトランスウェル細胞培養インサートを、偏細胞が基底外側に供給できるようにすることで、 生体内環境に似ています。しかしながら、従来の2D培養系の制限は、細胞が、人工的な平坦な剛性表面に適合するように強制されることです。このように、ネイティブ上皮の生理学的な複雑さを正確に2Dシステムに反映されません。この制限は、このようなゲル状のタンパク質mixturとして、特定の微小環境に3Dで細胞を成長させる方法によって克服されましたE、細胞外マトリックス成分2,3の多様を含みます。それにもかかわらず、in vitroでの培養物は、腸内で複数の細胞型と地域固有のアーキテクチャを有する腸上皮の複雑さをシミュレートすることはできません。したがって、細胞培養モデルを用いた研究は、天然腸のさらなる検証が必要です。 in vitroでの3D細胞培養およびマウスの腸管粘膜を使用して、我々は腸のセロトニントランスポーター（SLC6A4、SERT）の調節を研究するために、ここで簡単な方法を記載しています。

依存性プロセス- SERT輸送が急速のNa + / CLを介して輸送することにより、重要なホルモンおよび神経伝達物質5-ヒドロキシトリプタミン（5-HT）の細胞外の利用可能性を調節します。 SERTは、抗うつ薬の既知の標的であり、最近では、そのような下痢や腸炎などの胃腸障害の新たな治療標的として浮上しています。腸上皮細胞における5-HTの取り込みを調査する方法は、以前に記載されています。例えば、プラスチック支持体または透過性インサート上で成長させたCaco-2細胞を、頂端及び側底領域4の両方でフルオキセチン感受性3 H-5-HTの取り込みを示すことが示されています。人間の臓器提供者小腸から調製された単離された刷子縁膜小胞（BBMVs）でSERT機能の測定も私たち5によって記載されています。人間BBVMsで3 H-5-HTの取り込みは、フルオキセチンに敏感およびNa + / Clであることが示された-依存性、そしてそれは300 nMの5のK mは飽和動態を示しました。同様の方法を用いて、我々はまた、以前にマウスの腸BBMVs 6で3 H-5-HT取り込みとしてSERT機能を測定しました。しかし、純粋な原形質膜小胞の調製は、組織粘膜を大量に必要とします。このようなradiogのような他の方法、3 H-5-HT取り込み部位のraphic可視化は、また、モルモットおよびラット小腸7に以前に示されています。

ウッシングチャンバーは、様々な上皮組織を横切るイオン、栄養素、および薬剤の輸送を測定するためのより生理学的なシステムを提供します。ウッシングチャンバー技術の主な利点は、それがそのまま偏腸上皮の電気的および輸送パラメータの正確な測定を可能にすることです。さらに、内因性神経筋系の影響を最小限に抑えるために、腸粘膜の漿膜筋層の剥離は、上皮8の輸送の調節を調査するために行うことができます。

私たちは、ゼラチン状タンパク質上の3Dで成長したCaco-2細胞が別個の頂端および側底マーカーを発現する中空内腔を形成することを実証しています。これらの細胞は、2DのCaco-2細胞よりもSERTの高い発現を示します。方法は、3D細胞を増殖し、PEにrform免疫染色またはRNAおよびタンパク質の抽出について説明します。また、我々は、ウッシングチャンバーの技術を利用して小腸粘膜におけるTGF-β1、多面的サイトカインでSERT機能および調節を研究するための方法を記載しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ゼラチン状のタンパク質混合物に成長する3DのCaco-2細胞培養：のCaco-2の3次元培養システムにおける腸管トランスポーターの1研究

  1. 4°Cで8時間（またはO / N）氷上でゲル状のタンパク質混合物を減少融解成長因子。解凍したら、後の使用のために-20℃で使用または保管のために1ミリリットルまたは500μLアリコートを作ります。
  2. 文化の日に、氷の上で培養（RNAとタンパク質抽出のための）プレートまたは（免疫染色用）チャンバースライドを予冷。 8ウェルチャンバー・スライドガラス（または6ウェルプレートのウェルあたり120μL）の各ウェルにゲル状のタンパク質混合物の30μLを加え、均一に広げます。処理中に気泡を発生しないように注意してください。
  3. 15、37℃で細胞培養インキュベーター内部のスライド/プレートを置き - 30分とゼラチン状のタンパク質混合物が固化することができます。
  4. ゼラチン状タンパク質混合物が凝固している間、のCaco-2細胞のコンフルエントなフラスコをトリプシン処理。
  5. 数を数えます細胞のと5分間卓上遠心機で500×gでそれらをスピン。必要に応じて、3DのCaco-2培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
  6. （プレート、ウェル当たり20,000）ウェルあたり4000細胞でのガラスチャンバースライドをシード。細胞は37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で成長させます。 4日間 - メディアごとに3を変更します。

3DのCaco-2細胞における上皮トランスポーター2.免疫蛍光染色：1日目

  1. 吸引し培地、室温で30分間、2％パラホルムアルデヒド（PFA）の400μL（pHを有するPBS中にNaOHで8.5に調整）で細胞を固定します。
    注：PFA溶液を4℃で1週間以上保存することがなく、かつ新たに作られた溶液を使用することができます。 注意：PFAは非常に毒性および潜在的な発がん性物質です。常に化学フード内で慎重にそれを処理し、個人用保護具を使用します。
  2. （1×PBSで2回、ウェルを洗浄し、PBS中で4℃でスライドを保存する400μL/ウェル）。固定したら、1週間まで4℃で保管してください。
  3. RTへのチャンバースライドを温め（これはゼラチン状タンパク質混合物のベッドを硬化させ、洗浄工程中に吸引することが容易になります）。
  4. もはやより15分間、PBS中の0.5％トリトンで細胞を透過性。
  5. PBS-グリシン緩衝液（130mMのNaClを、7ミリモルのNa 2 HPO 4、3.5 mMののNaH 2 PO 4、100mMのグリシン）を準備します。 RTで10分間、1×PBS-グリシンで3回洗浄します。
  6. 準備免疫蛍光緩衝液（IF）：130のNaCl、7mMののNa 2 HPO 4、3.5ミリモルのNaH 2 PO 4、100mMのグリシン、7.7ミリモルのNaN 3、0.1％BSA、0.2％トリトンX-100、および0.05％のTween-20 。
  7. 10分室温でそれぞれについて、IFバッファ内の洗浄3倍。 IF緩衝液中の5％正常ヤギ血清（NGS）でブロック。 RTで2時間 - 1について、200μL/ウェル、IF + 1％ヤギ血清に希釈した一次抗体と共にインキュベートします。 10分ごとにIFバッファ3回洗浄します。
  8. 二次抗でインキュベート本体（1：200）を室温で1時間、IF + 1％NGS、200μL/ウェルに希釈しました。
  9. 10分ごとに、IF緩衝液で3回洗浄します。上のこの段階から暗所でスライドを保管してください。黒のホルダーにチャンバースライドを配置し、そのエッジコンタクト井戸のエッジまでホルダーを介して白リフターをスライドさせることにより、ガラススライドからプラスチック室を持ち上げます。ゆっくり（ホルダーとリフターは、培養スライドが付属しています）室を引き上げます。
  10. 遅い退色防止媒体をマウントし、それを室温で10分間乾燥させます。
  11. 完全に乾燥したら、マニキュアと共焦点顕微鏡を用いて画像にそれらを持つスライドをシールします。 2週間または数ヶ月のために-20℃で4℃でスライドを保存してください。

3DのCaco-2細胞からの3 RNAおよびタンパク質抽出

  1. このようなTGF-β1をとして試験薬剤、（10ng / mLの、1時間）で14日間 - 12用のゲル状のタンパク質混合物上で培養した細胞を扱います。
  2. 治療後、1で細胞を洗浄しますx PBS。ゼラチン状のタンパク質混合物を液化するために30分間氷上で細胞を保管してください。
  3. チルドPBSでウェルを洗浄し、個々の遠心管に細胞を収集します。 10分間500×gで4℃で低速遠心分離を用いて細胞を収集します。標準的な手順を用いてRNAを抽出し、リアルタイムRT-PCRを使用しています。
  4. タンパク質抽出のために、1×プロテアーゼカクテル阻害剤を補充した1×細胞溶解緩衝液を用いて細胞を溶解します。ペレットを細胞溶解緩衝液を添加した後、超音波処理によって細胞を溶解し、10分間7,500×gで、4℃での遠心分離によって細胞破片を除去します。

ウッシングチャンバー活用マウス回腸における5-HT取り込みの4測定：腸の準備と漿膜筋層のストリップ

  1. 安楽死の後、マウスを解剖し、小腸（胃の後と盲腸の前）を削除。三つの部分に小腸を分割します。中央3を捨て、近位の三分の一を使用空腸など、及び回腸遠位として三分の一を使用しています。上皮の損傷を防止するために、その腸間膜添付ファイルから腸を引っ張って避けてください。氷のように冷たいクレブス - リンガー重炭酸塩（KBR）のバッファでそれを覆うことにより、組織切片の寒さを保ちます。
  2. 縦方向にはさみを使用して腸を開きます。 KBRは漿膜筋層のストリッピング前に10分間、1μMのインドメタシンを含むガス発生、氷冷で新鮮に切除された腸のセクションをインキュベートします。
  3. ピンダウン7％アガロースまたは硬化シリコーンエラストマー（0.5センチメートル厚い）を含むプレートに腸セクション（長さ約1センチ）粘膜側。
  4. 下部照明付き解剖実体顕微鏡下で漿膜筋層の層を取り除きます。羽のメスの刃を使用して漿膜筋層の層をカットします。腸の縦軸に沿った層のエッジを得るために、微細な鉗子を使用してください。
    注：ストリッピング手順の間、実体顕微鏡の下の照明はパイエル板と領域を特定し、回避するのに役立ちますエス。
  5. 漿膜筋層のストリッピング終了後、ウッシング半室のピンに注意深く粘膜をマウントします。全体のプロセスの間に、それを引き裂く回避するために、エッジによって削除粘膜組織を保持するように注意してください。

5.平衡化と組織治療

  1. 115のNaCl、25mMのNaHCO 3を、2.4 mMのK 2 HPO 4、1.2mMのCaCl 2を、1.2のMgCl 2、および95％O 2/5％でガス処理し、pH7.4の0.4mMのKH 2 PO 4、：クレブス溶液を調製します37℃でCO 2。浸透圧のバランスを維持するために、粘膜浴にエネルギー基質および10mMマンニトールとして機能する漿膜浴に10 mMグルコースを追加します。
    注：クレブス溶液は、細胞内の5-HTの分解を防止するために、L-アスコルビン酸（100μM）およびパルギリン（100μM、モノアミンオキシダーゼ阻害剤）を添加します。
  2. 頂端（管腔）SIの両方を露出するようにチャンバー内にスライダーを挿入ドとクレブス溶液への組織の基底外側（漿膜）側。
  3. 10分の平衡期間の後、J ミリ秒 （粘膜から漿膜フラックス）は頂端側に30分間フルオキセチンと回腸組織（10μM）を前処理。
  4. 側底側に1時間、TGF-β1（10ng / ml）で組織を治療した後、頂端側の30分間、3 [H] -5-HT（20 nM）をでそれをインキュベートします。

漿膜フラックス（J ミリ秒 ）と、3 [H]組織における-5-HTの蓄積への粘膜の6.定量

  1. 液体シンチレーションカウンターで放射能を測定し、粘膜ツー漿膜（J ms）のフラックス速度を計算するために漿膜リザーバ（5ミリリットルの合計）から0.75 mLのアリコートを収集します。フルオキセチン感受性フラックスはSERT媒介3 [H] -5-HT取り込みを表します。
  2. フラックス期間の粘膜を横切る静水圧差を回避するために、漿膜側と再からサンプルを取ります風呂媒体の同一のボリュームでそれらを置きます。
    注：フラックス計算はエンドサンプル（4.25ミリリットル/ 5 mLを= 0.85）の希釈を補正します。
  3. 3 [H]組織に蓄積-5-HTの定量化のために、氷冷KRB緩衝液で1回、それを洗い、ガラス培養チューブに置き、スライダーから粘膜をディスマウント。
  4. 一晩37℃で10％KOH 0.5mLの中の粘膜をインキュベートします。液体シンチレーションカウンターを用いて（三連で）溶解物の150μLのアリコート中の放射能を測定します。
  5. ブラッドフォード法を用いてタンパク質濃度を測定するために、溶解物の - （5μL3）のアリコートを使用してください。
    注：放射性セロトニンを含む培養培地の10 mLの標準として使用されます。 5-HTは、ピコモル/ mgタンパク質/分として表されている組織内に保持されます。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3DのCaco-2嚢胞における免疫染色は、 図1に示されています。ファロイジンアクチンで染色された3次元嚢胞においてよく区画内腔を示すXY平面内の代表的な画像が図1Aに示されています。内腔に面する側には、頂端面を示しています。 3D環境で培養上皮細胞は、堅牢な上皮表現型をもたらします。アクチンおよびSERTを共染色した12日目、上異なるのCaco-2嚢胞は、 図1Bに示されています。 XY平面（ 図1（a）に示す平面とは異なる）のこの表現では、SERT染色はサブ頂端染色と共に、主に管腔側膜に、表示されます。 図2は、12日目のpostplatingで単層として増殖させたCaco-2細胞と比較して、SERTタンパク質レベルが3D嚢胞に高いことを示しています。これらのデータは、Caco-2細胞の3D培養はNAを模倣するシグナル伝達事象を誘発し得ることを示唆しています的な上皮および増加S...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

完全に分化したCaco-2細胞単層を15、腸管輸送10、11、12、13、14を研究するために、分極した上皮単層として広く用いられてきました。しかし、腸上皮細胞の生理的な組織を模倣するために、3DでのCaco-2文化の発展に大きな関心がありました。腸上皮細胞のための三次元細胞培養モデルの数は、最近、2次元システム16よりも大きな生理的関連性を有する天然の細胞-細胞及び細胞-細胞外マトリックス（ECM）の相互作用を模倣するが開発されています。したがって、（例えば、ラミニン、コラーゲンIV、およびヘパリン硫酸プロテオグリカンなどの）一般的な成分を含有するECMベースの天然ヒドロゲルは、広範囲の3D細胞培...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、原稿の編集と校正を手伝ってくれたRKG研究室の医学博士/博士課程の学生であるクリストファー・マンゼラ氏に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10x PBSATCCATCC®HTB­37&トレード;細胞
10xPBS Carl Zeissマイクロソープ 共焦点イメージング
用<.sup>3[H]-5-HT LabtekII152453顕微鏡用細胞培養
5-HT Gibco70013-032有害物質ではない
95% O2- 5% CO2 シリンダーKPL71-00-27有害物質ではない
寒天(寒天プレート用)FischerBP151-100急性毒性、オラ
寒天(電極用)SigmaG7126-1KG有害物質ではない
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VL有害物質ではない
牛血清アルブミン (BSA)ΣP6148-500G飲み込んだり吸い込んだりすると有害
CaCl2LifeTechnologiesA12380有害物質ではない
Caco-2 細胞Σ A8806-5G有害物質ではない
細胞溶解バッファーフィッシャーBP337-100有害物質
Chabered スライドSigmaS5886-1KG有害物質ではない
コラーゲン Type-1 ソリューションSigmaS8045-500G
電極SigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
ウシ胎児血清 (FBS)コーニング356234細胞外マトリックスとして使用
フルオキセチンキアゲン74104
ゲンタマイシンATCC30-2003細胞培養培地
グリシン細胞シグナル伝達, ダンバース, マサチューセッツ
州 Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco by Life Technologies15070-063
K2HPO4Gibco by Life Technologies15710-064
KOH Gibco by Life Technologies15630-080
L-アスコルビン酸 ライフテクノロジーズのGibco10082147
液体シンチレーションカウンター Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 MetaPhysiologic Instruments, San Diego, CA EM-CSYS-8
MannitolPhysiologic Instruments、カリフォルニア州サンディエゴ P2304
MatrigelPhysiologic Instruments, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2>Physiologic Instruments、カリフォルニア州サンディエゴ DM MC6
マルチチャンネル電圧/電流クランプ生理機器、カリフォルニア州サンディエゴ P2300
NaClPhysiologic Instruments, San Diego, CA P2023-100
NaClフィッシャーサイエンティフィック、ハンプトン、ニューハンプシャー州BP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリS5886
ノーマル ヤギ血清 (NGS、10%)フィッシャーサイエンティフィック、ハンプトン、NHS233
パラホルムアルデヒド (PFA)Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州 P288
Pen-StrpSigma-Aldrich、ミズーリ州セントルイスC3881
プロテインアッセイ試薬Sigma-Aldrich, St Louis, MO10420
プロテイナーゼ阻害剤カクテルMEDOX, Chicago, IL style G- 12300
RNA easy Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
シングルチャンネル電極入力モジュール Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
スナップウェルチャンバー用スライダーSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
リン酸ナトリウム (Na2HPO4)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
水酸化ナトリウム (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β1Perkin-Elmer,Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Trypsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Bio Rad Laboratories, Hercules, CA5000006
Ussing Chamber (chamber only)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing Chamber SystemsSigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州A1296
州 Tween-20

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

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Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

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