粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

Summary

我々は、複数のマイクロ流体チャネル中の粒子の検出及びサイズを多重化するために、符号分割多重アクセス（CDMA）を有する抵抗パルスセンシング（RPS）を組み合わせた統合表面電極ネットワークとマイクロ流体プラットフォームを示します。

Abstract

生物学的サンプルのマイクロ流体処理は、典型的には、空間的に関心のある生物学的特性に基づいて、試料を分別するために、様々な力場下の浮遊粒子の微分操作を含みます。得られた空間分布は、アッセイの読み出しとして使用するために、マイクロ流体デバイスは、多くの場合、より高いコストおよび低減可搬性を有する複雑な機器を必要とする顕微鏡分析に供されます。この制限に対処するために、我々は、マイクロ流体チップ上の異なる位置での粒子の多重検出のための統合された電子センシング技術を開発しました。マイクロ流体CODESと呼ばれる私たちの技術は、1D電気信号に二次元空間情報を圧縮するために符号分割多元接続で抵抗パルスセンシングを兼ね備えています。本稿では、検出するためのマイクロ流体CODES技術の実用的なデモンストレーションを提示し、サイズ培養癌細胞は、複数のマイクロ流体チャネルにわたって分布します。として高速顕微鏡によって検証、当社の技術は、正確に外部機器を必要とせずに、すべての電子密度の高い細胞集団を分析することができます。このように、マイクロ流体CODESは、潜在的に生物学的サンプルのポイント・オブ・ケア検査するのに適している低コストの統合されたラボオンチップデバイスを有効にすることができます。

Introduction

このような液体中に懸濁された細胞、細菌またはウイルスのような生物学的粒子の正確な検出および分析アプリケーション^1、2、3の範囲のための非常に興味深いです。サイズがよくマッチ、マイクロ流体デバイスは、高感度、穏やかなサンプル操作とよく制御微小環境^{4、5、6、7、}この目的のためのユニークな利点を提供します。さらに、マイクロ流体デバイスは、受動的に種々の性質^{8、9、10、11、12}に基づいて、生物学的粒子の不均一な集団を分画するために流体力学とフォースフィールドの組み合わせを使用するように設計することができます。これらの装置ではS、得られた粒子分布は、読み出しとして使用することができるが、空間情報は、ラボのインフラストラクチャに結びつけることにより、マイクロ流体デバイスの実用性を制限する、唯一の顕微鏡を通して一般的にアクセス可能です。したがって、それらはマイクロ流体デバイス上で操作しているように容易に、粒子の時空間マッピングを報告することができる統合されたセンサーは、潜在的にモバイルでの試料の試験のために特に魅力的で低コスト、統合されたラボオンチップデバイスを有効にすることができます、リソースが制限された設定。

薄膜電極は、様々なアプリケーション^13、14のためにマイクロ流体デバイスに統合されたセンサーとして使用されています。抵抗パルスセンシング（RPS）は、電気測定¹⁵から直接、堅牢敏感、およびハイスループット検出機構を提供していますように、マイクロ流体チャネル内の小さな粒子の統合センシングのために特に魅力的です。 RPSは、電解液中に浸漬一対の電極間のインピーダンスの変調は、粒子を検出するための手段として使用されます。粒子が開口部を通過するとき、粒子のオーダーの大きさ、数および電流の過渡パルスの振幅は、それぞれ、カウントおよびサイズ粒子に使用されます。また、センサの幾何学的形状は、感度^{16、17、18、19を}強化するか、マイクロ流体チャネル²⁰内の粒子の垂直位置を推定するために、抵抗パルス波形を整形するために、フォトリソグラフィの解像度を有するように設計することができます。

我々は最近、電気的検出（マイクロ流体^CODES）21によってマイクロ流体符号化直交検出と呼ばれる拡張性とシンプルな多重抵抗パルスセンシング技術を導入しています。マイクロ流体コードはに依存しています抵抗パルスセンサの相互接続ネットワーク、多重化を可能にするために、それぞれ、一意の識別可能な方法で伝導を調節するために微細加工電極のアレイからなります。我々は、特に符号分割多元接続で使用されるデジタルコードに似て、直交電気信号を生成するために各センサを設計した^22（CDMA）通信ネットワーク、個々の抵抗パルスセンサ信号は一意に単一の出力波形から回収することができるようにも信号の場合異なるセンサが干渉する。このように、我々の技術は、最小限に、デバイスに、両方のシステムレベルの複雑さを維持しながら、マイクロ流体チップ上の異なる位置での粒子のモニタリングを可能にする、1D電気信号への粒子の2次元空間情報を圧縮します。

本稿では、実験と計算マイクロ流体CODES技術を使用するために必要な方法と同様に、Rのための詳細なプロトコルを提示しますシミュレートされた生物学的試料の分析におけるその使用からepresentative結果。技術を説明するための例の4多重センサを有する試作装置の結果を使用して、我々は、（2）実験の説明を含むマイクロ流体CODES技術とマイクロ流体デバイスを作成するために、（1）微細加工プロセスのプロトコルを提供します、電子的、光学的、および流体ハードウェア、（3）異なるセンサからの干渉信号を復号するためのコンピュータアルゴリズム、および（4）の検出およびマイクロ流体チャネル中の癌細胞の分析からの結果。私たちは、ここで説明する詳細なプロトコルを使用して、他の研究者が自分の研究のために当社の技術を適用することができると信じています。

Protocol

コーディング電極の1デザイン

注：図1aは、微細電極の3次元構造を示しています。

1. マイクロ流体チャネル^23を符号化するための4つの7ビットのゴールドコードのセットを設計します。
   1. 2つの線形フィードバックシフトレジスタ（LFSRに）、原始多項式を表す各を構築します。
   2. 7ビットメートルの -sequencesの好ましいペアを生成するためのLFSRを使用してください。
   3. 周期的メートルの -sequencesの好ましい組をシフトし、4つの異なるゴールド符号を生成するためのmod 2でそれらを追加します。
2. コーディング電極（ 図1b）のレイアウトを設計します。
   1. 3コーナーに正、負、および参照電極を表す、3電極端子を配置します。
   2. ルート正および負電極は、各マイクロ流体チャネルの両側にトレースします。
   3. 正極および負極を拡張一意に割り当てられたゴールドコード（ 図1c）は、次の電極指のようなマイクロ流体チャネル、。
   4. 正と負電極指との間に基準電極を配置します。
   5. コード領域の外側の電気伝導を最小限にするために、はるかに最も外側の参照電極指からの正負の電極トレースを置きます。

表面電極の2微細加工

注：図2bは、表面電極の製造工程を示す図です。

1. ピラニア溶液で4インチホウケイ酸ガラスウェーハ清掃（98％硫酸：30％過酸化水素水= 5：1）20分間、全ての有機汚染物質を除去するために120℃。その後、残留水を除去するために20分間、200℃のホットプレート上にウエハを配置します。
2. スピナーにウェハを転送します。ウェハ上に2 mLのネガ型フォトレジストを分配し、3の速度でウェハを回転、均一にコートする40秒1.5μmのフォトレジスト層を有するウェハ000 rpmで。
3. 150℃のホットプレート上でウェーハを置き、1分間回転させ、フォトレジストを焼きます。
4. マスクアライナを使用して、クロムマスクを介して365nmのUV光（225ミリジュール/ cm ^2）でのフォトレジストを公開します。
5. 100℃のホットプレート上にウエハを配置し、1分間露光されたフォトレジストを焼きます。
6. 15秒のためのフォトレジスト現像液（RD6）にウェハを浸漬することによりフォトレジストを開発します。ゆっくり脱イオン（DI）水を噴霧し、ウェーハを洗浄します。圧縮窒素を吹き付けて乾燥しました。
7. 電子ビーム金属蒸発器にパターン化されたフォトレジストを有するウェハを置き、3×10 ^-6 Torrのベース圧力とでウエハ上に80nmの厚さの金膜に続いて厚さ20nmのクロム膜を堆積1 A / Sの堆積速度。
8. 部屋の気性で30分間、100％の振幅と周波数40kHzの超音波浴セット中のアセトンへの金属被覆されたウェハを浸し基本となるフォトレジストをエッチングし、リフトオフプロセスを完了するためにature。
9. サイコロ従来のダイシングソーを使用して小片にウェハ。

マイクロ流体チャネルのためのSU-8鋳型の3製作

注：図2aは、マイクロ流体チャネル用モールドの製造工程を示す図です。

1. きれいにし、2.1に記載の同じ手順を使用して、4インチのシリコンウェハを焼きます。
2. スピナーにウェハを転送します。ウェハ上に4 mLのフォトレジストを注ぎます。コートフォトレジストを有するウェーハ。
   1. 15秒間500rpmでウエハをスピン。
   2. 15秒間1000rpmでウェハをスピン。
   3. 60秒が均一に被覆された15μmの厚さのフォトレジスト層を得るためにするために3000rpmでウェハを回転。
3. クリーンルームワイプアセトンに浸した上で、ウェハ面を配置し、裏面とウェハのエッジから残留フォトレジストを除去。
4. ホットPL上にウェハを転送ソフトベーキングのために食べました。まず、1分間、65℃でウェーハを焼きます。その後すぐに95℃のホットプレートにウェハを移動し、2分間焼きます。
5. マスクアライナを使用して、クロムマスクを介して365 nmのUV光（180ミリジュール/ cm ^2）でのフォトレジストを露光します。
6. 2分間、1分間、65℃で曝露した後、次いで95℃でウェハベーク。
7. 現像液中のウェハを浸し、軽く3分間の容器を振ります。その後、イソプロパノールアルコール（IPA）とのウェハを洗浄し、圧縮窒素を吹き付けて乾燥。白色の残留物がウェハ上に表示された場合は、再び開発者にそれを浸すと、より長い時間、乾燥のために開発しています。
8. それを完全に乾燥させるために30分間、200℃のホットプレート上にウエハを焼きます。
9. 均一性を保証するために、ウェハ上の異なる場所でプロフィルメータを用いてパターニングされたフォトレジストの厚さを測定します。
10. 蒸着の技術を利用することにより、モールドウェーハSilanize。 TRの200μLを追加8時間のSU-8の金型ウエハと共に真空デシケーター中でペトリ皿や場所でichlorosilane。

マイクロ流体CODESデバイスの4組立

1. 150 mmの直径ペトリ皿に金型と4インチのシリコンウェーハを配置し、その縁からテーピングすることによってそれを修正。
2. 10の割合でポリジメチルシロキサン（PDMS）プレポリマーと架橋剤の混合：1、およびペトリ皿に混合物を50g注ぎます。 1時間脱ガスし、混合物を真空デシケーター中でペトリ皿に置き、その後、少なくとも4時間（ 図2A）を65℃のオーブンで硬化。
3. メスを用いて硬化PDMS層を切り取り、ピンセットを用いたモールドウエハを、それをはがします。プルーフの原理装置の大きさは、約20mm×7 mmです。その後、生検パンチャーを使用して、マイクロ流体チャネルの入口と出口のためのPDMSを介して1.5ミリメートルの直径を有する穴をパンチ。
4. 私を置くことによって、PDMS部のパターン形成された側をきれいにしてくださいクリーンルーム粘着テープ上のトン。
5. アセトン、IPA、脱イオン水ですすぐことによって表面電極を有するガラス基板を洗浄し、圧縮窒素を使用して乾燥させます。
6. 各部品の微細加工された側が100 mWのに設定されたRFプラズマ発生器内で上に向けて30秒間酸素プラズマ中のPDMSとガラス基板の表面を活性化させます。
7. 光学顕微鏡を用いてガラス基板上に表面電極を有するPDMSマイクロ流体チャネルを整列した後、物理的に接触する2つのプラズマ活性化表面をもたらします。
8. ホットプレートに面したガラス側で、5分間、70℃のホットプレート上でデバイスを焼きます。
9. 半田付けすることにより、ワイヤと電極の接触パッドを接続します。

模擬生物学的サンプルの5準備

1. 培養RPMI 1640中HeyA8ヒト卵巣癌細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、5％CO ₂雰囲気中37℃で彼らは、80％コンフルエンスに達するまで。
2. ガラスピペットを用いて培養フラスコから培地を吸引します。分配した後、細胞を洗浄し、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を吸引除去します。
3. 接着細胞を懸濁し、37℃で2分間（w / v）のトリプシン溶液2ml中の細胞を、0.05％をインキュベートします。その後、トリプシンを中和するために培養培地の4 mLを加え。
4. 遠心機で5分間、100×gで細胞懸濁液を試験管に細胞をペレット化します。その後、完全に上清を吸引除去します。
5. 穏やかにピペッティングすることによって、および機械的に解離細胞塊まで1-2 mLの1×PBSで細胞を再懸濁します。
6. ピペットに細胞懸濁液の少量を描画し、血球計数器を用いて細胞数を数えます。
7. 10 ^{5〜10 6}細胞/ mLの最終細胞濃度でサンプルを調製するためにPBSで細胞懸濁液を希釈します。

6.マイクロ流体CODESデバイスを実行します

注：Fiを提供してグレ3に実験を示しています。

1. 光学顕微鏡のステージ上にマイクロ流体CODESデバイスを配置します。
2. 電子ファンクション・ジェネレータを使用して、チップ上の基準電極400 kHzの正弦波を適用します。
3. 電圧信号は、それぞれの電流信号に変換するために、2つの独立したトランスインピーダンス増幅器に正および負の検知電極を接続します。
4. バイポーラ信号を得るために、差動電圧増幅器を使用して、負の感知電極電圧信号から正の感知電極電圧信号を減算します。
5. 検証と特性解析の目的のために、デバイスの光学的に記録動作に高速度カメラを使用してください。
6. シリンジポンプを用いて一定の流量（50〜1000μL/時間）マイクロ流体CODES装置を介して細胞懸濁液を駆動します。
7. ロックインアンプを用いてインピーダンス変調信号を測定します。
   1. 参考文献を参照AC信号を接続しますロックインアンプのレンス入力。入力信号としてロックインアンプに差動バイポーラ信号を接続します。
   2. ロックインアンプの出力から差動信号のRMS振幅を取得します。
8. さらなる分析のためのデータ収集ボードを介してコンピュータに1メガヘルツの速度でのロックインアンプの出力信号をサンプリングします。

センサ信号の7処理

1. 後処理および復号化のためにMATLABに記録された電気データを転送します。
2. 高周波ノイズ（> 2.5 kHzの）を除去するためにバターワースフィルタ（MATLAB組み込み関数）を使用して、デジタル領域で記録された信号をフィルタリングします。
3. センサ信号からテンプレートコードライブラリを生成します。
   1. デバイス内の各センサに対応する代表非重複コード信号を識別し、別々の波形ベクトルとしてデータセットから、これらの信号ブロックを抽出します。
   2. 各テンプレートコード波形ベクトルを正規化その力によって。信号電力を測定するためにMATLAB組み込み関数（bandpower）を使用してください。
   3. デジタル的に電極上の細胞流速の変動に対応するために、継続時間を変えて正規化されたコード信号のバージョンを作成することにより、テンプレートライブラリを拡張するためにMATLAB関数（リサンプル）を使用してください。
4. フィルタリング波形：（SNR> 12デシベル閾値）の活動をセンサに対応する信号ブロックを特定します。閾値下のSNRの波形はノイズとして扱われることになります。
5. 連続干渉除去に基づく反復アルゴリズム、一般的にマルチユーザCDMA通信ネットワーク^24、25に使用される技術を使用して記録された信号のセンサ活性の個々のブロックを復号します。
   1. スライディング内積を使用して、ライブラリ内のすべてのテンプレートで各信号ブロックの相互相関を計算します。
   2. ラーグを生成するテンプレートを識別するEST自己相関ピークが支配的な個々のセンサコード信号を決定します。自己相関ピークの時間と振幅の両方を記録します。
   3. （ステップ7.5.2で決定）は、測定自己相関ピークの振幅とタイミング情報に基づいて識別コードテンプレートをスケーリングすることによって推定センサーコード信号を構築します。
   4. 元のデータから推定センサーコード信号を減算します。
   5. 残差信号は、数学的には0.5未満である相関係数として定義され、テンプレートライブラリ内の任意の信号に似なくなるまで、7.5.1からの処理を繰り返します。
6. 最適化プロセスを用いて、ステップ7.5からの初期のセンサ信号の推定を絞り込みます。
   1. 各反復から推定個々のセンサ信号を加算して信号を再構成します。
   2. 記録された電気信号との最良適合を生成するために元の推定値の周りの個々のセンサ信号の振幅、持続時間およびタイミングをスイープ最小二乗に基づいて^、26を近似。
7. 光学像に対して電気信号を較正することにより、セルサイズに推定センサ信号の振幅を変換します。

Results

4マイクロ流体チャネルに分散4つのセンサから成るマイクロ流体CODES装置は図1bに示されています。 （1）複数のセルが並行して、電極を通過することができず、（2）細胞の感受性を増加させる電極に近いままであるように、このシステムでは、各マイクロ流体チャネルの断面は、セルの大きさに近くなるように設計されました。各センサは、ユニークな7ビットのデジタルコードを生成するように設計されています。デバイスは、その後、細胞懸濁液を用いて試験しました。 4個々のセンサに対応する記録電気信号は、図4の関連する理想的なデジタルコードで示されています。小さな偏差が存在しない一方で記録された信号は、密接に、理想的な矩形パルスと一致しています。このような偏差は、同一平面上の電極、異なる電極対の間の結合の球状の間に不平等電界を含むいくつかの要因の組み合わせに起因します細胞、ならびにマイクロ流体チャネル内の細胞の一定の流速。我々は、再符号化センサ信号に基づいて、テンプレートライブラリを作成しました。ライブラリ内のすべてのテンプレー...

Discussion

複数の抵抗パルスセンサが以前に、マイクロ流体チップ^{28、29、30、31、32}に組み込まれています。これらのシステムでは、抵抗パルスセンサはどちら^{28、29、30、31、}またはそれらは異なる周波数³²で駆動されるように、個々のセンサを必要と多重化されていませんでした。両方の場合において、専用の外部接続は、チップ上の各抵抗脈拍センサのために必要とし、したがって、センサの多くは、より大きなハードウェアの複雑さなしに統合...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
98%硫酸	BDHケミカルズ社	BDH3074-3.8LP
30%過酸化水素	BDHケミカルズ	社 BDH7690-3
トリクロロシラン	アルドリッチ化学社	235725-100G
NR9-1500PY ネガ型フォトレジスト	フルテックス
スト現像液 RD6	フルテックス
アセトン	BDHケミカルズ	BDH1101-4LP
SU-8 2015年型 ネガ型フォトレジスト	マイクロケム	SU8-2015
SU-8 現像液	Microchem	Y010200
ポリジメチルシロキサン (PDMS)	ダウ コーニング	3097358-1004	シルガード 184 シリコーンエラストマーキット
イソプロピルアルコール	BDH ケミカルズ	BDH1133-4LP
RPMI 1640	コーニング セルグロ	10-040-CV
ウシ胎児血清 (FBS)	セラディム	1500-050
ペニシリン-ストレプトマイシン	アムレスコ	K952-100ML
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)	Corning Cellgro	21-040-CM
PHD 22/2000シリンジポンプ	ハーバード装置	70-2001
HF2LIロックインアンプ	リッヒ機器
HF2TA電流増幅器	リッヒ機器
クリプスTi-U顕微鏡	ニコン株式会社
DS-Fi2 高精細カラーカメラ	株式会社
v7.3 ハイスピードカメラ	Phantom
PCIe-6361 データ収集ボード	National Instruments	781050-01
BNC-2120シールド端子台	National Instruments	777960-01
PX-250 プラズマ処理システム	ノードソン MARCH