多量-PAGE：生体試料中のキャプチャと解決タンパク質複合体のための方法

Summary

新規二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）システムが提示されるに結合アミン反応性タンパク質架橋剤を用いて修飾されていない組織溶解物から天然タンパク質複合体を安定化し、分離するための方法。

Abstract

単一タンパク質やペプチドを精製し、研究するための多くのよく開発された方法があります。しかし、ほとんどの細胞機能は、それらの結合は、非共有結合および精製技術により、容易に乱されるので、多くの場合、調査が困難であるタンパク質複合体の相互作用のネットワークによって行われます。この作業は、二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて修飾されていない組織から天然タンパク質複合体を安定化し、分離する方法を記載しています。組織溶解物は、タンパク質がゲルに短い距離を移動するまで、電流が印加され、非変性ブルーネイティブポリアクリルアミドゲル上にロードされています。移行されたタンパク質を含むゲルストリップは、次いで、切除し、共有結合タンパク質複合体を安定化アミン反応性架橋試薬ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）、と共にインキュベートします。架橋複合体を含有するゲルストリップは、次いでドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲルにキャストされ、そしてT彼複合体が完全に分離されています。この方法は、それが安価で習得が容易であることを意味、技術と最も分子生物学者になじみの材料に依存しています。それは十分に非常に大きな複合体を分離する能力が制限され、かつ普遍的に成功していないものの、この方法は、十分に研究された複合体の多種多様をキャプチャすることができた、と関心の多くのシステムに可能性が適用されます。

Introduction

正常な細胞機能は、タンパク質-タンパク質相互作用^1、2に依存しています。その結果、ヒトの疾患は、しばしば、種々のタンパク質複合体³の組立及び動作の摂動によってマークされます。このような相互作用を特徴付ける能力は極めて重要です。これらの相互作用を検出するための現在の手段は、多くの場合、それらの相互作用パートナーのプルダウンに続いて、標的タンパク質の精製を必要としています。従来の精製は、分画遠心分離、沈殿、及び/又はクロマトグラフィー⁴によって達成されます。これらの方法は、時間がかかる各標的タンパク質のために変更しなければならない、としばしば低い収率につながります。近代的な精製法は^、捕捉分子⁵に結合されたビーズを搭載したカラム上の免疫沈降または抽出し、タンパク質をターゲットにするペプチドタグの融合を伴いますこれは多くのタンパク質に拡張可能であるが「> 6。、それは潜在的にそれらの通常の結合パートナーに対する親和性の異なる構築物をもたらす、標的の配列の改変を必要とする。いくつかのタンパク質-タンパク質相互作用の微妙な性質は、この方法が適用できない場合があり手段多くのシナリオである。さらに、タンパク質 - タンパク質相互作用をマッピングするために使....

Protocol

1.組織調製

1. 4X BN-PAGE試料緩衝液（200mMのビス（2-ヒドロキシエチル）アミノ - トリス（ヒドロキシメチル）メタン（BIS-TRIS）の10mLの、200mMのNaCl、40％のw / vのグリセロール、0.004％ポンソーS、pHが7.2を準備）。
   注：このストック溶液は、事前に行われ、4℃で保存することができます。
2. 1×商用プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む750μLのdH ₂ Oで4倍のサンプルバッファー250μLに希釈します。ボルテックスし、氷上で寒さ。
3. クリーンダウンスホモジナイザーの30ストロークで1 mLの1Xの氷冷BN-PAGEサンプル緩衝液中に標的組織20mgを均質化します。
   注：この実証実験では、標的組織が全体のラットの脳組織です。均質化の後、試料を可溶化した膜タンパク質の電気泳動を可能にするために、中性洗剤等の2％ジギトニンで処理してもよいです。
4. 1.5mLのマイクロ遠心チューブにホモジネートを転送し、そして不溶性の細胞内容物をペレット化するために30分間、14,000×gで遠心分離。 AFTERの遠心分離は、氷の上にきれいなチューブに上清をデカント。
5. ビシンコニン酸（BCA）または類似のタンパク質定量アッセイを用いて上清のタンパク質濃度を測定するために、製造業者の指示に従います。
6. ホモジネート試料（単数または複数）が、界面活性剤が含ま....

Results

この実証実験では、多量-PAGEは、全ラット脳溶解液で行われました。得られた分離されたタンパク質をポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜にブロットし、次いで複合体を形成することが知られているタンパク質に対する抗体でプローブしました。 図1は、2つの手段によってプロトコルの検証を示します。まず、架橋されたタンパク質が観察されたより高い分子量種が架橋試薬によって形成されている意味、還元剤の添加により切断可能であり、プロトコルの他のコンポーネント（ 図1A）に起因しないことを実証しています。第二に、我々は、架橋は、架橋が複合体タンパク質に特異的であり、ゲル上の近接を閉じるために起因するランダム反応性が最小化されることを意味し、界面活性剤（ 図1B）の添加に対して感受性であることを示しています。 図2は、その方法がRESPをキャプチャするために失敗したことを示していますiratory複合体IIが、それ以外は両方可溶性および膜結合複合体を捕捉する.......

Discussion

タンパク質間相互作用は、生き物が行っすべてのタスクのために重要です。このため、彼らは厳しい調査と研究の対象となっています。多量-PAGEは、捕捉分離、およびタンパク質複合体の広い範囲を分析するための新規な方法です。我々は以前に疾患関連タンパク質のαシヌクレイン¹¹のoligimerizationを研究への適用可能性を実証しています。しかし、 図2に示されているように、多くのタンパク質複合体に拡張可能です。タンパク質複合体を研究する他の方法と比較した場合、多量-PAGEは、その単純さと簡潔さのが有利です。組織サンプルから完全に分離されたSDSゲルまでの時間は約8時間です。検出は、典型的なウェスタンブロットによって行うことができるので、プロトコルはプルダウン実験に関連したものよりもはるかに低い検出限界で、未修飾組織溶解物に対して行うことができます。さらに、ほとんどの設備の整った分子生物学的ラボratoriesは少し先行投資と技術を実行することができるようになります。後で説明するように、多量-PAGEに関連した課題の多くは、トラブルシューティング、研究の各タンパ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
ε-アミノカプロン酸	シグマ	A2504
アクリルアミド	Acros有機物	164855000	有毒です。
アクリルアミド/ビサクリラミド 37.5:1 (40%T ストック溶液)	BioRad	161-0148	毒性。
過硫酸アンモニウム		Σ A3678
ヤギからの抗ウサギIgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
ビシンコニン酸アッセイキット	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
ウシ血清アルブミン	ΣA9647
ブタノール	Fisher Scientific	A399-1
化学発光基質キット	ThermoFisher	24078
Coomassie blue G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toxic.
ジメチルスルホキシド	フィッシャーサイエンティフィ	D128-1
ジチオビス(プロピオン酸スクシンイミジル)	サーモサイエンティフィック	22585
ドライ無脂ミルク	LabScientific	M0841
グリセロール	シグマ	G9012
グリシン	フィッシャーサイエンティフィック	BP381-5
ストッププロテアーゼ阻害剤カクテル	サーモフィ	ッシャー78430
酸	フィッシャーサイエンティフィック	A144SI-212	滴定用。苛性。
メタノール	フィッシャーサイエンティフィック	A412-4PVDF	膜活性化用。毒性。
サンタクルス	バイオテクノロジーsc-7011-R
N,N'-メチレンビスアクリルアミド	アクロス有機物	16479	からの
NP40	Boston Bioproducts	P-872
Polysorbate 20 (tween-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Polyvinylidene fluoride transfer membranes	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
塩化カリウム	Fisher Scientific	P217-3
リン酸カリウムモノベーシック	Sigma	P9791
プロテアーゼ阻害剤カクテル	Thermo Scientific	88265
SDS 溶液 (10% w/v)	BioRad	161-0416
塩化ナトリウム	Fisher Scientific	BP358-212
ドデシル硫酸ナトリウム	Sigma	L37771
リン酸ナトリウム モノベーシック	フィッシャーサイエンティフィック	BP329-1
トリシン	シグマ	T0377
トリス ベース	フィッシャー サイエンティフィック	BP152-500
Tris-HCl (0.5 M バッファー、pH 6.8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1.5 M バッファー、pH 8.8)	BioRad	161-0798
名前	Company	カタログ番号	コメント<
strong>Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJソフトウェア	NIH
Synergy H1 マイクロプレートリーダー	BioTek
Gel Former + スタンド	Biorad
マイクロフュージ 22R 遠心分離機	ベックマン・コールター
2 mL ダウンス ホモジナイザー
ボルテックスミキサー	フィッシャー・サイエンティフィ
超音波組織ホモジナイザー	フィッシャー・サイエンティフィ	FB120220