方法論記事

胎児アルコール スペクトルの無秩序のモデルラットにおける海馬機能障害を評価するためにトレース瞬目反射条件づけの使用

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10.3791/55350

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2017年8月5日

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1Department of Psychology, East Carolina University, 2Multidisciplinary Studies Program in Neuroscience, East Carolina University

この記事について

サマリー

トレース瞬目反射条件づけ (ECC) を用いて評価したラット海馬依存学習投与早期新生児の脳の発達の中にアルコールの高濃度 (11.9 %v/v)。一般的には、ECC プロシージャは、多くの心理的な医学の設定の間で脳機能障害を検出するため音の診断ツールです。

要約

新生児ラット生後 4-9 中に比較的高い濃度エチルアルコール (11.9 %v/v) の胎児の脳が急速な組織変化を起こしのようであると時間加速人間の 3 番目の妊娠中に発生した脳の変化。胎児アルコール スペクトルの無秩序 (FASDs) のこのモデルは、量およびいくつかの妊娠中のアルコールの母親で発生するどんちゃん騒ぎの飲むのパターンを模倣した重症の脳損傷を生成します。我々 はトレース瞬目反射条件づけ (ECC)、アルコール露出アダルト子孫に通常見られる長期の海馬の機能不全を評価するために、連合学習の高次変形の使用をについて説明します。90 日齢、齧歯動物は手術記録と準備ができていたと筋電図 (EMG) を測定した刺激的な電極左目のまぶたの筋肉から活動を点滅し、左目の後方は穏やかなショックをそれぞれ配信。5 日間の回復期間後彼らはトレース アルコール曝露し、ラットを制御の連合学習の違いを決定する ECC の 6 セッションを受けた。トレース ECC は、簡単に変更できる同じ機器やソフトウェアを使用して異なる神経系を評価することができますので、多くの可能な ECC 手順の 1 つです。一般的には、ECC 手順別の脳の仕組みと脳を侮辱したさまざまな条件で神経病理学を検出するため、診断ツールとして使用できます。

概要

医療体制が整備され、ヘルスケアへのアクセスが向上した現代においても、アルコールの乱用が依然として世界的な主要な健康課題であることは想像しにくいかもしれません。残念ながら、多量のアルコールを摂取した妊婦からは、胎児性アルコール症候群（FAS）に罹患した子供に見られるように、生涯にわたる深刻な脳損傷や神経発達障害を持つ子供が生まれることが示されています1,2,3。母親によるアルコール使用歴が確認されている女性の場合、胎児は少量のアルコールや、血中アルコール濃度に変動をもたらす異なる飲酒パターンに対しても感受性を持ちます。後者の場合、子供たちはFASに見られるような深刻な形態学的または神経行動学的な破綻を示さないかもしれませんが、軽度から重度まで、生涯にわたる認知機能障害や情緒不安を示す可能性があります3,4。総じて、FASおよびそれより軽度の出生前アルコール起因の破綻は、胎児性アルコールスペクトラム障害（FASDs）という集合体として構成されています。FASDsが完全に予防可能であることは当然ですが、驚くべきことに、アルコールの乱用が一般的である集団においては、依然として神経的および認知的障害の主要な非遺伝的原因となっており、米国の子供たちやフランス、スウェーデンなどの欧州諸国の子供たちの約2%から5%に影響を与えています。米国におけるFAS単独の発症率に関しては、出生1,000人あたり2人から7人で、FASDs全体の発生率はFASよりもはるかに高いことが示唆されています5。

FASD（胎児性アルコールスペクトラム障害）の子どもを対象とした神経画像研究では、脳梁の菲薄化6、小脳虫部前方の低形成7、および海馬の萎縮8などの脳異常が認められることが示されています。これらの脳異常は、FASDの子どもに観察される長期的な神経認知機能障害の一因となっています。母親のアルコール摂取による脳の変化の差異と、特定の神経認知障害のプロファイル（すなわち、種類や程度）の差異を結びつける正確な関連性は、まだ明確に解明されていません。しかし、出生前のアルコール影響に対する感受性を判断する上で、海馬は極めて優れた候補となります。実際に、FASDの子どもは、場所学習9,10や遅延物体想起11など、海馬が介在する行動に欠陥を示します。

FASDのげっ歯類モデルは、FASDの子供に見られる神経認知機能障害に至るメカニズムを解明する上で極めて有用であることが証明されています。我々が採用した確立済みのビンジ曝露モデルでは、生後4日から9日のラットにアルコールを投与します。12,13、脳が急速なシナプスおよび樹状突起接合の形成を行う時期であり、これはヒト胎児の24週に相当し、3週まで続くrd 妊娠期（三分期）14,15,16,17この特定のモデルでは、海馬ニューロンの著しい消失が誘導されます。18,19 および小脳などの多くの他の脳領域のニューロン12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23、それに伴い、異なる領域にわたる認知機能の深刻な低下が認められる21,24,25ラットにおける早期アルコール曝露による認知機能障害は、さまざまな方法で評価することができ、特に以下の方法が有用である。 眼瞼反射古典的条件付け （ECC）。ECCは、学習の根本的な基盤を科学的に調査するために1世紀以上にわたって利用されてきたパラダイムである。26,27 したがって、本手法は胎児期アルコール曝露に起因する有害な神経認知機能への影響をより深く理解するための有用な手法となります。また、非常に柔軟なパラダイムであるため、研究者は多様なECCの手法を用いることができ、それらはいずれも、系統発生的スケールにおける多くの哺乳類種（マウスからヒトまで）および脳発達の異なる過程にわたって検討することが可能です。28,29,30,31さらに、このパラダイムにおける連合学習を媒介する基本的な神経回路は、同様の種における実験的および神経心理学的報告によって裏付けられています。26,32,33,34,35,36,37.

本論文では、眼瞼条件付け（ECC）の一形態であるトレースECCについて実演します（図 1）。背景を明確にするため、より伝統的な形態であるディレイECCと比較します。ECCのパラダイムは、ノーベル賞受賞生理学者であるイヴァン・パブロフが最初に行った、犬を用いた古典的条件付けをモデルにしています。パブロフは、トーンのような特定の刺激は自然に唾液分泌を誘発しないが、トーンが食物の提供に先行し、かつ重なる場合、このトーンと食物の随伴性が維持されていれば、両者を繰り返し提示することで唾液反応を強化できることを発見しました。これはディレイECCの例であり、連合強度は2つの刺激間の即時的な時間的近接性によって媒介され、それによって動物にとって学習条件が最適になるという考えに基づいています。彼はまた、トーンを消してから食物を提供するまでに「トレース（痕跡）」期間を設けるなど、トーンと食物の随伴性の他のバリエーションもテストしました。これら2つの刺激が十分に不連続であると、食物が提供される前に犬が唾液反応を示すことは非常に困難になりました。トーンが消えてから食物が提供されるまでのこの不連続性は、トレースECCの例となります。齧歯類は食物の存在に対して自然に唾液を出さないため、代わりに軽微な電気ショックなどのより種に適切な刺激が使用されます。また、齧歯類はトーンに対して自然に防御的な瞬目反応を示しません。このような背景から、齧歯類のECC処置では、特定のデシベルレベルのトーンを提示し、それを眼輪筋（orbicularis oculi）または側頭筋（temporalis）への軽微な電気ショックとある方法でペアリングして、瞬目反応を誘発させます。トーンは条件刺激（CS）と見なされ、ショックは無条件刺激（US）と見なされます。ディレイECCでは、まずCSが提示され、この刺激が一定時間持続します。その後、USが提供されます。これら2つの刺激は一定時間重なり、その後同時に終了します。USによって誘発される結果としての瞬目反応は、無条件反応（UR）と見なされます。この処置において、齧歯類はこの嫌悪刺激を予期するために、CSが提示された後、USが提供される直前に瞬目反応を示すことを学習します。この学習された瞬目反応は、条件反応（CR）と呼ばれます。トレースECCでは、CSとUSがトレース間隔として知られる刺激のない時間で隔てられており、ディレイECCのように時間的に重なりません。この間隔の間、動物は刺激間の連合要件を解決することを課されます。ディレイECCと同様に、動物がCSの消灯後、USの提供直前に一貫して瞬目反応を示したときに学習が起こります。ある程度の獲得訓練（CSとUSのペアリング）を経て、学習曲線（すなわち、異なるCR測定値に基づく曲線）が形成されます。病変研究および神経イメージング研究により、ディレイECCにおける学習の成功は、小脳-脳幹神経回路が健全であることに依存しているのに対し38,39,40、トレースECCは、海馬41,42,43,44やその他の皮質構造45,46からのさらなる神経関与を必要とする高次処置であることが示されています。トレースCRを正常に獲得するために必要なタイミング関連の要件があるため、このタスクは（正常な被験者にとっても）学習がより困難です。

古典的条件付けのグラフ。電圧対時間。トーン、ショック、および適応反応の間隔を示す。
図 1: トレース眼 blink 古典的条件付け。非挿管コントロール（UC）群の成体ラットを代表する実際の波形を示す。まずトーンCS（85 dB, 2.8 kHz）が 380 ms 間提示される。続いて、刺激が存在しない 500 ms のトレース間隔が設けられる。その後、ショックUS（1.6 mA）が 100 ms 間与えられる。このタスクにおける学習の成功は、条件反応（CR）の時間窓（Total CR period）におけるまばたきの頻度（%）または振幅（volts）が、多くのトレーニングセッションを経て増加することによって定義される。特に、海馬が正常なげんしょ類は通常、ショックUSの開始直前（200-ms窓内）に、よりタイミングの合ったCR（Adaptive CRs）を呈する。トーンCS開始後最初の 80 ms の間の驚愕反応（SRs）および非条件反応（URs）も測定される。十分に訓練されたげんしょ類では、非連合的なSRsは通常低く、または消失しているが、URsは頻度および振幅ともに高くなることが予想される。このタスクでは、げんしょ類がCSの終了とUSの開始との間の関連性を橋渡しすることを学習する必要がある（トレース間隔の間）。したがって、遅延ECCと比較して、習得の難易度は本質的に高くなる。ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

ここでは、ビンジ様（短期間に大量摂取する形式）で投与された新生児期アルコール曝露による機能的な悪影響を、トレースECCの手順を用いて評価し、実証します。この手順では、85 dBのトーンCS（2.8 kHz）を380 ms間提示し、その500 ms後のトレース期間を経て、1.6 mAのショックUSを100 ms間提示します。私たちは、新生児期アルコール曝露の影響を軽減させるためのコリン介入および鉄補充を検討した先行研究において、この行動アッセイの有用性を報告しています18,47。実際に、トレースECCは、新生児期アルコール誘発性の海馬病変を評価するための診断ツールとして利用可能です。ディレイECCと比較した利点は、胎児性アルコールスペクトラム障害（FASD）の人々において損なわれる海馬機能の乱れを検出する感度がより高いことです。

ECCのデモンストレーションは、胎児性アルコール症候群の研究分野を遥かに超えて応用可能です。ECCの多くの変法（例：遅延、トレース、複合、反転）を用いることで、発達過程における学習の個体発生的な違いや、通常の哺乳類における連合学習の神経生物学的基盤に加え、催奇形物質、環境毒素、外傷性脳損傷、神経変性疾患、精神疾患など（これらに限定されない）多くの要因に対する異なる脳系の脆弱性を解明することができます。

プロトコル

注：すべての手順は、イーストカロライナ大学のIACUC（動物実験委員会）が定めるポリシーに従って承認され、実施されました。Long-Evansラットは、メスを種オスと交配させて作成しました。3つの処置群（1.1参照）すべての幼ラットを、同一の母ラットの1腹から得ました。5腹を作成し、生後（PD）3日に各腹を8匹に調整しました。各腹の残りの2匹の幼ラットは、別の実験に割り当てました。オスとメスの両方の後代（曝露群につき1匹ずつ）を本研究に含めました。本研究では計N = 27匹の成体後代を検討しました。なお、ECCトレーニングの1日目に修理不可能な3Tワイヤーリードの断線（3.1.1参照）が発生したため、3匹のラットを除外しました。

1. 群、材料、および溶液の調製

  1. 出生後3日目（PD 3）に、幼仔を母ラットから離し、保温のために温度調節機能付きのウォーター加熱パッドの上に置く。ランダム選択法を用いて、ラットの幼仔を以下の3群のいずれかに割り当てる：(1) アルコール注入群（AI）、(2) 擬似注入対照群（SI）、または (3) 非注入対照群（UC）。承認済みの個体識別手順に従い、番号付けスキームに基づき、30G x 1/2 インチの針を用いて足底に［無毒］インクでタトゥーを施す。タトゥーが完了したら、幼仔を母ラットに戻す。
  2. ポリエチレン（PE）製サイズ50および10を用いて、胃内注入チューブを準備する。チューブの全長はユーザーに応じて調整可能である。
    1. マイクロ解剖用鋏を用いて、3インチのPE-50チューブと6インチのPE-10チューブを切断します。
    2. PE-50チューブを、滅菌済みの22G x 1インチ皮下注射針に慎重に取り付ける。
    3. PE-10チューブの一端を、PE-50チューブの開口端に挿入します。PE-10チューブをPE-50チューブの中へ導くために、PE-10チューブの先端を斜めにカットする必要がある場合があります。
    4. PE-50チューブを小さく（約2〜3 mm）切り、PE-10チューブの開放端に挿入します。これを視覚的なストッパーとして使用します。
    5. 滅菌状態を維持するため、組み立て済みの胃管を新鮮な70%イソプロピルアルコールに浸して保存してください。
  3. 無菌操作を行い、50 mLボトルにストック乳溶液を調製する。このストック乳溶液は、Westら（1984）によって最初に確立された食事フォーミュラに基づいている。48ボトルを-℃で保存してください。18 °C 使用時まで保存する。使用前に、2本のミルクボトルを温水で解凍させる。
    1. 滅菌シリンジを用いて95%エチルアルコール（USP）7.16 mLを採取し、50 mLのミルクボトル1本に加える。これにより、1日最初の2回の授乳でラットの子仔に投与される11.9% v/vアルコール溶液が調製される（2.1.1参照）。アルコールの1日総投与量は5.25 g/kg/日である。これは、強化ミルク溶液を用いて、1回あたりの投与量0.0278 mL/gの容量でアルコールを投与するように設計されている。
      注：この量は、リターサイズおよび3〜4日間の予想使用量に基づいて調整可能です。また、11.9% v/v溶液にするために、添加するアルコールの量も調整する必要があります。
    2. このボトルをよく振り、適切にラベルを貼ってください（すなわち.（牛乳中の11.9% v/v エチルアルコール）。
    3. 2本目のミルク（アルコール未添加）に、適切にラベルを貼ります（例：、ミルクのみ）とし、2.1.1に記載されている通り、補完的に給餌に使用する。
    4. 両方のミルクボトルを冷蔵庫で保存してください。

2. 新生児期アルコール曝露（生後4〜9日）

  1. PD 4から開始し、AI群およびSI群の幼仔に1日合計4回の経管投与を行う。各投与の間隔は2時間とする。AI群の幼仔には実際の溶液を投与するため、それぞれの投与を給餌とみなす。
    1. 1日の最初の2回の投与では、AI群の幼仔に11.9% v/v エタノール含有ミルク溶液を投与し、その後、成長を補うため、1日の最後の2回の投与ではミルクのみの溶液を投与する。
    2. SI群の幼仔には、AI群と同期間のPE-10チューブへの曝露時間を確保するため、溶液を投与せずに2時間おきに4回投与を行う。UC群には投与を行わない。
  2. 幼仔を親ラットから離し、保温のために温度調節機能付きの水加熱パッドの上に置く。各幼仔の体重を測定し、記録（g）する。あらかじめ作成した給餌チャートを参照して、AI群の各幼仔の投与量を決定し、記録シートに記載する。
    1. 11.9% v/v エタノール含有ミルク溶液を温水バスに入れ、よく振盪させる。
    2. 胃内投与の手順：
      1. 70% イソプロピルアルコールで保存していた胃内投与チューブを、温水で十分に洗浄する。
      2. 滅菌済みの1 mLシリンジを用いて、適切な量の溶液を採取する。
      3. 挿入を容易にするため、投与チューブの先端（PE-10側）を新鮮なコーンオイルに浸す。
      4. 幼仔の口から胃までのPE-10チューブの長さを測定する。停止位置の目安となるよう、PE-50ストッパーを調整する。
      5. PE-10チューブを幼仔の口に慎重に挿入し、食道を通り、胃食道接合部括約筋をわずかに通過して胃の中まで進める。幼仔の状態を確認して固定し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げて溶液を投与する。
        注意：誤ってチューブを気管に挿入することを避けるため、前方に進める前に、まずチューブを曲げて軟口蓋に接触させるように方向付ける。チューブはこの領域で自然に反発して食道へと導かれるため、口蓋をガイドとして利用する。そうでない場合、先端が腹側に大きく逸れると気管に入ってしまう可能性がある。挿入位置に確信が持てない場合は、チューブを抜いて挿入を中止し、次回の試行で正しく再挿入することが最善である。
      6. PE-10チューブを慎重に抜き、溶液の逆流や出血、物理的な損傷がないか幼仔を確認する。問題がなければ、幼仔を兄弟個体たちの元に戻す。1匹あたりの全投与手順にかかる時間は約1分未満であり、1腹の投与対象個体4匹（AI 2匹、SI 2匹）の合計時間は約4分である。
      7. SI群の幼仔への胃内投与手順：AI群と同様のPE-10挿入手順に従うが、溶液は投与せず、同じ時間（1分間）保持する。
      8. その腹の最後の個体の処置が完了した後、すぐにすべての幼仔を親ラットの元に戻す。親ラットを次回の投与セッション（2時間後）まで飼育室に戻す。
      9. 胃内投与チューブを滅菌温水で洗浄し、保存用に70% イソプロピルアルコールの中に入れる。各投与セッションの前に、チューブを水で十分に洗浄する。
      10. 2回目の投与セッションについて、2.2（体重測定を除く）から2.2.2.9までを繰り返す。最後の2回の投与では、2.2で決定した投与量と同じ量を用いて、AI群の幼仔にミルクのみの溶液を投与する。
  3. 代表的な成長曲線を得るため、PD 15（開眼時）、PD 21（離乳時）、PD 30、PD 60、およびPD 90（手術時）などの一定の間隔でラットの体重を測定する。

3. 電極の作製および修飾

  1. ラット1匹につき1つの筋電図（EMG）「ヘッドステージ」を作製する（図2）。ヘッドステージにより、眼瞼反射システム（図4）を介して瞬目反応の記録が可能になる。
    1. 3Tサイズのポリテトラフルオロエチレン（PTFE）被覆ステンレス線2本（各5 cm）、10TサイズのPTFE被覆ステンレス線1本（5 cm）、オスコンタクトピン3本、および3穴にカットしたマイクロストリップソケット絶縁体（3.1.4参照）で構成されるヘッドステージを構築する。
    2. 10T線の中央をギザ歯の高精度ピンセットで掴み、平滑高精度ピンセットで両方向に被覆を取り除き、PTFE被覆を剥離させる。この線から被覆の痕跡がすべて除去されていることを確認する。
      1. 10T線の一端を、ギザ歯プラットフォーム付き歯科用プライヤーでコンタクトピンに圧着させる。これが接地線となる。3T線の一端から1〜1.5 mmの位置を平滑高精度ピンセットで慎重に保持する。残りの被覆はそのままにして、1〜1.5 mmのPTFE被覆を剥離させる。露出した3T線の一端にコンタクトピンを圧着させる。
      2. 2本目の3T線についても同様の手順を行う。これら2本の線がEMG記録電極の正極および負極リードとなる。
    3. すべての線に対して引張試験を行い、ピンにしっかりと固定されていることを確認する。線を曲げたり損傷させたりしないよう注意すること。
    4. ワイヤーストリッパーのカッティングブレードを用いて、ソケット絶縁体ストリップのセグメントを3.5穴分（4つ目の穴の中央でカット）に切り出す。このセグメントをちょうど3つの完全な穴に縮小し、必要に応じて両側を研磨する。これにより、3つの完全な穴が確実に確保される。ピンと線のユニットをマイクロストリップの3つの穴に挿入し、圧着端が絶縁体セグメントの下端と面するようにする。10Tアセンブリはマイクロストリップの中央ではなく、外側の穴に配置する必要がある。
  2. 双極刺激電極を改造する（図2）。
    1. ラット1匹につき1つの双極刺激電極を用意する。この電極は、眼瞼反射システムにある刺激アイソレーターを介して、ECC中のショックUSとして少量の電流を印加する。電極はメーカーからツイスト状態で提供されており、シールド処理が施されている。
    2. 2本の金属リードを2〜3回ほど解いてV字型（広がり5 mm）にし、平滑高精度ピンセットを用いて各「 prong（ prong）」を可能な限り真っ直ぐにする。カミソリの刃を用いて、各 prong の先端のシールドを1 mm（周囲全体）削り取る。各 prong に不規則な点や曲がりがないか点検し、必要に応じて、さらにシールドを削り取ることなく修正する。
  3. EMGヘッドステージと双極電極を95%エチルアルコールで洗浄し、製造油や異物を取り除く。乾燥させた後、オートクレーブ滅菌を行う。

ワークスペース上のピン、ハウジング、ワイヤーを含むコネクタアセンブリ部品。
図 2: 筋電図（EMG）記録電極およびバイポーラ電極。完成したEMGヘッドステージ（右、オレンジ色）は、3本のオス接触ピン、2本のサイズ 3T PTFE被覆ワイヤー、1本のサイズ 10T PTFE被覆ワイヤー、および改造したマイクロストリップで構成されている。3本のワイヤーはそれぞれ約 5 cm で、接触ピンに圧着されている。完成したバイポーラ電極（右、白色）は、ねじれを解いて直線状に整え、V字型（5 mm 分離）に成形されている。2本の prong の先端からはシールドが除去されている。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

4. 眼瞼手術の手順（生後90日目）

  1. 材料（詳細な供給情報はMaterialsを参照）、動物、手術区域および非手術区域の準備：
    1. 手術器具および消耗品をオートクレーブで滅菌する。括弧（ ）内の数字は、成体ラット1匹あたり、または1回の測定に必要な概算量を示す：手術器具（ECU IACUC承認に基づき、ラット4匹につき1セット）、ガーゼパッド（3-4枚）、綿棒（5-6本）、20 x 20ラップ（手術1回につき4枚）、磁製るつぼ（1個）、ステンレス製マイクロスパチュラ（1本）、0.9%生理食塩水（洗浄ボトル1本）、ペトリ皿（1枚）、0-80ステンレス製ネジ（ラット1匹につき3本）。
    2. その他の必要な滅菌消耗品：手術用メス刃 No.10（ラット4匹につき1枚）、手術用ドレープ（ラット1匹につき1枚）、獣医用眼軟膏、ポビドンヨード（洗浄ボトル1本）、26G x 3/8" 低圧注射針（2本）、#55ドリルビット付きニッケルメッキピンバイス、ニッケルメッキマイナスドライバー（刃幅 1.8-2 mm）。
    3. 承認済みの研究・医療グレードの消毒剤を使用して、すべての手術器具および消耗品用の滅菌保持エリアを準備する。エリアの準備が整い次第、材料を配置する。
    4. 承認済みの研究・医療グレードの消毒剤を使用して、滅菌手術スペースを準備する。このスペースには、温度調節機能付きの水 heating pad、ラット用麻酔マスクを装着した定位固定装置、ガラスビーズ滅菌器、およびイソフルランガス気化器（麻酔用）を設置する。気化器には、麻酔マスクへのチューブと、非滅菌の動物準備手順を行う別スペースに設置された導入チャンバーへのチューブがあり、各チューブは個別のバルブで制御されている。
    5. 抗菌石鹸で手と腕を十分に洗浄する。滅菌ポーチまたはラップに梱包されたアイテムは、内部に触れないようにしてあらかじめ開封しておく。無菌操作で滅菌手袋を装着し、すべての関連アイテムを手術エリアに移す。ピンバイスにドリルビットを適切な深さ（~ 2 mm）にセットし、ドライバーを準備する。手術が始まるまで、滅菌材料を滅菌ラップで覆っておく。
    6. 電子天秤、電気バリカン、26G x 3/8 in 針付き滅菌1 mLシリンジ（ラット1匹につき1本）、手術記録簿、およびブプレノルフィン（濃度 0.03 mg/mL、投与量 0.1 mL/100 g）を備えた非滅菌スペースを準備する。
      注意：ブプレノルフィンはDEAスケジュールIIIの半合成オピオイドであり、適切に施錠し、記録を付ける必要がある。
    7. イソフルラン気化器のガスレベルが適切か確認し、少ない場合はガスを追加する。ガス流量および混合ノブは、現時点ではオフのままにする。O2タンクを開き、すべての手術に十分なガスがあることを確認する。
    8. 各ラットの体重を測定し、手術記録簿に記録する。ブプレノルフィン投与表を用いて、適切な注入量を決定する。
    9. 導入チャンバーへの気化器バルブを開き、手術マスクへのバルブは閉じたままにする。混合比を3に、流量を3に設定する（キャリアガスとして100% O2を用い、3 L/min の流量で 3% イソフルランとする）。
    10. ラットを導入チャンバーに入れ、適切な麻酔面（呼吸の緩慢化、足底反射の消失、瞬目反射の消失）に達するまで待機させる。麻酔面に達したら、ラットをチャンバーから取り出す。
    11. バリカンを用いて頭部を剃毛し、切開部位と左眼瞼に十分な皮膚を露出させる。必要に応じて、再度導入チャンバーに戻して麻酔面を確認してから、剃毛を再開する。
    12. イソプロピルアルコールとポビドンヨードを交互に3回擦り込み、露出した皮膚を消毒する。必要に応じて、手術台に移す前に再度導入チャンバーに戻し、麻酔面を確認する。
  2. 手術
    1. 麻酔マスクへの気化器バルブを開き、導入チャンバーへのバルブを閉じる。混合比を2.5に、流量を2に調整する（キャリアガスとして100% O2を用い、2 L/min の流量で 2.5% イソフルランとする）。ラットを定位固定装置に移し、標準的な手順に従って切歯バーと耳バーで頭部を固定する（例として Geiger et al., 200849 を参照）。
    2. 術前にブプレノルフィンを皮下注射（SC）し、針（キャップなし）を鋭利物容器に慎重に廃棄する。ラットに滅菌手術用ドレープをかけ、手術部位のみを露出させ、身体の他の部分から隔離する。
    3. サージカルマスク、サージカルキャップ、サージカルガウン、ゴーグル、およびIACUCが要求するその他の個人用保護具を着用する。抗菌石鹸で手と腕を十分に洗浄し、擦り洗いする。無菌操作で滅菌手袋を装着する。
    4. 綿棒を使用して、両眼に少量の眼軟膏を塗布し、乾燥を防ぐ。
    5. ラットが適切な麻酔面を示したところで手術を開始する。手術中は継続的にラットをモニタリングし、定期的にイソフルランレベルを確認する。麻酔に対するラットの反応に基づき、手術中に流量および混合ノブを適宜調整する。
    6. メスを用いて、頭蓋骨正中線に前後方向の切開を加える。この切開により、眼の前方（すなわち前頭骨の露出）およびラムダ縫合線のわずかに後方まで十分な領域を露出させる。
    7. 過剰な出血を起こさないよう注意しながら、頭蓋骨上の骨膜を掻き取る。過剰な結合組織と血液を綿棒で拭き取る。
    8. ピンバイスを用いてドリルビットで穴を開ける。片側の頂骨の冠状縫合線の直後から開始する。血液と骨の破片を綿棒で除去する。スプリンター鉗子で 0-80 ネジのネジ山部分を掴み、時計職人用ドライバーで穴に固定する。皮質脳組織を損傷しない程度に、ネジを締め付ける（通常は3-4回転）。
    9. 4.2.8で述べた手順に従い、さらに2本の 0-80 ネジを頭蓋骨に固定する。1本は反対側の頂骨の冠状縫合線の直後に、もう1本は右ラムダ縫合線の直前に固定する。デンタルセメント（4.2.18参照）を頭蓋骨に固定するには3本のネジで十分であることが分かっており、4本目のネジ（左ラムダ縫合線の前方）を打つとバイポーラ電極の配置を妨げるためである。
    10. ペトリ皿からEMGヘッドステージを取り出す。10Tワイヤーがラットの右側にくるようにヘッドステージを向ける。10Tワイヤーを上方に曲げ、マイクロストリップの下端と平行にする。ワイヤーが前方および後方の 0-80 ネジの周りを回れるよう、右側にわずかに曲げる。手の届く範囲に置いておく。
    11. ［右利きの場合］左手に3インチドレッシング鉗子を、右手に4インチドレッシング鉗子を持つ。4インチドレッシング鉗子で左眼の切開部位の上側の皮膚を掴み、3インチドレッシング鉗子をこの眼の隅に向ける。この隅の皮膚を掴む。3インチドレッシング鉗子で保持したまま、4インチドレッシング鉗子を離す。
    12. 26G x 3/8 in 針を1本取り、眼瞼の隅に刺入する。針を回転させ、刃先（ベベル）が上を向くようにする。プラットフォーム付きマイクロ解剖鉗子を用いて、中央の3Tワイヤーを針の穴に挿入する。完全に挿入せず、数センチメートルだけ穴に通す。このワイヤーが陰極リードとなる。
    13. 4.2.11および4.2.12の手順を行い、外側の3Tワイヤーを眼瞼の中央部分に挿入する。このワイヤーが陽極リードとなる。
    14. 片手で両方の針を掴み、もう一方の手（または鉗子）でヘッドステージを掴む。一連の動作で、ヘッドステージを同じ方向に導きながら、針を眼瞼から引き抜く。必要に応じて、10Tワイヤーが動物の右眼に向くようにヘッドステージを回転させる。3Tワイヤーが交差しないように注意する。先細り鉗子を用いて、陽極リードが眼瞼の中央にあることを再確認する。
    15. ヘッドステージを調整し、両眼の中央に配置し、左右に挿入したネジの前方にある前頭骨上の最適な位置にする。片手でヘッドステージを保持し、もう片方の手で3インチドレッシング鉗子を持つ。10T側の1本または両方のネジの周りに10Tワイヤーを巻き付ける。
    16. 片手に3インチドレッシング鉗子を、もう片方の手に4インチドレッシング鉗子を持つ。3インチドレッシング鉗子を用いて、左側頭部に向かう切開部位の皮膚を掴む。4インチドレッシング鉗子を用いて、皮膚（すなわち浅在筋膜）を側頭筋から分離し、小さな「ポケット」を作る。アイリス剪刀を用いて、さらに結合組織を切除し、左眼の隅に向かってこのポケットのサイズを広げる。深く入りすぎたり、血管を切断したりしないよう注意する。
    17. バイポーラ電極を取り、リード線を側頭筋の曲率に沿わせ、2つの prong（背側および腹側）が左眼の後方に位置し（ビデオ参照）、バイポーラ電極の下端が頭蓋骨の直上に位置するように成形する。コミュテータケーブルプラグ（図3）を妨げなく接続できるよう、ヘッドステージとこの電極の間に十分な距離を確保する。
    18. るつぼにデンタルセメント粉末を注ぐ。まずはるつぼの約1/3から始め、必要に応じて量を調整する。水のような粘度になるまで液体成分を加え、スパチュラで混ぜ合わせる。セメントの粘度が高くなったら、切開部位に塗布し、皮膚のすべての端を少なくとも 1/8 in の幅で覆う。
      1. ラットが両眼を閉じられることを妨げない範囲で、ヘッドステージとバイポーラ電極を固定するのに十分な量のセメントを塗布する。ラットの被毛の不要な部分に垂れたセメントは、すぐに拭き取る。
    19. バイポーラプラグをねじ込んで装着できる（図3）よう、バイポーラ電極のネジ山が少なくとも4-5山セメントで密封されていないことを確認する。ヘッドステージから余分なセメントを除去する。マイクロストリップの上部と3本のコンタクトピンは清潔でなければならない。セメントはすぐに硬化し、これらの電極のコミュテータケーブルプラグへの完全な結合を容易に妨げる可能性がある。部分的に乾燥した余分なセメントは、スプリンター鉗子で除去する。
    20. セメントが硬化し、透明になるまで待つ。マイクロ解剖剪刀を用いて、2本の3Tワイヤーの余分な長さを切り取り、数センチメートルの作業余裕を残す。
    21. 左手にプラットフォーム付きマイクロ解剖鉗子を、右手に先細りマイクロ解剖鉗子を持つ。左側の鉗子で、眼瞼のわずかに前方の3Tワイヤーを掴む。右側の鉗子で眼瞼を押し上げ、3Tワイヤーをさらに露出させて保持する。左側の鉗子を離し、左手でヘッドステージを掴む（この時点で確実に固定されていることを確認する）。右側の鉗子を用いてPTFEシールドの一部を剥離し、ワイヤーが眼輪筋（orbicularis oculi）に接触できるようにする。
      注意：3Tワイヤーを強く引っ張りすぎないこと。コンタクトピンから脱落する恐れがある。ワイヤーが脱落した場合、硬化したセメントを骨折させずに頭蓋骨から取り除くことはできないため、コンタクトピンを交換することは不可能になる。
    22. 4.2.21の手順を行い、2本目の3Tワイヤーから余分なPTFEを剥離する。
    23. 4.2.21で述べた通り、2本のマイクロ解剖鉗子（左にプラットフォーム付き、右に先細り）を持つ。左側の鉗子を一方の3Tワイヤーのわずかに前方に配置し、右側の鉗子が眼瞼の直前に配置されるスペースを確保する。両方の鉗子でワイヤーを掴む。
      1. 右側の鉗子を静止させたまま、左側の鉗子を上方に回転させて眼瞼に向かって回し、「フック」を作る。これを一動作で行う。慎重に右側の鉗子を離し、次に左側の鉗子を離す。
        注意：電極を眼瞼にフックさせることで、角膜に擦れる可能性を最小限に抑えることができる。また、行動テスト段階のあらゆる時点でのワイヤー断線の可能性も最小限に抑えられる。フックを作成しても、すべての動物でワイヤーが角膜に擦れることを完全に防げるわけではないが、通常は、高い瞬目振幅（5.1.7でデジタルオシロスコープにより測定）および術後の日常的な健康観察（過剰な涙、部分的な眼瞼閉鎖、眼損傷による可動性の喪失）に反映されるように、眼損傷の兆候は見られない。ラットに不快感の初期兆候が見られる場合は、イソフルランで麻酔し（4.1.10参照）、電極を再検査および/または再配置する。角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布する。術後の眼合併症について毎日観察し、持続する場合は獣医の診察を受ける。電極の再配置や獣医による治療で改善できない重度の眼合併症を示したラットは、ECU IACUCの標準操作手順に従って人道的に安楽死させる。
    24. 2本目の3Tワイヤーに対して4.2.23の手順を行う。マイクロ解剖剪刀を用いて余分なワイヤーを切り取る。
    25. 片手でラットを耳バーから解放し、もう片方の手で体を支える。頭部に血液や破片がないか検査し、必要に応じて清掃し、術後にブプレノルフィンを注射する。
    26. 回復を助けるため、熱源（温度調節機能付きの水 heating pad など）を備えたリカバリービンにラットを入れる。手術終了時刻を手術記録簿に記入し、手術中のラットに関する特記事項を記載する。適切な呼吸を確認し、胸腹反転（sternal recumbency）の状態になるか、動き始めたら、ホームケージに戻してもよい。
    27. ビーズ滅菌器を用いて器具を再滅菌し（マイクロ解剖鉗子は損傷する可能性があるため除く）、手術エリアが無菌状態に保たれていることを確認する。複数の眼瞼手術を行う場合は、無菌操作を繰り返す。

5. 眼瞼反射古典的条件付けの手順

5チャンネル コミュテータ、EMG、ウェブカメラ、吸音フォーム、音響解析を用いた行動実験のセットアップ。
図3: 眼裂反射条件付け用に改造したオペラント条件付けボックス。ラットは自由に移動する哺乳類であるため、頭部に装着したEMGおよびバイポーラプラグからの電気信号の接触を維持するために、回転式コミュテータが使用される。コミュテータは支柱のアームに取り付けられており、ラットへの負荷を軽減するためにカウンターウェイトが装着されている。ピエゾツイーター（スピーカー）から 2.8 kHz、85 dB のトーンを提示し、これらの値は定期的に校正される。吸音フォームにより環境ノイズの低減を図っている。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

オシロスコープ、ラットからのEMG信号用プリアンプを備えた筋電図セットアップ；実験。
図 4: 眼瞼反射条件付けシステム。このカスタムメイドのシステムは、ラットからの入力信号をフィルタリングおよび増幅するEMGインテグレータユニット、トーンや電気ショックに加えて様々な刺激を提示する刺激制御ユニット、EMG信号のゲインを上げるための各オペラントボックス用プリアンプ、および各オペラントボックス用の刺激アイソレーターで構成されており、様々なレベルの電気ショック（mA単位）を提示できます。馴化およびデータ収集時の診断目的には、デジタルオシロスコープ（標準の眼瞼反射システムには含まれない）が使用されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 術後5日目から慣らしおよび獲得訓練を開始する。ラット1匹につき1日、ハンドリングおよび訓練装置への慣らしを行う。訓練装置は、大型の防音室内に設置された改良型オペラント条件付け装置で構成される（図3）の後、6日間の獲得訓練を行う。馴化および獲得セッションは、カスタムメイドのまばたきシステム（図4).
    1. トレーニングログファイルを作成し、日々の記録に使用するために印刷してください。このログでは、ラットの群をトレーニングボックスに擬似ランダム（またはその他のランダム化手法）に事前に割り当てておく必要があります。
    2. アイブリンクシステムとコンピュータの電源を入れ、アイブリンクソフトウェアを起動します。このバージョンのソフトウェアには、独立して動作する複数のモジュール（またはアプリケーション）があります。Animalモジュールを起動し、被験者情報（セッション番号、個体ID、性別、体重、およびケージ番号）を含む*.RATファイルを作成します。1つのRATファイルで最大4匹のラットを管理でき、これが被験者の1スクワッド（群）となります。適切に数値を入力し、ファイルを保存してください。訓練を行うラットのスクワッドごとに、個別のRATファイルを作成します。
    3. ラットを飼育室から試験室へ移動させ、ドアを閉める。各個体を5分間ハンドリングする。
    4. ラットを所定のボックスに移し、コミュテーターケーブルのEMGプラグおよびバイポーラプラグを、頭部に装着された対応するEMGヘッドステージおよびバイポーラ電極に接続する。
      注意：ラットが初めてコミュテータケーブルに触れた際、暴れたりストレスの兆候を示したりすることがあります。ラットを慎重に扱い、装着に失敗した場合は、ストレスを軽減するために合間に休憩を挟んでください。
    5. 回転する整流子を使用する 360° ラットがボックス内で自由に動き回る間、電気信号の送受信を維持します。本装置は5つのチャネル（EMG電極用3チャネル、双極電極用2チャネル）を備えており、これらがEMGインテグレーターユニットに接続され、そこで生信号のフィルタリングと増幅が行われます。
    6. ラットが自由に動き回っており、コミュテータケーブルアセンブリやスタンションアームの重量による妨げを受けていないことを確認する。必要に応じて、スタンション後方のカウンターウェイトを調整する。すべてのプラグが確実に固定されているか確認し、ボックスの扉を閉じる。すべてのラットに対して同様の接続および確認手順を行う。
    7. オシロスコープを用いて筋電図（EMG）活性を観察し、異常信号（例：高周波および／または高振幅の電気活動）がないか確認するとともに、ビデオ監視システムが利用可能な場合は、それを用いて個体の状態（例：運動活性、環境への感受性、疼痛の兆候）を確認してください。観察された問題点はすべてトレーニングログに記録してください。
    8. ラットをチャンバーに10分間慣らした後、ホームケージに戻す。
    9. オペラントチャンバーの清掃および消毒を行い、床を掃き、テーブルを清掃してください。これらの手順を、すべてのセッション後に実施してください。
  2. 獲得訓練は6日連続（セッション）で行われます。
    1. 1日目：ラットを所定のボックスに移し、コミュテータケーブルのEMGプラグおよびバイポーラプラグを、頭部に装着されている対応するEMGヘッドステージおよびバイポーラ電極に接続する。5.1.6および5.1.7に記載されている手順と同様の操作を行う。
    2. 刺激アイソレーターの電源を入れ、印加電流を0.4mA（ビデオに示されている通り、10mAの4%）に設定します。アイソレーターは、バイポーラ電極の背側および腹側の prong 間に、交互に（すなわち、試行ごとに）電流を流します。これにより、繰り返しの刺激印加による（各筋肉部位での）筋線維の疲労を軽減させることができます。
    3. すべてのラットについて、各試行で誘発されたすべてのまばたき反応および示された耐性を観察する。2試行ごとに、各ラットへのショックUS強度を0.4 mAずつ増加させ、1.6 mAに達するまで（試行7および8で到達）行う。すべてのラットがケージ内で正常に反応しているか、すべての増幅およびゲイン設定が一定であるか、また、それらから適切な電気信号（すなわち、EMGノイズが少ない/小さいこと）が得られているかを再確認する。習得訓練の全日程において、1.6 mAのショックUS強度を使用する。
      注：ラットが特定の電気刺激レベルに対して疼痛反応（例：床から高く跳ね上がる、壁に登る、走り回るなど）を示した場合、試行を一時中断し、前のmA設定（0.4mA低い設定）に戻して2回の試行を行う。その後、再び耐えられなかった高い刺激値を設定し、耐性が見られた場合は、1.6mAに達するまで刺激値を段階的に上げていく。どの値にも耐えられない場合は、訓練期間を通じて、耐性が認められた次の低い値（0.4刻み）を使用する。
    4. オシロスコープを用いて、筋電図（EMG）活性に異常信号がないか観察します（例：、高周波および／または高振幅の電気活動）と、状態を確認するためのビデオ監視システム（例：、運動活性、環境への感受性、疼痛の徴候）。
      注：トレースECCの説明：EMG波形を捕捉した代表的な試行エポックを以下に示す。 図1 また、トレースECCの手順についてはビデオ内で詳細に説明しています。トレース条件付けトレーニングファイルは、10回ごとに（90回のCS-USペア試行と10回のCS単独試行の）計100試行を行うように設定されています。th 試行）を行い、試行間隔の平均は30秒とする。トレーニングセッション全体は約52分間（中断がないと想定した場合）である。すべてのラットはセッション1では未経験であり、数日間のトレーニングが進むにつれて（条件反射の表出によって判定される）異なる学習曲線を示す。
    5. トレーニングを開始する：Blinkソフトウェアモジュールを実行します。指示に従い、適切なRATファイルと「トレース」眼 blink 条件付け用のトレーニングファイルを選択してください。
    6. トレーニングログに開始時刻と実験者の名前を記入する。この時点で、適切なEMG信号が得られているか、電気ショックという非条件刺激（US）に対して良好な瞬目反応（すなわち、高頻度の無条件反応（UR））が見られるか、動物の健康状態、およびハードウェアが適切に機能しているか、すべての活動をモニターする。特筆すべき事項があれば、トレーニングログに記入する。
    7. データ収集は、ソフトウェアによってRAWファイル（ラット1匹につき1日1ファイル）として自動的に記録されます。RAWファイルには、驚愕反応（SR）、無条件反応（UR）、および条件反応（CR）（全体および適応的）のEMG振幅（ボルト）、周波数カウント、潜時、および面積データが含まれています。電気ショックによるアーティファクトがUR期間の最初の100msを覆い隠すため、UR期間の最後の140msのみにURデータが含まれます。
    8. トレーニング終了後、ソフトウェアは自動的に終了します。すべてのラットをトレーニングボックスから取り出し、飼育室に戻してください。
    9. 以降のすべてのトレーニング日にわたって、ステップ5.2.5から5.2.6を繰り返します。ある日のBlinkモジュールを開始する前に、RATファイル内のセッション番号を更新してください。これにより、その日のすべてのラットに対して新しいRAWファイルが作成されます。トレーニングから除外された個体がないと仮定すると、各ラットには6つのRAWファイルが作成されることになります。
  3. RAWファイルを処理し、統計解析用にフィルタリングしたファイルを作成します。
    1. 解析モジュールを実行します。ラットごとの各セッションについて、試行ごとに問題のある試行がないか確認してください。これは、さまざまな理由により不備が生じた可能性がある試行をスクリーニングするために行われます（例：、CS前の過剰なベースライン活動、過剰な体動、電極の脱落、ケーブルや配線の問題など）。本ソフトウェアには、実験者が「不適当な試行（bad trials）」を検出し、フィルタリング後のデータセットから除外することを支援するアルゴリズムが搭載されています。
    2. フィルター後のデータをスプレッドシートプログラムにインポートし、適切な統計解析を行う。

結果

瞬目ソフトウェア測定の多くの種類の大規模な包括的なデータのセットを提供することが可能です。簡潔にするため、本研究で報告代表結果学習とパフォーマンスの適応の CR 割合、適応 CR 振幅、UR 割合 UR 振幅などの措置。適応 CR 期間は、ECC50,51,52トレース中の海馬のシナプス可塑性の強化の結果として、繰り返しのトレーニング、時宜を得た瞬目反応の獲得を表すために選ばれました。UR 対策で新生児のアルコール性の学習の欠損トレース ECC 治療群学習相違点ではなく、動機づけやモーターの違いを示す可能性があります - 私たち連合学習の混乱やショックへの対応に混乱が原因だったかどうかを解明するため選ばれました。各メジャーのデータは、混合性、繰り返し対策要因としてセッション 2 (セックス) x 3 (新生児グループ) x 6 (セッション) を使用して分析しました。新生児の治療のため有意な主効果テューキー事後テストを使用して分析し、重要な相互作用を単純な効果テストを使用して行った。0.05 の最小アルファ レベルを使用してすべての統計解析を実施し、グラフの結果が平均 ± SEM.

分散適応の CR 割合測定に始まり、新生児グループ、 F(2,21) の有意な主効果を示される = 11.69、 p < 0.001、しかしセックスのない有意な主効果 (p = 0.71) またはこれらの要因間の重要な相互作用 (p = 0.20)。予想通り、適応の CR 割合増加トレーニング、 F(5, 105) の六つのセッション = 81.15、 p < 0.001 と新生児グループ間の違いはF(10, 105) セッションのいくつかのレベルに依存していた 4.58、 p = < 0.001。セッション因子を含む他の重要な相互作用はありませんでした。同様に適応の CR 振幅があった再びF(2,21) 新生児グループの有意な主効果 22.32、 p = < 0.001、しかしセックスのない有意な主効果 (p = 0.21) またはこれらの要因間の重要な相互作用 (p = 0.48)。CR 振幅も大幅にトレーニング、 F(5, 105) の六つのセッションを介して増加 59.27、 p = < 0.001 と新生児グループ間の違いはF(10, 105) セッションのいくつかのレベルに依存していた 4.31、 p = < 0.001。全体的にみて、両方 CR 対策グループ手段および訓練の別のセッションで大きく区切られたこれらの手段の間で有意差を示した。グループが大幅に異なることを確認、するテューキー事後テストに unintubated 制御 (UC) と偽挿管 (SI) ラットよりも両方の CR の措置に対して、アルコール挿管 (AI) ラット実行大幅に悪化を示した (p < 0.01 の CR 割合;p < CR 振幅の 0.001)、互いを認められなかった (p> 0.05)。単純な効果のテストは、x セッションの相互作用両方 CR の措置については、AI ラットが UC と SI の両方のラットと比較して始まるセッション 2、セッション 6 を乗せて CRs の買収により著しく損なわれたことを確認重要な新生児グループに対して実行される (すべてp< 0.05)、互いから六つのセッションを通して異ならなかった。唯一の例外は、セッション 3 まで AI ラットと大幅に異なる SI ラットが始まらなかったため適応 CR 振幅をだった。これらの結果は、図 5 a、 5 bのとおりです。

セックス、新生児グループ、またはセッション因子のこれらの要因の相互作用のため UR 対策に有意差はありませんでした。これらの陰性所見では、各グループは私たち同様に、瞬目ショック レスポンスを生成することができたし、(図 6 a、 6 b) 点滅の動機付けや運動の違いによって影響を受ける AI ラットで観察学習の欠損がなかったことを示されています。

figure-results-1
図 5: トレースの取得エアコン応答 (平均 ± SEM).初期のアルコール暴露 (AI グループ) には、適応条件反応 (CR) の割合 (A) と (B) の振幅による著しい影響を受けます。トレース ECC は本質的に取得することは困難、したがって対策は ECC の遅延 - すべてのグループの比較的低い、パーセンテージは FASD21,53の齧歯動物モデルの 80-85% に達する可能性があります。それにもかかわらず、トレース ECC プロシージャは、初期の脳の発達中にはアルコールの影響を受け、海馬で課税の詳細です。* = p < 0.05 * * p = < 0.01、* * * p = < UC と AI のラット間 0.001サンプル サイズは、かっこ内に提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-2
図 6: 無条件反応 (± SEM を意味する) の取得します。瞬目パフォーマンス (UR 割合と UR 振幅) は、グループ間に有意差でした。違いの欠如は、その習得訓練中に使用される衝撃強度に差動 AI ラットの動機は影響しなかったか守備能力点滅 (UC と SI) 両方の制御グループと比較して、衝撃への応答を示します。サンプル サイズは、かっこ内に提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

生後 4-9 中にエチルアルコールを受信したラット新生仔は、成人の海馬障害を出展しました。これらの調査結果は、アルコールが海馬の機能に有害な影響を永続的の催奇形物質であるという考えをサポートします。両方のコントロールのグループのラットと比較してアルコールにさらされたラットのトレースの手順で全体的に、調節された応答が低かった。アルコールに曝露されたラットの学習障害が動機またはモーターの違いの影響を受けなかった (すなわち。、点滅米国の衝撃強度に違いはありません)。

トレース ECC 解明課題による海馬神経病理学の有用な診断ツールですが、このメソッドの結果は、適切なコンテキストに置かれなければなりません。最初に、このデモでキーの手続き型の要素には、発展途上の脳筋活動電位の記録ができ、衝撃、前述のハードウェア、および関心の認知機能を評価する学習パラダイムを使用してその後動物テストの外科的移植を提供する電極ハードウェアの作製に脆弱性の既知のウィンドウの中にアルコールのターゲットを絞った配信が関与しています。プロセスの各段階で注意する必要がある齧歯動物の被験者に不要な/意図しない害を発生しないようにし、定期的に自分の健康の兆候を監視します。彼らの行動の結果は、認知の「ウィンドウ」は、正確には心理的な構造説明とき自分の健康を含むアルコール投与、ハードウェアの欠陥、または外科的移植実験の誤差によって妥協されません。したがって、研究プロセスの各手順の要素は人間の所見に ECC からの結果を推定できることを保障するために健全な方法で実行されなければなりません。第二に、ECC パラダイム連合学習の性質に洞察力を提供しますが、1 つが実験的なデザインで ECC 研究内のこれらのドメインのいくつかのファセットを組み込んでいる限りは、このアプローチを使用して結果を拡張し、広くそれらを他の認知ドメイン - 作業メモリ、短期/長期記憶、意識などに帰するに注意が必要があります。たとえば、このデモはトレース ECC 学習の獲得の段階を検討したが、彼らは訓練を完了した後、ラットにおける記憶保持を調査しませんでした。メモリは、学習だけでなく評価される独立した心理的プロセスです。仕様では、1 つはいずれかの短期または長期の記憶能力を評価するためにメモリの保存期間を組み込むことができます。第三に、並列メモリ システム54の動作に寄与する要因を動機づけ、経験的なおよびホルモンと一緒に同時に動作可能性がありますがあることの認識は、(ECC) の間のアソシエティビティが理解が、その正体は「良い」または「悪い」学習について多くのプロセスの 1 つに不可欠です。最後に、トレース ECC は他の頭脳領域は、CR のいくつかのコンポーネントを仲介することがありますので、純粋な海馬依存タスクではありません。したがって、異なる神経回路および/または研究で使用されている刺激パラメーターの型間の相互作用を理解する必要があります考慮する離散の結果に基づいて影響を作るとき。小脳などもトレース ECC、CR とタイミング、特に ISI は短い期間で CR の地形学的特徴に影響を及ぼす場所に貢献します。トレース ECC は長いトレース間隔 (1,000 ミリ秒) でテストが小脳損傷に人間は影響を受けませんが、短いトレース間隔 (400 ms)34を受給している人の影響を受けます。さらに、マウスの前部帯状回と内側の agranular 地域をターゲットに、背内側前頭前野 (mPFC) の両側性病変は、ウサギの尾 mPFC の破壊生成と同様の結果46CRs55トレースの取得を防ぐ。これらの調査結果はまた小脳脳前頭貢献に種差幹トレース ECC などの駆動の連合学習を考慮の重要性を強調表示します。大人用 500 ms トレース CRs の PD 4-9 悪影響を取得中に新生児のアルコール暴露は47,56本研究でラット、これは 300 ms トレース間隔が発生するアルコール (5 g/kg)57, アルコール曝露ラットにおけるトレース障害がトレース間隔の時間に依存することを示唆の比較的高用量で挑戦されたときにも新生児のアルコールに曝露されたラットに同じケースではありません。

本研究では海馬はトレース CRs の習得における障害を反映して神経に関連する損傷を展示トレース、ECC を媒介と新生児アルコール露出によって挑戦されたとき極めて重要であることを強調しました。ただし、ECC、買収、式、トレース ECC36,40,55,58,59を含む ECC タスクの種類に応じて、CR の地形などの多くの面は特に規核、小脳脳幹回路が欠かせませんそれ警告する必要があります。確かに、この神経回路はトレース ECC60など、ECC の上位フォーム時に CRs の式を運転の海馬と対話します。初期の脳の発達中のアルコール暴露はトレース ECC で海馬の機能、特に効果かどうかは、全く明らかではないです。多くの異なる脳の領域は、mPFC、小脳、海馬18,19,23,47,,6162など初期のアルコール侮辱を受けます、アルコールの妨害が多く ECC プロシージャ間程度と変えることで、機能的に重要な相違点がこれらの構造体の機能は非常にそうです。トレース ECC 研究の結果の解釈に関する落とし穴にもかかわらず動物病変研究42,44,63,64,65でサポートされている、少なくともそのまま海馬に依存するトレース CRs の買収に成功を示されています。この手順はこうして残る新規オブジェクト認識、モリス水迷路学習の場所など、他の海馬依存タスクのよりも理解したトレース条件、それの基礎となる神経回路ははるかに良いために、応答する発達アルコール露出間のリンクを示すために非常に貴重なアプローチおよびコンテキストとトレースの恐怖します。

「測定」認知行動法として ECC 発達 neuroteratology の分野で広範な適用性があります。確かに、当研究室の最近の知見は、発展途上の海馬はアルコールの効果は、さまざまな介入戦略18,47によって緩和されるかもしれませんに機密性の高い概念をサポートします。ここでの主な利点かもしれないということですアルコール誘起トレース ECC 学習の欠損のよりよい理解、彼ら連想学習 - 外海馬機能のほかの問題の予測同じ海馬 neurocircuitry によって媒介される知られている特にそれら。

アプリケーション トレース ECC およびその他の変種 (例えば遅延、反転、差別、化合物) 神経生物学メカニズムと連合学習に関係する神経システムを解明するは、胎児性アルコール研究分野を超えて拡張できます。たとえば、このパラダイムは、症例と6968,アルツハイマー病など神経変性疾患、統合失調症66,67などの精神疾患の動物モデル、薬物乱用70,,7172で注目を受けています。したがっています神経科学を含む多くの心理的な生物医学分野の neurocognitive 機能と機能障害を評価するための研究方法とその利点を明らかに。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、アルコール飲料医療研究財団 (ABMRF) から TDT に助成金によって支えられました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
新生児アルコール曝露
190プルーフエチルアルコール(USP)Pharmco-AAPER225-36000 [ECU医療保管室]に置き換えることができます;USPである必要があります;子犬のための200プルーフエチルアルコール
容器/バスケットてください
コーン油任意の食品グレードの
温水療法ポンプw /パッドGaymarTP-500子犬を暖かく保つために、代用可能
下注射針 22G x 1 インチ、滅菌任意の
皮下注射針 30G x 1/2 インチ、滅菌任意の
イソプロピルアルコール 70%EMD ミリポアPX1840-4 [フィッシャーサイエンティフィック]代用可能、試薬グレード
www.fishersci.com
Long-Evans Rats (Female and Male Breeders)Charles River LaboratoriesN/A [ECU Dept. of Comparative Medicine]年齢と体重を指定する必要があります。価格はこれらの要因により異なります
www.criver.com
Micro Dissecting Scissors, 3.5 in, 23 mm BladesBiomedical Research Instruments11-2200PEチューブの切断用
brisurgical.com
ポリエチレン10チューブ(0.011インチ)IDです。0.024インチO.D.)BD診断システム22-204008 [フィッシャーサイエンティフィック]代用可能
www.fishersci.com
ポリエチレン50チューブ(0.023インチ。IDです。0.038インチO.D.)BD診断システム22270835 [フィッシャーサイエンティフィック]代用可能
www.fishersci.com
調整された給湯器またはベビーミルクボトルウォーマー任意オプション; 冷たいミルク溶液の温めを助ける
ツベルクリンシリンジ、滅菌、1.0 ml任意の
ツベルクリンシリンジ、滅菌、10 ml任意エチルアルコールを引き出すために、または適切なサイズのマイクロピペット
の重量計任意の(グラム単位)が必要です（グラム単位)
NameCompanyカタログ番号Comments
EMGヘッドステージ製造およびバイポーラ電極改質
バイポーラ電極 2ch SS ツイストプラスチックスワン社MS303/2-B/SPC SS を選出2C TW .008"台座の下20ミリメートルのカスタム長さを指定する必要があります
www.plastics1.com
>Centi-Locストリップソケットインシュレーター(別名、マイクロストリップ)ITTキャノン/ ITT相互接続ソリューションCTA4-IS-60*またはCTA4-1S-60*ベンダーによって異なります。www.onlinecomponents.com または www.avnetexpress.avnet.com
デンタルプライヤー、鋸歯状CMF Medicon390.20.05オスのコンタクトピンにワイヤを圧着するために使用
www.medicon.de
マイクロ解剖はさみ、3.5インチ、23ミリメートルブレード生物医学研究機器11-22003Tワイヤを切断するためにのみ使用し、10Tワイヤを切断するとブレードが損傷します。ワイヤストリッパーのブレードを代わりに使用してください
brisurgical.com
PTFEコーティングステンレス鋼線、10T(裸径.010インチ)Sigmund Cohn-Medwire316SS10T
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PTFEコーティングステンレス鋼線、3T(裸径0.003インチ)Sigmund Cohn-Medwire316SS3T
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>Razor BladeAnyバイポーラ電極のプロングから1 mmを剥がすには
Relia-Tac ソケット コンタクトピン、オスクーパーインターコネクト220-P02-100Allied Electronics Cat # 70144761
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ピンセット、高精度、鋸歯状、4 3/4 inElectron Microscopy Sciences78314-00D滑らかなピンセットでPTFEを剥がしながら10Tワイヤーをしっかりとつかむ
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ピンセット、高精度、滑らか、4 3/4 inElectron Microscopy Sciences78313-00B
www.emsdiasum.com
セット、超微細チップ、4 3/4 inElectron Microscopy Sciences78510-03Tワイヤーの一端から1mmのPTFEを剥がす。滑らかなピンセットでシールド部分をつかむ
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ワイヤーストリッパー、16-26 AWG任意ブレードの端を使用してマイクロストリップをカットします
名前<>strong>会社カタログ番号コメント
まぶたの手術
外科器具(高品質ステンレス鋼)
2 x ドレッシング鉗子、鋸歯状の生物医学研究機器30-1205用することができます; 手術トレイ
brisurgical.com ドレッシング鉗子の外側の電極/ネジをつかむための余分な鉗子
、鋸歯状の生物医学研究機器30-1200の 3代用可能
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Instrument TrayBiomedical Research Instruments24-1355代用可能
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Knife Handle No. 3, 5 inBiomedical Research Instruments26-1000代用可能
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マイクロ解剖鉗子、3.5インチ、ファインポイント生物医学研究機器10-1630代替可能
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マイクロ解剖鉗子、3.5インチ、スムースプラットフォーム(0.3 x 5 mm)生物医学研究機器10-1720
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マイクロ解剖はさみ、3.5インチ、非常に繊細な、15mmブレード生物医学研究機器11-2000代用可能
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プレーンスプリンター鉗子、3.5インチ 生物医学研究機器30-1600代用可能
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>#10 #3ハンドル用ステンレス鋼外科用ブレード、滅菌ステンレス鋼
プラスチック1、Incで0-80 x 0.1250-80 x 0.125代用可能
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アルコール調製パッド、滅菌フィッシャー・サイエンティフィック22-363-750 [フィッシャー・サイエンティフィック代用可能
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>ベタジン ポビドン-ヨウパデュー・フレデリック社6761815101 [Fisher Scientific]代用可能
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>Betadine Povidone-Yodine Prep PadsMoore Medical19-898-946 [Fisher Scientific]代用可能
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、オートクレーブ可能通常、ピン
バイス、#55(0.052インチ)任意の金属は、錆びや腐食
ゼパッド、フィッシャーサイエンティフィック22-362-178の2インチ×2 [フィッシャーサイエンティフィック]に置き換えることができます
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汎用ラテックス/ニトリル/ビニール手袋
ガラスビーズ滅菌器任意の手術間の滅菌器具
温水療法ポンプ / パッド x 2GaymarTP-500代用可能; 別々のポンプが推奨されます - 手術のための1、回復のための1
下注射針 26G x 3/8 で、滅菌任意の
イソフルランVedcoNDC 50989-150-12Manfacturerは代用できます。獣医の承認が必要な場合があります
イソフルラン気化器システム、卓上、非再呼吸パークランド科学V3000PK代用することができます
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>ジュエラーズドライバー 1.8-2 mmブレード付き任意の金属は錆びや腐食に耐える必要があります
オルソジェットBCAパッケージ(歯科用セメント)Lang DentalB1334には、粉末 (1 ポンド) と液体が含まれています
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Oxygen Tank with Pressure Regulator, LargeLocal supplier
Porcelain Crucible, High-Form, Glazed, 10 mlCoorsTek, Inc.07-965C [Fisher Scientific]Fisher FB-965-I Wide-Form Crucible
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Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment, SterileHenry Schein CompanyNC0144682 [Fisher Scientific]で代用できます
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>Quatricide PV-15PharmacalPV-15抗菌消毒剤; 代用可能?
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ラット ステレオタシー手術用ガス麻酔マスク Stoelting Company51610
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Rat Stereotaxic Apparatus w/ Ear Bar (45 Degree)鼓膜の損傷を防ぐために、
Roboz Surgical Instrument MilkRoboz SurgicalNC9358575 [Fisher Scientific]代用することができます。オートクレーブ中に器具を潤滑するため
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げっ歯類のヘアトリマー任意の
塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS641-500 [フィッシャーサイエンティフィック]0.9%生理食塩水を作るため; 試薬グレード;USP
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Stainless Steel Microspula (ブレード: 0.75 L x 0.18 in.W)フィッシャーサイエンティフィック21-401-15 [フィッシャーサイエンティフィック]置換可能
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>Starrettピンバイス、0.000インチ - 0.055インチ任意のニッケルメッキまたは同等の錆びや腐食に耐えるために推奨
滅菌手術用手袋任意の
滅菌ラップ、20インチ x 20インチ、オートクレーブ可能Propper Manufacturing11-890-8C [Fisher Scientific]オートクレーブ可能な消耗品を包み込み、手術中に無菌フィールドで役立ちます
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Surgical Drape, Sterile/AutoclavableAnyAny May to cut to cut to size for rats
Surgical Gown*Any*If required by IACUC
Surgical Mask任意の
ツベルクリン注射器、滅菌、1.0 ml任意の
体重計任意の解像度(グラム単位)が必要です<
strong>名前Companyカタログ番号コメント
Eyeblinkシステムおよびコンポーネント(4ネズミシステムを想定して)
5チャネル整流子×4スワン株式会社SL2 + 3C
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バイポーラ電極ケーブル、デュアル305 x 4プラスチックワン、株式会社305-305 80CM TT2 (C)ラットのバイポーラ電極と整流子にプラグエンドを提供します。変更する必要があります
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Cable, 5 Channel, Shielded, 26 AWG x 4Any整流子ケーブルを製造するには、これはオペラ
ントテストボックス用のスクラッチチャンバーから作る必要があります。 24 H x 23 W x 14 D in) x 4Med-Associates代用可能; 内寸は、音響泡のための部屋で、オペラントテストボックスを快適にフィットさせる必要があります; ファンとフィット - 55-60 dB
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Eyeblink システムとソフトウェアJSA デザインN/A独自の研究室向けにカスタマイズ
熱収縮チューブ (3/16 インチ、1/4 インチ、3/8 インチ、直径 1/2)任意変更された整流子ケーブルを保護するため、端部をはんだ付けし、スプライス
メラミン トリプル ピーク アコースティック フォーム ブラック ハイパロン (24 x 48 インチ)McMaster-Carr9162T5代用可能; 4 つのハウジング チャンバーに合うようにカット
www.mcmaster.com
オペラントテストボックス(外装12.5 L x 10 W x 13.5 in H)、コンプリート x 4Med-AssociatesENV-007 カスタムパッケージステンレス製グリッドフロアとカスタムトップ付き(整流子ケーブルの中央に3つの穴)
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>オシロスコープ(オプション)任意推奨最小スペック:200 MHzアナログ帯域幅、1 GS / sリアルタイムサンプリング、4チャンネル。www.picotech.com
/td>
Piezo Tweeters (Speakers) x 4 (7 x 3 in)MCM Electronics53-805eyeblink system (2500 Hz - 25 KHz)の周波数範囲仕様と一致する必要があります
www.mcmelectronics.com
はんだ付けステーション、はんだ、フラックス、TinnerAnyメスソケット(オスのrelia-tacコンタクトピンに適合)およびバイポーラプラグに26AWGケーブルをはんだ付けするため
刺激アイソレータ×4WPIインターナショナルA365これらのユニットは16-9Vアルカリ電池で動作します。適切な充電式バージョン(A365R)が利用可能です
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トライポーラ電極ケーブルSL3C整流子×4用1つ、 株式 会社。335-335 80cm TT3 CラットのEMGヘッドステージと整流子にプラグエンドを提供します。変更する必要があります
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USB LEDライト×4USBベースのライトは、ラットからのEMG信号で電気的な「ノイズ」を引き起こさないでください
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webcams x 4、監視ソフト
の使用を避け任意の 皮を使用するために使用することができます 解像度を参照してください ピン の 4 で代ねじ.を置換できます。素 綿棒ガー 皮任意の 45 度のバーをお勧めしますプラスチックプラスチック MS Windows OSを実行しているPCなら何でも

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