方法論記事

胎児アルコール スペクトルの無秩序のモデルラットにおける海馬機能障害を評価するためにトレース瞬目反射条件づけの使用

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2017年8月5日

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1Department of Psychology, East Carolina University, 2Multidisciplinary Studies Program in Neuroscience, East Carolina University

この記事について

サマリー

トレース瞬目反射条件づけ (ECC) を用いて評価したラット海馬依存学習投与早期新生児の脳の発達の中にアルコールの高濃度 (11.9 %v/v)。一般的には、ECC プロシージャは、多くの心理的な医学の設定の間で脳機能障害を検出するため音の診断ツールです。

要約

新生児ラット生後 4-9 中に比較的高い濃度エチルアルコール (11.9 %v/v) の胎児の脳が急速な組織変化を起こしのようであると時間加速人間の 3 番目の妊娠中に発生した脳の変化。胎児アルコール スペクトルの無秩序 (FASDs) のこのモデルは、量およびいくつかの妊娠中のアルコールの母親で発生するどんちゃん騒ぎの飲むのパターンを模倣した重症の脳損傷を生成します。我々 はトレース瞬目反射条件づけ (ECC)、アルコール露出アダルト子孫に通常見られる長期の海馬の機能不全を評価するために、連合学習の高次変形の使用をについて説明します。90 日齢、齧歯動物は手術記録と準備ができていたと筋電図 (EMG) を測定した刺激的な電極左目のまぶたの筋肉から活動を点滅し、左目の後方は穏やかなショックをそれぞれ配信。5 日間の回復期間後彼らはトレース アルコール曝露し、ラットを制御の連合学習の違いを決定する ECC の 6 セッションを受けた。トレース ECC は、簡単に変更できる同じ機器やソフトウェアを使用して異なる神経系を評価することができますので、多くの可能な ECC 手順の 1 つです。一般的には、ECC 手順別の脳の仕組みと脳を侮辱したさまざまな条件で神経病理学を検出するため、診断ツールとして使用できます。

概要

医療体制が整備され、保健サービスへのアクセスが向上した現代においても、アルコール乱用が依然として世界的な主要な健康問題であることは想像しがたいかもしれません。残念ながら、多量のアルコールを摂取した妊婦からは、胎児アルコール症候群（FAS）に罹患した人々に見られるように、深刻な脳損傷や生涯にわたる神経発達障害を持つ子供が生まれることが示されています1,2,3。母親のアルコール使用歴が確認されている女性の場合、発達中の胎児は、少量のアルコールや、血中アルコール濃度にさまざまな差を生じさせる異なる飲酒パターンに対しても感受性を持ちます。後者の場合、子供にFASのような深刻な形態学的または神経行動学的な異常は見られないかもしれませんが、軽度から重度まで、生涯にわたる認知障害や情緒不安を示す可能性があります3,4。総じて、FASおよびそれより軽度の出生前アルコール媒介性障害の集合体が、胎児アルコールスペクトラム障害（FASDs）を構成します。FASDsが完全に予防可能であることは驚くべきことではありませんが、驚くべきことに、アルコール乱用が非常に一般的である集団において、FASDsは神経および認知障害の主要な非遺伝的原因であり続けており、米国の幼児やフランス、スウェーデンなどの欧州諸国の子供たちの約2%から5%に影響を及ぼしているという推定結果が出ています。米国におけるFASのみの発生率に関しては、出生1,000人あたり2〜7人であり5、これはFASDsの全体的な発生率がFASよりもはるかに高いことを意味しています。

FASD（胎児性アルコールスペクトラム障害）児を対象とした神経画像研究により、脳梁の薄化6、小脳前虫部の縮小7、および海馬の縮小8などの脳の異常が認められることが示されています。これらの脳の異常は、FASD児に観察される長期的な神経認知機能障害の一部に寄与しています。母親のアルコール摂取による脳の変化の変動と、特定の神経認知機能障害のプロファイル（すなわち、種類や程度）の変動を直接的に結びつける正確なメカニズムは、まだ明確に解明されていません。しかし、出生前のアルコールによる影響に対する感受性を決定する上で、海馬は非常に優れた候補となります。実際に、FASD児は、場所学習9,10や遅延物体想起11など、海馬が介在する行動に欠陥を示します。

胎児アルコール症候群（FASD）のげっ歯類モデルは、FASDの子どもに見られる神経認知機能障害を招くメカニズムを解明する上で極めて有用であることが証明されています。我々が採用した、確立されたビンジ曝露モデルでは、生後4日から9日にかけてラットにアルコールを投与します。12,13脳が急速にシナプスおよび樹状突起の接合形成を行う時期であり、ヒトの胎生24週に相当し、3まで続くrd 妊娠期（三ヶ月単位）14,15,16,17この特定のモデルでは、海馬ニューロンの顕著な脱落が誘導されます。18,19 および小脳など、他の多くの脳領域にあるニューロン12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23、および異なる領域にわたる認知機能の深刻な低下を伴い21,24,25ラットにおける早期アルコール曝露による認知機能の低下は、さまざまな方法で評価でき、特に以下の手法が用いられます。 眼瞼条件付け（アイブリンク古典的条件付け） （ECC）。ECCは、学習の根本的な基盤を科学的に調査するために1世紀以上にわたって活用されてきたパラダイムである。26,27 したがって、本手法は胎児期アルコール曝露から生じる有害な神経認知的な影響をより深く理解するための有用な方法となります。これは非常に柔軟なパラダイムであり、研究者はさまざまな電気生理学的細胞記録（ECC）の手法を用いることができ、それらは系統発生学的スケールに沿った多くの哺乳類種（マウスからヒトまで）、および脳発達の異なる段階において検討することが可能です。28,29,30,31さらに、このパラダイムにおける連合学習を媒介する基本的な神経回路は、同一種における実験的および神経心理学的な報告によって裏付けられています。26,32,33,34,35,36,37.

ECCの一形式であるトレースECCを本論文で実演します（図1）。背景を説明するため、より伝統的な形式である遅延眼瞼条件付け（delay ECC）と比較します。ECCのパラダイムは、ノーベル賞受賞生理学者のイヴァン・パブロフが最初に行った犬を用いた古典的条件付けに基づいてモデル化されました。パブロフは、音などの特定の刺激は自然に唾液分泌を誘発することはないが、音が食物の提示に先行し、かつ提示時間と重複する場合、この音と食物の随伴性が維持されていれば、両者を繰り返し提示することで唾液反応を強化できることを発見しました。これは遅延ECCの一例であり、2つの刺激の間の即時的な時間的連続性によって連合強度が媒介され、それによって動物にとって学習条件が最適になるという考えに基づいています。彼はまた、音を止めてから食物を提示するといった、音と食物の随伴性の他のバリエーションについても検証しました。 "トレース" 餌を与える前の期間である。これら2つの刺激が十分に不連続であった場合、餌が提供される前に犬が唾液分泌反応を示すことは大幅に困難になった。このように、トーンの停止と餌の提供との間の不連続性は、トレース（痕跡）条件付け（ECC）の一例となる。齧歯類は、餌の存在に対して自然に唾液を分泌しないため、代わりに軽微な電気ショックなどの、より種に即した刺激が用いられる。また、齧歯類はトーンに対して自然に防御的な眼瞼反射反応を示さない。このような背景から、齧歯類のECC手順では、特定のデシベルレベルのトーンを提示し、それを何らかの方法で眼瞼筋への軽微な電気ショックとペアリングする。眼輪筋) またはその 側頭筋 眼瞼反射を誘発するための筋肉。このトーン（音調）は、 条件刺激 (CS) 一方で、ショックは～と見なされる 無条件刺激 （米国）。遅延条件付け（delay ECC）では、まず条件刺激（CS）が提示され、この刺激が一定時間持続します。その後、無条件刺激（US）が提示されます。これら2つの刺激は一定時間重なり、その後同時に終了します。このとき、USによって誘発される瞬目反応は、 無条件反応 （UR）。この手順では、げっし類は、嫌悪刺激を予測するために、CSの提示後、USの直前に瞬目反応を出すことを学習します。この学習された瞬目反応は、～と呼ばれます。 条件反応 (CR)。トレース条件付け（trace ECC）では、条件刺激（CS）と無条件刺激（US）の間に、刺激が存在しない一定の期間があり、これは～と呼ばれます。 トレース 間隔が設けられており、遅延眼瞼条件付け（delay ECC）のように時間的に重複することはありません。この間隔の中で、動物は刺激間の連合上の要件を解決することが課せられます。遅延ECCと同様に、動物がCS（条件刺激）の消去後、かつUS（無条件刺激）が提示される直前に一貫して瞬目反応を示すようになったときに、学習が成立したとみなされます。一定回数の獲得訓練（CSとUSのペアリング）を経て、学習曲線（すなわち、異なるCR測定に基づく曲線）が形成されます。病変研究および神経イメージング研究により、遅延ECCにおける学習の成功は、小脳と脳幹の神経回路が健全であることに依存していることが示されています。38,39,40一方で、トレース条件付け（trace ECC）は、海馬によるさらなる神経的な関与を必要とする高次の手続きである。41,42,43,44 およびその他の皮質構造45,46微弱な条件反応（CR）を正常に獲得させるには、タイミングに関する要件が求められるため、このタスクは（健常被験者にとっても）習得がより困難です。

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図1：トレース眼瞼古典的条件付け。非挿管コントロール（UC）群の成体ラットを代表する実際の波形が示されている。まず、トーンCS（85 dB、2.8 kHz）が380 msの間提示される。続いて、刺激のない500 msのトレース間隔が設けられる。その後、ショックUS（1.6 mA）が100 msの間与えられる。このタスクにおける学習の成功は、条件反応（CR）の時間窓（Total CR period）における眼瞼反射の頻度（%）または振幅（V）が、多くのトレーニングセッションを経て増加することによって判断される。特に、海馬が正常なげん類は、通常、ショックUSの開始直前（200-msの窓内）に、タイミングの合ったCR（Adaptive CRs）をより多く示す。トーンCS開始後の最初の80 msにおける驚愕反応（SRs）および非条件反応（URs）も測定される。十分に訓練されたげん類では、非連合的なSRsは通常低くなるか、あるいは認められないが、URsは頻度および振幅ともに高くなることが予想される。このタスクでは、げん類がCSの終了とUSの開始の間の関連性（トレース間隔中）を橋渡しすることを学習する必要があるため、遅延ECC（遅延古典的条件付け）と比較して本質的に習得が困難である。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ここでは、ビンジ様の手法で投与された新生児期アルコール曝露がもたらす機能的な悪影響について、トレースECC法を用いて実証します。この手法では、85 dBのトーン条件刺激（CS、2.8 kHz）を380 ms間提示し、続いて500 msのトレース期間を挟み、1.6 mAのショック無条件刺激（US）を100 ms間提示します。我々は、新生児期アルコール曝露の影響を軽減させるためのコリン介入および鉄分補給を検討した先行研究において、この行動解析法の有用性を報告しています18,47。実際、トレースECCは新生児期アルコールに起因する海馬病理を評価するための診断ツールとして利用可能です。ディレイECCと比較した利点は、胎児性アルコールスペクトラム障害（FASD）を持つヒトにおいて損なわれている海馬機能の乱れをより感度高く検出できる点にあります。

ECCの実証は、胎児アルコール症候群の分野を大きく超えて広がっています。ECCには多くの変異体があり（例：、（遅延、トレース、化合物、逆転などの）手法を用いることで、発達過程における学習の個体発生的な差異や、正常な哺乳類における連合学習の神経生物学的基盤、さらには（催奇形性物質、環境毒素、外傷性脳損傷、神経変性疾患、精神疾患を含むがこれらに限定されない）多くの要因に対する様々な脳系の脆弱性を解明することが可能です。

プロトコル

注：すべての手順は、East Carolina University IACUCによって定められた方針に従って承認され、実施されました。Long-Evansラットは、雌を雄の種種ラットと交配させて得ました。3つの処置群（1.1参照）すべての幼若個体は、同一の母ラットの一腹子として得られました。5腹の仔ラットが産まれ、生後（PD）3日目に各腹8匹に調整（cull）しました。各腹から残りの2匹の仔ラットを別々の実験に割り当てました。雄雌両方の後代（曝露群あたり1匹）を研究に含めました。本研究では、合計N = 27匹の成体後代を検討しました。3匹のラットは、ECCトレーニングの1日目に修理不可能な3Tワイヤーリードの断線（3.1.1参照）があったため除外されました。

1. 群、材料、および溶液の調製

  1. 出生後3日目（PD 3）に、幼ラットを親ラットから分離し、保温のために温度調節機能付きのウォーターヒーティングパッド上に置く。ランダム選別法を用いて、幼ラットを以下の3群のいずれかに割り当てる：(1) アルコール注入群（AI）、(2) 擬似注入コントロール群（SI）、(3) 非注入コントロール群（UC）。番号管理に基づき、30G x 1/2 インチの針を用いて足底に（無毒）インクでタトゥーを入れるなど、承認済みの個体識別手順を行う。タトゥー処理が完了した後、幼ラットを親ラットに戻す。
  2. ポリエチレン（PE）サイズ50および10を用いて、胃内チューブを準備します。このチューブの全長はユーザーに応じて決定し、適宜調整可能です。
    1. マイクロ解剖用はさみを使用して、PE-50チューブを3インチ、PE-10チューブを6インチの長さに切断します。
    2. PE-50チューブを、滅菌済みの22G x 1インチ皮下注射針に慎重に取り付けます。
    3. PE-10チューブの一端を、PE-50チューブの開口端に挿入します。PE-10チューブをPE-50チューブ内に導くために、PE-10チューブの先端を斜めにカットする必要がある場合があります。
    4. PE-50チューブを小さく（約2〜3 mm）切り取り、PE-10チューブの開口端に挿入します。これを視覚的なストッパーとして使用します。
    5. 完全な胃管挿入チューブを、無菌状態を維持するため、新鮮な70%イソプロピルアルコール中に保存してください。
  3. 無菌操作を行い、50 mLボトルにストックミルク溶液を調製する。このストックミルク溶液は、Westら（1984年）によって最初に確立された食事処方を基にしている。48ボトルを- で保存する。18 °C 使用時まで保存する。使用前に、温水を用いてミルク2本を解凍する。
    1. 滅菌シリンジを用いて95%エタノール（USP）7.16 mLを吸い取り、50 mLのミルクボトル1本に加えます。これにより、11.9% v/vのエタノール溶液が調製され、これをラットの幼獣に1日の最初の2回の給餌で投与します（2.1.1参照）。エタノールの1日あたりの総投与量は5.25 g/kg/dayとなります。これは、濃縮ミルク溶液中において、一定の容量（1回あたり0.0278 mL/g）でエタノールを投与するように設計されています。
      注：この量は、産子数および3〜4日間の予想使用量に基づいて調整可能です。また、11.9% v/v溶液とするために、添加するアルコールの量も調整する必要があります。
    2. このボトルをよく振った後、適切にラベルを貼ってください（すなわち（牛乳中11.9% v/v エタノール）。
    3. 2本目のミルクボトル（アルコール未添加）に、適切にラベルを貼ります（例：（ミルクのみ）とし、2.1.1に記載されている通り、補足栄養として使用する。
    4. 両方のミルクボトルを冷蔵庫で保存してください。

2. 新生児期のアルコール曝露（生後4〜9日目）

  1. PD 4から開始し、AI群およびSI群の仔ラットに1日計4回の経管投与を行う。各投与の間隔は2時間とする。AI群の仔ラットには実際の溶液を投与するため、各投与は給餌としてカウントされる。
    1. AI群の仔ラットには、1日の最初の2回の給餌時に11.9% v/v エタノール含有ミルク溶液を投与し、成長を補うため、1日の最後の2回の給餌時にはミルクのみの溶液を投与する。
    2. SI群の仔ラットには、AI群と同等のPE-10チューブへの曝露時間を確保するため、溶液を投与せずに2時間おきに4回挿入を行う。UC群には経管投与を行わない。
  2. 仔ラットを母ラットから離し、保温のために温度調節機能付きの水 heating padに置く。各仔ラットの体重を測定し、体重（g）を記録する。あらかじめ作成した給餌チャートを参照して、各AI群の仔ラットへの投与量を決定し、記録シートに記入する。
    1. 11.9% v/v エタノール含有ミルク溶液を温水浴に入れ、よく振盪する。
    2. 胃管挿入の手順：
      1. 70% イソプロピルアルコールで保存されていた胃管を、温水で十分に洗浄する。
      2. 滅菌済みの1 mLシリンジを用いて、規定量の溶液を抽出する。
      3. 挿入を容易にするため、胃管の先端（PE-10側）を新鮮なコーンオイルに浸す。
      4. 仔ラットの口から胃までのPE-10チューブの長さを測定する。停止位置の目安となるよう、PE-50ストッパーを調整する。
      5. PE-10チューブを仔ラットの口に慎重に挿入し、食道を通り、胃食道接合部をわずかに越えて胃の中まで進める。仔ラットの状態を確認して固定し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げて溶液を投与する。
        注：誤って気管に挿入するのを防ぐため、まずチューブを曲げて軟口蓋に接触させてから前方に進める。チューブはこの領域で自然に偏向し、食道へと導かれるため、口蓋をガイドとして利用する。それ以外に、先端が腹側に大きく逸れると、気管に進入する可能性がある。挿入位置に確信が持てない場合は、チューブを抜いて挿入を中止し、次回の試行で正しく再挿入するのが最善である。
      6. PE-10チューブを慎重に抜き、溶液の逆流、出血、または物理的な損傷がないか仔ラットを確認する。問題がなければ、仔ラットを兄弟ラットの元に戻す。経管投与の手順は、1匹あたり約1分未満、各リッターの投与対象4匹（AI 2匹、SI 2匹）で合計約4分かかる。
      7. SI群の仔ラットへの胃管挿入手順：AI群と同様のPE-10挿入手順に従うが、溶液は投与せず、同時間（1分）保持する。
      8. リッターの最後の仔ラットの処置が完了した後、直ちにすべての仔ラットを母ラットの元に戻す。母ラットを次の給餌セッション（2時間後）まで飼育施設に戻す。
      9. 胃管を滅菌温水で洗浄し、保存用に70% イソプロピルアルコールに戻す。各給餌セッションの前に、チューブを水で十分に洗浄する。
      10. 2回目の給餌セッションについて、2.2（体重測定を除く）から2.2.2.9までを繰り返す。最後の2回の給餌では、2.2で決定した投与量を用いて、AI群の仔ラットにミルクのみの溶液を投与する。
  3. 代表的な成長曲線を得るため、PD 15（開眼時）、PD 21（離乳時）、PD 30、PD 60、およびPD 90（手術時）などの一定の間隔でラットの体重を測定する。

3. 電極の作製および修飾

  1. ラット1匹につき1つの筋電図（EMG）「ヘッドステージ」を作製する（図2）。ヘッドステージにより、瞬目システムを介して瞬目反応の記録が可能になる（図4）。
    1. 3TサイズのPTFE（ポリテトラフルオロエチレン）被覆ステンレスワイヤー2本（各5 cm）、10TサイズのPTFE被覆ステンレスワイヤー1本（5 cm）、オス型コンタクトピン3本、および3孔に切り詰めたマイクロストリップソケット絶縁体（3.1.4を参照）を用いてヘッドステージを構成する。
    2. 10Tワイヤーの中央をギザ付き高精度ピンセットで掴み、平滑高精度ピンセットで両方向に向かって被覆を除去し、PTFE被覆を剥ぎ取る。このワイヤーから被覆が完全に除去されていることを確認する。
      1. 10Tワイヤーの一端を、ギザ付きプラットフォーム歯科用プライヤーでコンタクトピンに圧着させる。これが接地線（グランドワイヤー）となる。3Tワイヤーの一端から1～1.5 mmの箇所を平滑高精度ピンセットで慎重に保持する。残りの被覆はそのままにし、1～1.5 mmのPTFE被覆を剥ぎ取る。露出した3Tワイヤーの端にコンタクトピンを圧着させる。
      2. 2本目の3Tワイヤーに対しても同様の手順を行う。これら2本のワイヤーは、EMG記録電極の正極および負極リードとして使用する。
    3. すべてのワイヤーに引っ張り試験を行い、ピンにしっかりと固定されているか確認する。ワイヤーを曲げたり損傷させたりしないよう注意する。
    4. ワイヤーストリッパーのカッティングブレードを用いて、ソケット絶縁体ストリップを3.5孔分（4番目の孔の中央で切断）に切り出す。このセグメントをちょうど3つの全孔に縮小し、必要に応じて両側をサンディングする。これにより、3つの全孔が確実に利用可能になる。ピン・ワイヤーユニットをマイクロストリップの3つの孔に挿入し、圧着端が絶縁体セグメントの下端と面するようにする。10Tアセンブリは、マイクロストリップの中央ではなく、外側の孔のいずれかに配置する必要がある。
  2. バイポーラ刺激電極を修正する（図2）。
    1. ラット1匹につき1つのバイポーラ刺激電極を割り当てる。この電極は、条件性古典的条件付け（ECC）中のショック非条件刺激（US）として、刺激アイソレーター（瞬目システムを参照）を介して少量の電流を印加する。電極はメーカーからツイスト状の遮蔽（シールド）済み製品として入手する。
    2. 2本の金属リードを2～3回ほど解いてV字型（広がり5 mm）にし、平滑高精度ピンセットを用いて各「 prong（爪）」を可能な限り真っ直ぐにする。カミソリの刃を用いて、各prongの先端の遮蔽を全周にわたって1 mm削り取る。各prongに不規則な箇所や曲がりがないか検査し、必要であれば追加で遮蔽を削ることなく修正する。
  3. EMGヘッドステージおよびバイポーラ電極を95%エタノールで洗浄し、製造油や異物を除去する。乾燥させた後、オートクレーブ滅菌を行う。

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図2: 筋電図（EMG）記録電極およびバイポーラ電極。完成したEMGヘッドステージ（右、オレンジ色）は、3本のオス型コンタクトピン、2本の3TサイズPTFE被覆線、1本の10TサイズPTFE被覆線、および改造したマイクロストリップで構成されています。3本のワイヤーはそれぞれ約5 cmであり、コンタクトピンに圧着されています。完成したバイポーラ電極（右、白色）は、ねじれを解いて真っ直ぐに直し、V字型（5 mmの間隔）に成形されています。2本のプローンの先端からシールドが除去されています。こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。

4. 眼瞼手術の手順（生後90日目）

  1. 材料（詳細な供給情報はMaterialsを参照）、動物、手術領域および非手術領域の準備：
    1. 手術器具と消耗品をオートクレーブで滅菌する。括弧 ( ) 内の数値は、成ラット1匹あたりまたは1回の測定あたりに必要とされる概数を示す。手術器具（ECU IACUCの承認に基づき、ラット4匹につき1セット）、ガーゼパッド (3-4)、綿棒 (5-6)、20 x 20 ラップ（手術セッションあたり4枚）、磁製るつぼ (1)、ステンレス製マイクロスパチュラ (1)、0.9% 生理食塩水（洗浄ボトル1本）、シャーレ (1)、0-80 ステンレス製ネジ（ラット1匹につき3本）。
    2. その他の必要な滅菌用品：10番手術用メス刃（ラット4匹につき1枚）、手術用ドレープ（ラット1匹につき1枚）、獣医用眼軟膏、ポビドンヨード（洗浄ボトル1本）、26G x 3/8" 低圧針 (2)、#55ドリルビット付きニッケルメッキピンバイス、ニッケルメッキマイナスドライバー（刃幅1.8-2 mm）。
    3. 承認済みの研究用/医療用消毒剤を使用して、すべての手術器具と用品のための滅菌保持領域を準備する。領域の準備が整い次第、そこに材料を配置する。
    4. 承認済みの研究用/医療用消毒剤を使用して、滅菌手術スペースを準備する。このスペースには、温度調節機能付き温水パッド、ラット用麻酔マスクを装着したステレオタキシック装置、ガラスビーズ滅菌器、および（麻酔用の）イソフルランガス気化器を設置する。気化器には、麻酔マスクおよび非滅菌的な動物準備処置を行う別スペースに設置された導入チャンバーへのチューブが接続されており、各チューブは個別のバルブで制御されている。
    5. 抗菌石鹸を用いて、手と腕を十分に洗浄する。 滅菌ポーチやラップで包装されたアイテムは、内側に触れないようにあらかじめ開封しておく。無菌操作を用いて滅菌手袋を着用し、すべての関連アイテムを手術領域へ移動させる。ピンバイスにドリルビットを適切な深さ（~ 2 mm）でセットし、ドライバーを準備する。手術開始まで、滅菌材料を滅菌ラップで覆っておく。
    6. 電子天秤、電気バリカン、26G x 3/8 in 針付き滅菌 1 mL シリンジ（ラット1匹につき1本）、手術ログ、およびブプレノルフィン（濃度 0.03 mg/mL、投与量 0.1 mL/100 g）を備えた非滅菌スペースを準備する。
      注意：ブプレノルフィンはDEAスケジュールIIIの半合成オピオイドであり、適切に施錠し、記録を付ける必要がある。
    7. イソフルラン気化器のガスレベルが適切か確認し、少なくなっている場合はガスを補充する。今のところ、ガス流量および混合ノブはオフのままにする。O2タンクを開き、すべての手術に十分なガスがあることを確認する。
    8. 各ラットの体重を測定し、手術ログに記録する。ブプレノルフィンの注入チャートを使用して、適切な注入量を決定する。
    9. 導入チャンバーへの気化器バルブを開き、手術マスクへのバルブは閉じたままにする。混合比を3、流量を3に設定する（キャリアガスとして100% O2を使用し、3 L/minの流量で3%イソフルランとする）。
    10. ラットを導入チャンバーに入れ、適切な麻酔面（呼吸の緩慢化、足踏み反射の消失、瞬目反射の消失）に達するまで待機させる。麻酔面に達したら、ラットをチャンバーから出す。
    11. バリカンを用いて頭部を剃毛し、切開部位と左眼瞼に十分な皮膚を露出させる。必要に応じて、再び導入チャンバーに入れ、トリミングを再開する前に再度麻酔面に到達させる。
    12. イソプロピルアルコールとポビドンヨードを交互に3回塗布し、露出した皮膚を消毒する。必要に応じて、手術台に移動させる前に、再度導入チャンバーに入れて麻酔面に到達させる。
  2. 手術
    1. 麻酔マスクへの気化器バルブを開き、導入チャンバーへのバルブを閉じる。混合比を2.5、流量を2に調整する（キャリアガスとして100% O2を使用し、2 L/minの流量で2.5%イソフルランとする）。ラットをステレオタキシック装置に移し、切歯バーと耳バーに頭部を固定する標準的な手順に従う（例として Geiger et al., 200849 を参照）。
    2. ラットにブプレノルフィンを術前投与（SC）し、針（キャップなし）を鋭利物容器に注意深く廃棄する。ラットに滅菌手術用ドレープをかけ、手術領域のみを露出させて体から隔離する。
    3. サージカルマスク、サージカルキャップ、サージガウン、ゴーグル、およびIACUCが要求するその他の個人用保護具を着用する。抗菌石鹸を用いて手と腕を十分に洗浄し、こすり洗いする。滅菌操作を用いて滅菌手袋を着用する。
    4. 眼球の乾燥を防ぐため、綿棒を用いて両眼に少量の眼軟膏を塗布する。
    5. ラットが適切な麻酔面を示した時点で手術を開始する。手術中は継続的にラットをモニタリングし、定期的にイソフルランレベルを確認する。麻酔に対するラットの反応に基づき、手術中に流量および混合ノブを適宜調整する。
    6. メス刃を用いて、頭蓋骨の中線に前後方向の切開を加える。この切開は、眼の前方（すなわち前頭骨を露出させる）およびラムダ縫合線のわずか後方の十分な領域を露出させる必要がある。
    7. 過度な出血を起こさないよう注意しながら、頭蓋骨上の骨膜をこそぎ落とす。綿棒を用いて余分な結合組織と血液を拭き取る。
    8. ピンバイスを用いてドリルビットで穴を開ける。片側の頭頂骨の冠状縫合線の直後から開始する。綿棒を用いて血液と骨の破片を除去する。スプリンター鉗子で0-80 ネジのネジ山を掴み、精密ドライバーで穴に固定する。皮質脳組織を損傷しない程度に、ネジを十分に締め付ける（通常は3-4回転）。
    9. 4.2.8で述べた手順に従い、さらに2本の0-80 ネジを頭蓋骨に固定する。1本は反対側頭頂骨の冠状縫合線の直後に、もう1本は右ラムダ縫合線の直前に固定する。歯科用セメント（4.2.18参照）を頭蓋骨に固定するには3本のネジで十分であることが分かっており、4本目のネジ（左ラムダ縫合線の前方）を打つとバイポーラ電極の配置を妨げるためである。
    10. シャーレからEMGヘッドステージを取り出す。10Tワイヤーがラットの右側に来るようにヘッドステージを向ける。10Tワイヤーを上方に曲げ、マイクロストリップの下端と平行にする。ワイヤーが前後の0-80 ネジを回り込むように、右側にわずかに曲げる。手の届く範囲に置いておく。
    11. ［右利きの場合］左手に3インチドレッシング鉗子を、右手に4インチドレッシング鉗子を持つ。4インチドレッシング鉗子で左眼の切開部位の上方の皮膚を掴み、3インチドレッシング鉗子をこの眼の隅に向ける。この隅の皮膚を掴む。3インチドレッシング鉗子で掴んだまま、4インチドレッシング鉗子を離す。
    12. 26G x 3/8 in 針を1本取り、眼瞼の隅に通す。針の刃面が上を向くように回転させる。プラットフォーム付きマイクロ解剖鉗子を用いて、中央の3Tワイヤーを針の穴に挿入する。完全に通しすぎないように、数センチメートルだけ穴に通す。このワイヤーが陰極リードとなる。
    13. 4.2.11および4.2.12に記載された手順を行い、外側の3Tワイヤーを眼瞼の中央部に挿入する。このワイヤーが陽極リードとなる。
    14. 片方の手で両方の針を、もう片方の手（または鉗子）でヘッドステージを掴む。1つの連続した動作で、ヘッドステージを同じ方向に誘導しながら、針を眼瞼から引き抜く。必要に応じて、10Tワイヤーが動物の右眼に向くようにヘッドステージを回転させる。3Tワイヤーが交差しないようにする。微細先端鉗子を用いて、陽極リードが眼瞼の中央にあることを再確認する。
    15. ヘッドステージを調整し、両眼の中央に位置し、両側に挿入したネジよりも前方の前頭骨上の最適な位置にする。片方の手でヘッドステージを保持し、もう片方の手で3インチドレッシング鉗子を持つ。10T側にある1本または両方のネジに10Tワイヤーを巻き付ける。
    16. 片手に3インチドレッシング鉗子を、もう片方の手に4インチドレッシング鉗子を持つ。3インチドレッシング鉗子を用いて、左側頭部方向の切開部位の皮膚を掴む。4インチドレッシング鉗子を用いて、皮膚（すなわち浅筋膜）を側頭筋から分離し、小さな「ポケット」を作る。アイリスシザーを用いて、左眼の隅に向かってさらに結合組織を切り取り、このポケットのサイズを広げる。深く入りすぎたり、血管を切断したりしないよう注意する。
    17. バイポーラ電極を取り、ワイヤーリードを側頭筋の曲率に沿って適合させ、2つのプローブ（背側および腹側）が左眼の後方に位置し（ビデオ参照）、バイポーラ電極の下端が頭蓋骨の直上に位置するように成形する。コミュテータケーブルプラグ（図3）が妨げなく取り付けられるよう、ヘッドステージとこの電極との間に十分な距離を確保する。
    18. るつぼに歯科用セメントパウダーを注ぐ。まずるつぼの約1/3から始め、必要に応じて量を調整する。水のような粘度になるまで液体成分を加え、スパチュラでこれらの成分を混ぜ合わせる。セメントの粘度が高まったら、切開部位に塗布し、皮膚のすべてのエッジを少なくとも1/8 in の幅で覆う。
      1. ラットが両目を閉じられることを妨げない範囲で、ヘッドステージとバイポーラ電極を固定するのに十分な量のセメントを塗布する。ラットの被毛の不要な箇所に滴下したセメントは、速やかに拭き取る。
    19. バイポーラプラグをねじ込んで取り付けられるよう（図3）、バイポーラ電極のネジ山が少なくとも4-5山セメントで封じられていないことを確認する。ヘッドステージから過剰なセメントを取り除く。マイクロストリップの上部と3つのコンタクトピンは清潔でなければならない。セメントは急速に硬化するため、これらの電極とコミュテータケーブルプラグとの完全な結合が容易に妨げられる可能性がある。部分的に乾燥した余分なセメントは、スプリンター鉗子を用いて除去する。
    20. セメントが硬化して透明になるまで待つ。マイクロ解剖シザーを用いて、2本の3Tワイヤーの余分な長さを切り落とし、数センチメートルの作業スペースを残す。
    21. 左手にプラットフォーム付きマイクロ解剖鉗子を、右手に微細先端マイクロ解剖鉗子を持つ。左の鉗子で、眼瞼のわずか前方にある一方の3Tワイヤーを掴む。右の鉗子で眼瞼を押し上げ、さらに3Tワイヤーを露出させて保持する。左の鉗子を離し、左手でヘッドステージを掴む（この時点でしっかりと固定されていることを確認する）。右の鉗子を用いてPTFEシールドの一部を剥ぎ取り、ワイヤーが眼輪筋（orbicularis oculi）に接触するようにする。
      注意：3Tワイヤーを強く引っ張りすぎないように注意すること。コンタクトピンから外れる可能性がある。ワイヤーが外れた場合、硬化したセメントが骨折させずに頭蓋骨から容易に外れないため、コンタクトピンの交換は不可能となる。
    22. 2本目の3Tワイヤーに対しても、4.2.21の手順で余分なPTFEを剥ぎ取る。
    23. 4.2.21と同様に、2本のマイクロ解剖鉗子（左にプラットフォーム、右に微細先端）を保持する。右の鉗子が眼瞼の直前に位置するスペースを空けつつ、左の鉗子を一方の3Tワイヤーのわずか前方に配置する。両方の鉗子でワイヤーを掴む。
      1. 右の鉗子を固定したまま、左の鉗子を上方に回転させて眼瞼に向かって巻き付けることで「フック」を作る。これを一連の動作で行う。慎重に右の鉗子を離し、次に左の鉗子を離す。
        注意：電極を眼瞼にフックさせることで、角膜に擦れる可能性を最小限に抑えることができる。これにより、行動テスト段階のあらゆる時点でのワイヤー断線の可能性も最小限に抑えられる。フックさせてもすべての動物においてワイヤーが角膜に擦れることを完全に防げるわけではないが、通常、高振幅の瞬目（5.1.7でデジタルオシロスコープにより測定）および術後の日常的な健康観察（過剰な涙、眼瞼の不完全閉鎖、眼損傷による可動性の低下）によって示されるように、眼損傷の兆候は見られない。ラットに不快感の初期兆候が見られた場合は、イソフルランで麻酔し（4.1.10参照）、電極を再検査および/または再配置する。角膜の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布する。術後の眼合併症について毎日観察し、持続する場合は獣医師の診察を受ける。電極の再配置や獣医学的治療で改善できない深刻な眼合併症を示したラットは、ECU IACUCの標準操作手順に従って人道的に安楽死させる。
    24. 2本目の3Tワイヤーについても4.2.23の手順を行う。マイクロ解剖シザーを用いて余分なワイヤーを切り落とす。
    25. 片方の手でラットの体を支えながら、もう片方の手で耳バーからラットを解放する。頭部に血液や破片がないか確認し、必要に応じて清掃し、術後のブプレノルフィン注射を行う。
    26. 回復を助けるため、熱源（温度調節機能付き温水パッドなど）のある回復ビンにラットを入れる。手術ログに手術終了時間を記入し、手術中のラットに関する pertinent なメモを記載する。ラットの呼吸が適切であることをモニターし、胸臥位（sternal recumbency）になるか、動き始めたらホームケージに戻す。
    27. （損傷する可能性があるためマイクロ解剖鉗子を除き）ビーズ滅菌器を用いて器具を再滅菌し、手術領域が無菌状態に保たれていることを確認する。複数の眼瞼手術を行う場合は、無菌操作を繰り返す。

5. 眼瞼反射古典的条件付けの手順

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図3: 眼瞼反射条件付け用に改造したオペラント条件付けボックス。ラットは自由に動き回る哺乳類であるため、頭部に装着したEMGおよびバイポーラプラグからの電気信号接点を維持するために回転コミュテータが使用されている。コミュテータは支柱のアームに取り付けられており、ラットへの負荷を軽減するためにカウンターウェイトが装着されている。ピエゾツイーター（スピーカー）により85 dBの2.8 kHzトーンが提示され、これらの値は定期的に校正される。音響フォームにより周囲のノイズが低減される。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4瞬目条件付けシステム このカスタムメイドのシステムは、ラットからの入力信号をフィルタリングおよび増幅するEMGインテグレータユニット、トーンや電気刺激に加えてさまざまな刺激を提示する刺激制御ユニット、EMG信号のゲインを上げるための各オペラントボックス用プリアンプ、および各オペラントボックス用の刺激アイソレーターで構成されており、さまざまなレベルの電気刺激（mA単位）を提示することが可能です。また、馴化および獲得の過程における診断目的として、デジタルオシロスコープ（標準の瞬目システムには含まれない）を使用します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 手術の5日後に、馴化および習得訓練を開始する。各ラットに対し、ハンドリングおよび訓練装置への馴化を1日間行う。なお、訓練装置は、より大きな防音チャンバー内に設置された改良型オペラント条件付け装置で構成される（図3）を行い、続いて6日間の習得トレーニングを実施する。慣らしセッションおよび習得セッションは、自作のまばたき測定システム（図 4).
    1. トレーニングログファイルを作成し、日々の記録用として印刷してください。このログでは、ラットの群を擬似ランダム（またはその他のランダム化手法）で各トレーニングボックスに事前に割り当てておく必要があります。
    2. アイブリンクシステムとコンピュータの電源を入れ、アイブリンクソフトウェアを起動します。このバージョンのソフトウェアには、独立して動作する複数のモジュール（またはアプリケーション）があります。Animalモジュールを実行し、被験体情報（セッション番号、個体ID、性別、体重、ケージ番号）を含む*.RATファイルを作成します。1つのRATファイルで最大4匹までのラットを管理でき、これを1つのスクアッド（群）とします。 accordinglyに値を入力し、ファイルを保存してください。トレーニングを行うラットのスクアッドごとに、個別のRATファイルを作成します。
    3. ラットを飼育室から試験室へ移動させ、ドアを閉じる。各ラットを5分間ハンドリングする。
    4. ラットを指定のボックスに移し、コムテータケーブルのEMGプラグとバイポーラプラグを、頭部に装着された対応するEMGヘッドステージおよびバイポーラ電極に接続する。
      注意：コミュテーターケーブルに初めて接触した際、ラットが激しく抵抗し、ストレスの兆候を示す場合があります。ラットを慎重に扱い、装着に失敗した場合は、ストレスを軽減させるために適宜休憩を入れてください。
    5. 回転する整流子を使用します。 360° ラットがボックス内で自由に動き回る間、電気信号の伝達および受信を維持します。本装置は5つのチャンネル（EMG電極用3チャンネル、バイポーラ電極用2チャンネル）を備え、これらがEMGインテグレーターユニットに接続されており、ユニット内で生信号のフィルタリングと増幅が行われます。
    6. ラットが自由に動き回っていること、およびコミュテータケーブルアセンブリやスタンションアームの重量によって動きが妨げられていないことを確認してください。必要に応じて、スタンション背面にあるカウンターウェイトを調整します。すべてのプラグがしっかりと固定されていることを確認し、ボックスの扉を閉じてください。すべてのラットに対して、同様の接続および確認手順を行ってください。
    7. オシロスコープを用いてEMG活動に異常信号（例：高周波および/または高振幅の電気活動）がないかを確認し、ビデオ監視システムが利用可能な場合は、それを用いて個体の状態（例：運動活動、環境への感受性、疼痛の徴候）を確認する。観察されたあらゆる問題点をトレーニングログに記録する。
    8. ラットを10分間チャンバーに順化させ、その後、ホームケージに戻す。
    9. オペラントボックスの洗浄および消毒を行い、床を掃き、テーブルを清掃してください。これらの手順を、セッションごとに実施してください。
  2. 獲得訓練を6日間連続（セッション）で実施する。
    1. 1日目：ラットを指定のボックスに移し、コミュテータケーブルのEMGプラグおよびバイポーラプラグを、頭部に装着された対応するEMGヘッドステージおよびバイポーラ電極に接続する。5.1.6および5.1.7に記載された手順と同様の操作を行う。
    2. スティミュラス・アイソレーターをオンにし、印加電流を0.4 mAに設定します（ビデオに示されているように、10 mAの4%に設定）。アイソレーターは、バイポーラ電極の背側および腹側の prong 間に、交互に（すなわち、試行ごとに）電流を印加します。これにより、繰り返しの刺激印加における（各筋肉部位での）筋線維の疲労を軽減することができます。
    3. すべてのラットについて、各試行で放出されたすべての瞬目反応および示した耐性を観察する。2試行ごとに、各ラットのショックUS強度を0.4 mAずつ増加させ、1.6 mAに達するまで行う（第7試行および第8試行で到達）。すべてのラットがケージ内で正常に反応していること、すべての増幅およびゲイン設定が一定であること、ならびに得られている電気信号が適切であること（すなわち、EMGノイズが少ないこと）を再確認する。習得トレーニングの全日程において、1.6 mAのショックUS強度を使用する。
      注：ラットが特定の電気刺激レベルに対して疼痛反応（例：床から高く跳ね上がる、壁を登る、走り回るなど）を示した場合、試行を一時中断し、直前のmA設定（0.4 mA低い値）に戻して2回の試行を行います。その後、ラットに再び耐えられなかった高い刺激値を設定し、耐性が示された場合は、1.6 mAに達するまで段階的に刺激値を上げていきます。いずれの値にも耐えられない場合は、トレーニング期間を通じて、耐性を維持できた次いで低い値（0.4刻み）を使用します。
    4. オシロスコープを使用して、EMG活動に異常信号がないか観察します（例：、高周波および／または高振幅の電気活動）と、その状態を確認するためのビデオ監視システム（例：、運動活性、環境への感受性、疼痛の徴候）。
      注：トレースECCの説明：捕捉されたEMG波形を含む代表的な試行エポックを以下に示す。 図1 また、トレースECCの手順については、ビデオ内で詳細に説明しています。トレース条件付けトレーニングファイルは、100回の試行（90回のCS-USペア試行と、10回ごとの10回のCSのみの試行）を行うように設定されています。th （試行）を行い、試行間間隔は平均30秒とする。トレーニングセッション全体は約52分間（中断がないと想定した場合）である。すべてのラットはセッション1では未経験であり、数日間のトレーニングが進むにつれて（条件反射（CR）の発現によって決定される）異なる学習曲線を示す。
    5. トレーニングを開始します：Blinkソフトウェアモジュールを実行します。プロンプトが表示されたら、適切なRATファイルと、〜用のトレーニングファイルを選択してください。 "トレース" 眼瞼反射条件付け
    6. トレーニングログに開始時刻と実験者の名前を記入します。この時点で、すべての活動をモニタリングしてください。具体的には、適切なEMG信号、電気ショックUSに対する良好な瞬目反応（すなわち、高頻度または頻回なUR）、動物の健康状態、およびハードウェアが適切に機能しているかを確認します。特筆すべき事項があれば、トレーニングログに記入してください。
    7. データ収集はソフトウェアによってRAWファイルとして自動的に記録されます（ラット1匹につき1日1ファイル）。RAWファイルには、驚愕反応（SR）、無条件反応（UR）、および条件反応（CR：全反応および適応反応）のEMG振幅（・ボルト）、周波数カウント、潜時、および面積データが含まれています。電気ショックによるアーチファクトがUR期間の最初の100msを遮蔽するため、URデータの含まれる範囲はUR期間の最後の140msのみとなります。
    8. トレーニングの終了後、ソフトウェアは自動的に閉じます。すべてのラットをトレーニングボックスから取り出し、元のケージに戻してください。 動物飼育施設。
    9. 以降のすべてのトレーニング日について、ステップ5.2.5から5.2.6を繰り返します。各日のBlinkモジュールを開始する前に、RATファイル内のセッション番号を更新してください。これにより、その日のすべてのラットに対して新しいRAWファイルが作成されます。トレーニングから除外された個体がない場合、各ラットに6つのRAWファイルが作成されるはずです。
  3. RAWファイルを処理し、統計解析用にフィルタリングしたファイルを作成します。
    1. 解析モジュールを実行します。ラットごとの各セッションについて、問題のある試行がないか試行ごとに確認してください。これは、さまざまな理由で不適切となった可能性がある試行をスクリーニングするために行われます（例：、CS前のベースライン活動の過剰、過度な体動、電極の脱落、ケーブルまたは配線の不具合）。本ソフトウェアには、実験者が検出および除去を行うのを支援するアルゴリズムが搭載されています。 "不適切な試験" フィルタリングされたデータセットから除外される。
    2. フィルタリングしたデータをスプレッドシートソフトにインポートし、適切な統計解析を行う。

結果

瞬目ソフトウェア測定の多くの種類の大規模な包括的なデータのセットを提供することが可能です。簡潔にするため、本研究で報告代表結果学習とパフォーマンスの適応の CR 割合、適応 CR 振幅、UR 割合 UR 振幅などの措置。適応 CR 期間は、ECC50,51,52トレース中の海馬のシナプス可塑性の強化の結果として、繰り返しのトレーニング、時宜を得た瞬目反応の獲得を表すために選ばれました。UR 対策で新生児のアルコール性の学習の欠損トレース ECC 治療群学習相違点ではなく、動機づけやモーターの違いを示す可能性があります - 私たち連合学習の混乱やショックへの対応に混乱が原因だったかどうかを解明するため選ばれました。各メジャーのデータは、混合性、繰り返し対策要因としてセッション 2 (セックス) x 3 (新生児グループ) x 6 (セッション) を使用して分析しました。新生児の治療のため有意な主効果テューキー事後テストを使用して分析し、重要な相互作用を単純な効果テストを使用して行った。0.05 の最小アルファ レベルを使用してすべての統計解析を実施し、グラフの結果が平均 ± SEM.

分散適応の CR 割合測定に始まり、新生児グループ、 F(2,21) の有意な主効果を示される = 11.69、 p < 0.001、しかしセックスのない有意な主効果 (p = 0.71) またはこれらの要因間の重要な相互作用 (p = 0.20)。予想通り、適応の CR 割合増加トレーニング、 F(5, 105) の六つのセッション = 81.15、 p < 0.001 と新生児グループ間の違いはF(10, 105) セッションのいくつかのレベルに依存していた 4.58、 p = < 0.001。セッション因子を含む他の重要な相互作用はありませんでした。同様に適応の CR 振幅があった再びF(2,21) 新生児グループの有意な主効果 22.32、 p = < 0.001、しかしセックスのない有意な主効果 (p = 0.21) またはこれらの要因間の重要な相互作用 (p = 0.48)。CR 振幅も大幅にトレーニング、 F(5, 105) の六つのセッションを介して増加 59.27、 p = < 0.001 と新生児グループ間の違いはF(10, 105) セッションのいくつかのレベルに依存していた 4.31、 p = < 0.001。全体的にみて、両方 CR 対策グループ手段および訓練の別のセッションで大きく区切られたこれらの手段の間で有意差を示した。グループが大幅に異なることを確認、するテューキー事後テストに unintubated 制御 (UC) と偽挿管 (SI) ラットよりも両方の CR の措置に対して、アルコール挿管 (AI) ラット実行大幅に悪化を示した (p < 0.01 の CR 割合;p < CR 振幅の 0.001)、互いを認められなかった (p> 0.05)。単純な効果のテストは、x セッションの相互作用両方 CR の措置については、AI ラットが UC と SI の両方のラットと比較して始まるセッション 2、セッション 6 を乗せて CRs の買収により著しく損なわれたことを確認重要な新生児グループに対して実行される (すべてp< 0.05)、互いから六つのセッションを通して異ならなかった。唯一の例外は、セッション 3 まで AI ラットと大幅に異なる SI ラットが始まらなかったため適応 CR 振幅をだった。これらの結果は、図 5 a、 5 bのとおりです。

セックス、新生児グループ、またはセッション因子のこれらの要因の相互作用のため UR 対策に有意差はありませんでした。これらの陰性所見では、各グループは私たち同様に、瞬目ショック レスポンスを生成することができたし、(図 6 a、 6 b) 点滅の動機付けや運動の違いによって影響を受ける AI ラットで観察学習の欠損がなかったことを示されています。

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図 5: トレースの取得エアコン応答 (平均 ± SEM).初期のアルコール暴露 (AI グループ) には、適応条件反応 (CR) の割合 (A) と (B) の振幅による著しい影響を受けます。トレース ECC は本質的に取得することは困難、したがって対策は ECC の遅延 - すべてのグループの比較的低い、パーセンテージは FASD21,53の齧歯動物モデルの 80-85% に達する可能性があります。それにもかかわらず、トレース ECC プロシージャは、初期の脳の発達中にはアルコールの影響を受け、海馬で課税の詳細です。* = p < 0.05 * * p = < 0.01、* * * p = < UC と AI のラット間 0.001サンプル サイズは、かっこ内に提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 6: 無条件反応 (± SEM を意味する) の取得します。瞬目パフォーマンス (UR 割合と UR 振幅) は、グループ間に有意差でした。違いの欠如は、その習得訓練中に使用される衝撃強度に差動 AI ラットの動機は影響しなかったか守備能力点滅 (UC と SI) 両方の制御グループと比較して、衝撃への応答を示します。サンプル サイズは、かっこ内に提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

生後 4-9 中にエチルアルコールを受信したラット新生仔は、成人の海馬障害を出展しました。これらの調査結果は、アルコールが海馬の機能に有害な影響を永続的の催奇形物質であるという考えをサポートします。両方のコントロールのグループのラットと比較してアルコールにさらされたラットのトレースの手順で全体的に、調節された応答が低かった。アルコールに曝露されたラットの学習障害が動機またはモーターの違いの影響を受けなかった (すなわち。、点滅米国の衝撃強度に違いはありません)。

トレース ECC 解明課題による海馬神経病理学の有用な診断ツールですが、このメソッドの結果は、適切なコンテキストに置かれなければなりません。最初に、このデモでキーの手続き型の要素には、発展途上の脳筋活動電位の記録ができ、衝撃、前述のハードウェア、および関心の認知機能を評価する学習パラダイムを使用してその後動物テストの外科的移植を提供する電極ハードウェアの作製に脆弱性の既知のウィンドウの中にアルコールのターゲットを絞った配信が関与しています。プロセスの各段階で注意する必要がある齧歯動物の被験者に不要な/意図しない害を発生しないようにし、定期的に自分の健康の兆候を監視します。彼らの行動の結果は、認知の「ウィンドウ」は、正確には心理的な構造説明とき自分の健康を含むアルコール投与、ハードウェアの欠陥、または外科的移植実験の誤差によって妥協されません。したがって、研究プロセスの各手順の要素は人間の所見に ECC からの結果を推定できることを保障するために健全な方法で実行されなければなりません。第二に、ECC パラダイム連合学習の性質に洞察力を提供しますが、1 つが実験的なデザインで ECC 研究内のこれらのドメインのいくつかのファセットを組み込んでいる限りは、このアプローチを使用して結果を拡張し、広くそれらを他の認知ドメイン - 作業メモリ、短期/長期記憶、意識などに帰するに注意が必要があります。たとえば、このデモはトレース ECC 学習の獲得の段階を検討したが、彼らは訓練を完了した後、ラットにおける記憶保持を調査しませんでした。メモリは、学習だけでなく評価される独立した心理的プロセスです。仕様では、1 つはいずれかの短期または長期の記憶能力を評価するためにメモリの保存期間を組み込むことができます。第三に、並列メモリ システム54の動作に寄与する要因を動機づけ、経験的なおよびホルモンと一緒に同時に動作可能性がありますがあることの認識は、(ECC) の間のアソシエティビティが理解が、その正体は「良い」または「悪い」学習について多くのプロセスの 1 つに不可欠です。最後に、トレース ECC は他の頭脳領域は、CR のいくつかのコンポーネントを仲介することがありますので、純粋な海馬依存タスクではありません。したがって、異なる神経回路および/または研究で使用されている刺激パラメーターの型間の相互作用を理解する必要があります考慮する離散の結果に基づいて影響を作るとき。小脳などもトレース ECC、CR とタイミング、特に ISI は短い期間で CR の地形学的特徴に影響を及ぼす場所に貢献します。トレース ECC は長いトレース間隔 (1,000 ミリ秒) でテストが小脳損傷に人間は影響を受けませんが、短いトレース間隔 (400 ms)34を受給している人の影響を受けます。さらに、マウスの前部帯状回と内側の agranular 地域をターゲットに、背内側前頭前野 (mPFC) の両側性病変は、ウサギの尾 mPFC の破壊生成と同様の結果46CRs55トレースの取得を防ぐ。これらの調査結果はまた小脳脳前頭貢献に種差幹トレース ECC などの駆動の連合学習を考慮の重要性を強調表示します。大人用 500 ms トレース CRs の PD 4-9 悪影響を取得中に新生児のアルコール暴露は47,56本研究でラット、これは 300 ms トレース間隔が発生するアルコール (5 g/kg)57, アルコール曝露ラットにおけるトレース障害がトレース間隔の時間に依存することを示唆の比較的高用量で挑戦されたときにも新生児のアルコールに曝露されたラットに同じケースではありません。

本研究では海馬はトレース CRs の習得における障害を反映して神経に関連する損傷を展示トレース、ECC を媒介と新生児アルコール露出によって挑戦されたとき極めて重要であることを強調しました。ただし、ECC、買収、式、トレース ECC36,40,55,58,59を含む ECC タスクの種類に応じて、CR の地形などの多くの面は特に規核、小脳脳幹回路が欠かせませんそれ警告する必要があります。確かに、この神経回路はトレース ECC60など、ECC の上位フォーム時に CRs の式を運転の海馬と対話します。初期の脳の発達中のアルコール暴露はトレース ECC で海馬の機能、特に効果かどうかは、全く明らかではないです。多くの異なる脳の領域は、mPFC、小脳、海馬18,19,23,47,,6162など初期のアルコール侮辱を受けます、アルコールの妨害が多く ECC プロシージャ間程度と変えることで、機能的に重要な相違点がこれらの構造体の機能は非常にそうです。トレース ECC 研究の結果の解釈に関する落とし穴にもかかわらず動物病変研究42,44,63,64,65でサポートされている、少なくともそのまま海馬に依存するトレース CRs の買収に成功を示されています。この手順はこうして残る新規オブジェクト認識、モリス水迷路学習の場所など、他の海馬依存タスクのよりも理解したトレース条件、それの基礎となる神経回路ははるかに良いために、応答する発達アルコール露出間のリンクを示すために非常に貴重なアプローチおよびコンテキストとトレースの恐怖します。

「測定」認知行動法として ECC 発達 neuroteratology の分野で広範な適用性があります。確かに、当研究室の最近の知見は、発展途上の海馬はアルコールの効果は、さまざまな介入戦略18,47によって緩和されるかもしれませんに機密性の高い概念をサポートします。ここでの主な利点かもしれないということですアルコール誘起トレース ECC 学習の欠損のよりよい理解、彼ら連想学習 - 外海馬機能のほかの問題の予測同じ海馬 neurocircuitry によって媒介される知られている特にそれら。

アプリケーション トレース ECC およびその他の変種 (例えば遅延、反転、差別、化合物) 神経生物学メカニズムと連合学習に関係する神経システムを解明するは、胎児性アルコール研究分野を超えて拡張できます。たとえば、このパラダイムは、症例と6968,アルツハイマー病など神経変性疾患、統合失調症66,67などの精神疾患の動物モデル、薬物乱用70,,7172で注目を受けています。したがっています神経科学を含む多くの心理的な生物医学分野の neurocognitive 機能と機能障害を評価するための研究方法とその利点を明らかに。

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、アルコール飲料医療研究財団 (ABMRF) から TDT に助成金によって支えられました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
新生児アルコール曝露
190プルーフエチルアルコール(USP)Pharmco-AAPER225-36000 [ECU医療保管室]に置き換えることができます;USPである必要があります;子犬のための200プルーフエチルアルコール
容器/バスケットてください
コーン油任意の食品グレードの
温水療法ポンプw /パッドGaymarTP-500子犬を暖かく保つために、代用可能
下注射針 22G x 1 インチ、滅菌任意の
皮下注射針 30G x 1/2 インチ、滅菌任意の
イソプロピルアルコール 70%EMD ミリポアPX1840-4 [フィッシャーサイエンティフィック]代用可能、試薬グレード
www.fishersci.com
Long-Evans Rats (Female and Male Breeders)Charles River LaboratoriesN/A [ECU Dept. of Comparative Medicine]年齢と体重を指定する必要があります。価格はこれらの要因により異なります
www.criver.com
Micro Dissecting Scissors, 3.5 in, 23 mm BladesBiomedical Research Instruments11-2200PEチューブの切断用
brisurgical.com
ポリエチレン10チューブ(0.011インチ)IDです。0.024インチO.D.)BD診断システム22-204008 [フィッシャーサイエンティフィック]代用可能
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ポリエチレン50チューブ(0.023インチ。IDです。0.038インチO.D.)BD診断システム22270835 [フィッシャーサイエンティフィック]代用可能
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調整された給湯器またはベビーミルクボトルウォーマー任意オプション; 冷たいミルク溶液の温めを助ける
ツベルクリンシリンジ、滅菌、1.0 ml任意の
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EMGヘッドステージ製造およびバイポーラ電極改質
バイポーラ電極 2ch SS ツイストプラスチックスワン社MS303/2-B/SPC SS を選出2C TW .008"台座の下20ミリメートルのカスタム長さを指定する必要があります
www.plastics1.com
>Centi-Locストリップソケットインシュレーター(別名、マイクロストリップ)ITTキャノン/ ITT相互接続ソリューションCTA4-IS-60*またはCTA4-1S-60*ベンダーによって異なります。www.onlinecomponents.com または www.avnetexpress.avnet.com
デンタルプライヤー、鋸歯状CMF Medicon390.20.05オスのコンタクトピンにワイヤを圧着するために使用
www.medicon.de
マイクロ解剖はさみ、3.5インチ、23ミリメートルブレード生物医学研究機器11-22003Tワイヤを切断するためにのみ使用し、10Tワイヤを切断するとブレードが損傷します。ワイヤストリッパーのブレードを代わりに使用してください
brisurgical.com
PTFEコーティングステンレス鋼線、10T(裸径.010インチ)Sigmund Cohn-Medwire316SS10T
www.sigmundcohn.com
PTFEコーティングステンレス鋼線、3T(裸径0.003インチ)Sigmund Cohn-Medwire316SS3T
www.sigmundcohn.com
>Razor BladeAnyバイポーラ電極のプロングから1 mmを剥がすには
Relia-Tac ソケット コンタクトピン、オスクーパーインターコネクト220-P02-100Allied Electronics Cat # 70144761
www.alliedelec.com
ピンセット、高精度、鋸歯状、4 3/4 inElectron Microscopy Sciences78314-00D滑らかなピンセットでPTFEを剥がしながら10Tワイヤーをしっかりとつかむ
www.emsdiasum.com
ピンセット、高精度、滑らか、4 3/4 inElectron Microscopy Sciences78313-00B
www.emsdiasum.com
セット、超微細チップ、4 3/4 inElectron Microscopy Sciences78510-03Tワイヤーの一端から1mmのPTFEを剥がす。滑らかなピンセットでシールド部分をつかむ
www.emsdiasum.com
ワイヤーストリッパー、16-26 AWG任意ブレードの端を使用してマイクロストリップをカットします
名前<>strong>会社カタログ番号コメント
まぶたの手術
外科器具(高品質ステンレス鋼)
2 x ドレッシング鉗子、鋸歯状の生物医学研究機器30-1205用することができます; 手術トレイ
brisurgical.com ドレッシング鉗子の外側の電極/ネジをつかむための余分な鉗子
、鋸歯状の生物医学研究機器30-1200の 3代用可能
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Instrument TrayBiomedical Research Instruments24-1355代用可能
brisurgical.com
Knife Handle No. 3, 5 inBiomedical Research Instruments26-1000代用可能
brisurgical.com
マイクロ解剖鉗子、3.5インチ、ファインポイント生物医学研究機器10-1630代替可能
brisurgical.com
マイクロ解剖鉗子、3.5インチ、スムースプラットフォーム(0.3 x 5 mm)生物医学研究機器10-1720
brisurgical.com
マイクロ解剖はさみ、3.5インチ、非常に繊細な、15mmブレード生物医学研究機器11-2000代用可能
brisurgical.com
プレーンスプリンター鉗子、3.5インチ 生物医学研究機器30-1600代用可能
brisurgical.com
>#10 #3ハンドル用ステンレス鋼外科用ブレード、滅菌ステンレス鋼
プラスチック1、Incで0-80 x 0.1250-80 x 0.125代用可能
www.plastics1.com
アルコール調製パッド、滅菌フィッシャー・サイエンティフィック22-363-750 [フィッシャー・サイエンティフィック代用可能
www.fishersci.com
>ベタジン ポビドン-ヨウパデュー・フレデリック社6761815101 [Fisher Scientific]代用可能
www.fishersci.com
>Betadine Povidone-Yodine Prep PadsMoore Medical19-898-946 [Fisher Scientific]代用可能
www.fishersci.com
、オートクレーブ可能通常、ピン
バイス、#55(0.052インチ)任意の金属は、錆びや腐食
ゼパッド、フィッシャーサイエンティフィック22-362-178の2インチ×2 [フィッシャーサイエンティフィック]に置き換えることができます
www.fishersci.com
汎用ラテックス/ニトリル/ビニール手袋
ガラスビーズ滅菌器任意の手術間の滅菌器具
温水療法ポンプ / パッド x 2GaymarTP-500代用可能; 別々のポンプが推奨されます - 手術のための1、回復のための1
下注射針 26G x 3/8 で、滅菌任意の
イソフルランVedcoNDC 50989-150-12Manfacturerは代用できます。獣医の承認が必要な場合があります
イソフルラン気化器システム、卓上、非再呼吸パークランド科学V3000PK代用することができます
www.parklandscientific.com
>ジュエラーズドライバー 1.8-2 mmブレード付き任意の金属は錆びや腐食に耐える必要があります
オルソジェットBCAパッケージ(歯科用セメント)Lang DentalB1334には、粉末 (1 ポンド) と液体が含まれています
www.langdental.com
Oxygen Tank with Pressure Regulator, LargeLocal supplier
Porcelain Crucible, High-Form, Glazed, 10 mlCoorsTek, Inc.07-965C [Fisher Scientific]Fisher FB-965-I Wide-Form Crucible
www.fishersci.com
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment, SterileHenry Schein CompanyNC0144682 [Fisher Scientific]で代用できます
www.fishersci.com
>Quatricide PV-15PharmacalPV-15抗菌消毒剤; 代用可能?
www.pharmacal.com
ラット ステレオタシー手術用ガス麻酔マスク Stoelting Company51610
www.stoeltingco.com
Rat Stereotaxic Apparatus w/ Ear Bar (45 Degree)鼓膜の損傷を防ぐために、
Roboz Surgical Instrument MilkRoboz SurgicalNC9358575 [Fisher Scientific]代用することができます。オートクレーブ中に器具を潤滑するため
www.fishersci.com
げっ歯類のヘアトリマー任意の
塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS641-500 [フィッシャーサイエンティフィック]0.9%生理食塩水を作るため; 試薬グレード;USP
www.fishersci.com
Stainless Steel Microspula (ブレード: 0.75 L x 0.18 in.W)フィッシャーサイエンティフィック21-401-15 [フィッシャーサイエンティフィック]置換可能
www.fishersci.com
>Starrettピンバイス、0.000インチ - 0.055インチ任意のニッケルメッキまたは同等の錆びや腐食に耐えるために推奨
滅菌手術用手袋任意の
滅菌ラップ、20インチ x 20インチ、オートクレーブ可能Propper Manufacturing11-890-8C [Fisher Scientific]オートクレーブ可能な消耗品を包み込み、手術中に無菌フィールドで役立ちます
www.fishersci.com
Surgical Drape, Sterile/AutoclavableAnyAny May to cut to cut to size for rats
Surgical Gown*Any*If required by IACUC
Surgical Mask任意の
ツベルクリン注射器、滅菌、1.0 ml任意の
体重計任意の解像度(グラム単位)が必要です<
strong>名前Companyカタログ番号コメント
Eyeblinkシステムおよびコンポーネント(4ネズミシステムを想定して)
5チャネル整流子×4スワン株式会社SL2 + 3C
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バイポーラ電極ケーブル、デュアル305 x 4プラスチックワン、株式会社305-305 80CM TT2 (C)ラットのバイポーラ電極と整流子にプラグエンドを提供します。変更する必要があります
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Cable, 5 Channel, Shielded, 26 AWG x 4Any整流子ケーブルを製造するには、これはオペラ
ントテストボックス用のスクラッチチャンバーから作る必要があります。 24 H x 23 W x 14 D in) x 4Med-Associates代用可能; 内寸は、音響泡のための部屋で、オペラントテストボックスを快適にフィットさせる必要があります; ファンとフィット - 55-60 dB
www.med-associates.com
Eyeblink システムとソフトウェアJSA デザインN/A独自の研究室向けにカスタマイズ
熱収縮チューブ (3/16 インチ、1/4 インチ、3/8 インチ、直径 1/2)任意変更された整流子ケーブルを保護するため、端部をはんだ付けし、スプライス
メラミン トリプル ピーク アコースティック フォーム ブラック ハイパロン (24 x 48 インチ)McMaster-Carr9162T5代用可能; 4 つのハウジング チャンバーに合うようにカット
www.mcmaster.com
オペラントテストボックス(外装12.5 L x 10 W x 13.5 in H)、コンプリート x 4Med-AssociatesENV-007 カスタムパッケージステンレス製グリッドフロアとカスタムトップ付き(整流子ケーブルの中央に3つの穴)
www.med-associates.com
>オシロスコープ(オプション)任意推奨最小スペック:200 MHzアナログ帯域幅、1 GS / sリアルタイムサンプリング、4チャンネル。www.picotech.com
/td>
Piezo Tweeters (Speakers) x 4 (7 x 3 in)MCM Electronics53-805eyeblink system (2500 Hz - 25 KHz)の周波数範囲仕様と一致する必要があります
www.mcmelectronics.com
はんだ付けステーション、はんだ、フラックス、TinnerAnyメスソケット(オスのrelia-tacコンタクトピンに適合)およびバイポーラプラグに26AWGケーブルをはんだ付けするため
刺激アイソレータ×4WPIインターナショナルA365これらのユニットは16-9Vアルカリ電池で動作します。適切な充電式バージョン(A365R)が利用可能です
www.wpiinc.com
トライポーラ電極ケーブルSL3C整流子×4用1つ、 株式 会社。335-335 80cm TT3 CラットのEMGヘッドステージと整流子にプラグエンドを提供します。変更する必要があります
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USB LEDライト×4USBベースのライトは、ラットからのEMG信号で電気的な「ノイズ」を引き起こさないでください
www.plastics1.com
webcams x 4、監視ソフト
の使用を避け任意の 皮を使用するために使用することができます 解像度を参照してください ピン の 4 で代ねじ.を置換できます。素 綿棒ガー 皮任意の 45 度のバーをお勧めしますプラスチックプラスチック MS Windows OSを実行しているPCなら何でも

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