ゴルジ - コックス法を用いた太い脳切片内のイメージングニューロン

サマリー

我々は、単一の組織サンプル内に含まれる長い樹状ツリーとニューロンを可視化するために、厚い脳切片にゴルジコックス染色法を使用するためのプロトコルを提示します。このプロトコルの二つの変異体はまた、クレシルバイオレットの対比、および長期保存のために未処理の脳の凍結を伴うが提示されています。

要約

ニューロン染色のゴルジ - コックス方法は、組織学的脳サンプル内のニューロンの形態の我々の理解を進めるために以上の200年のために採用されています。それは完全に単一のセクション内に含まれる染色されたニューロンを同定する確率を高めるために、可能な最大の厚さで脳切片を調製するために実用的な観点から好ましいが、このアプローチは高いの作動距離によって技術的な観点から制限されています-magnification顕微鏡対物レンズ。ここでは500μmの厚さで切断されているマウスの脳切片にゴルジ - コックス法を用いた神経細胞を染色するために、高解像度30X 1.05 NAシリコーンを装着した正立顕微鏡を使用して、これらのセクションの深さ全体のニューロンを可視化するために、プロトコルを報告します800μmの作動距離を持つ油浸対物レンズ。また、表面を対比染色するために使用することができるこのプロトコルの2つの有用な変種を報告しますクレシルバイオレットニッスル染色で脳切片をマウントし、または処理を区画し、最終の前に長期保存のために全脳を凍結します。主プロトコルとその2つの変異体は、完全なニューロンの樹状ツリーと樹状突起棘を確実に可視化および定量化することができる全体ステンド厚い脳切片を、生成します。

概要

組織サンプル内の個々の神経細胞の可視化は、脳の我々の理解を進めて大きくしており、それは、内因性疾患または外因性の環境要因によって影響を受ける可能性がどのようにニューロンの形態学的特性のその場での分析を可能にします。ゴルジ - コックスの染色方法は、脳内の神経細胞のランダムなサンプルを染色の費用対効果の高い、比較的簡単な手段です。第ゴルジ¹によって開発され、1800年代コックス²によって修飾、研究者らはさらに^、樹状ツリー形態および棘密度^3,4の両方を可視化し、定量化するために使用することができる透明な、十分に染色されたニューロンを産生するために長年にわたってこの技術を洗練しています^{5、6、7、8、9}。

脳切片中の染色されたニューロンの可視化のための主要な技術的な考慮事項は、使用可能な高倍率/高解像度の顕微鏡対物レンズの作動距離によって制限される最大スライス厚、です。 60で共通の油浸対物レンズ - 100Xは、優れた分解能を提供する範囲であるが、一般的には200μmよりも大きくない彼らの作動距離によって制限されています。 200μmの範囲で切断脳切片は、大脳皮質¹⁰の浅い層で例示錐体ニューロン^{、11、12、}のCA1領域における錐体ニューロンのために、このスライスの厚さ内に収容することができる特定のニューロンタイプを視覚化するのに十分であってもよいです海馬^13、14、及び海馬¹⁵の歯状回における顆粒細胞。比較的長いとニューロンこうした脳は全体の樹状突起の木を含むように完璧な角度で切断する必要があるため、セル本体¹⁶から800以上ミクロンを拡張することができ、マウスのために、より大きな挑戦を提供大脳皮質の深い層内の錐体細胞として樹状突起、 200枚のμmの切片内。デンドライトまたはその枝のいずれかが吻側または尾側方向に延びている場合、これはさえ実現可能ではないかもしれません。それは複数の隣接する脳切片を横切ってニューロンを追跡することによってこの制限に対処することは可能であるが、このアプローチは^17をトレースするための正確セクションを整列させるに重要な技術的課題を紹介します。より実用的なアプローチは、より大きな厚さで切断された脳切片内に含まれる全体のニューロンを可視化することであろう。

ゴルジ - コックス法を用いたマウスの500ミクロン厚の脳切片、および彼らのMOを視覚化するために - 私たちはここに400内のニューロンを染色する技術を報告しますrphology800μmの作動距離を有する高分解能シリコン油浸対物レンズを使用。我々は説明ゴルジコックス含浸処理プロトコルは文献⁶に最も引用現代プロトコルのいずれかから変更されています。厚い脳切片との我々のアプローチは、完全にセクション内に含まれる任意のタイプのニューロンを同定する確率を増加させるという利点を提供します。ユニークな利点を提供するメインプロトコル、我々もまた、本2つのバリエーションに加えて：取り付けられた部分の表面にクレシルバイオレット対比（1）ゴルジコックス染色、脳領域の境界を画定するための層を識別するために切片および最終処理の前に含浸全脳の長期保存のための中間凍結ステップと大脳皮質、及び（2）ゴルジコックス染色。

プロトコル

大人の女性のCD1 - ひずみマウスは、本研究に使用しました。同様の染色は、様々な年齢で男女ともを用いて達成することができます。実験動物は、原則と動物ケアのカナダの協議会のガイドラインに従って世話し、実験プロトコルはグエルフの動物管理委員会の大学により承認されました。

1.ゴルジ - コックス染色

1. 脳のゴルジ-コックス含浸
   1. 別々に高品質の水に重クロム酸カリウム及びクロム酸カリウムを溶解し、1％のゴルジコックス溶液（w / v）の重クロム酸カリウム、0.8％（w / v）のクロム酸カリウムと1％（w / v）の塩化第二水銀を行います。溶液を混合、塩化第二水銀を追加して、等級1濾紙を用いて最終溶液を濾過します。までの1ヶ月間暗所でのソリューションを保管してください。
   2. 5％のイソフルランを用いてマウスを麻酔。
   3. 断頭によりマウスを安楽死させるとすぐに脳を取り除きます。
   4. ゴルジコックス溶液17 mLを含む20mLのガラスシンチレーションバイアルに脳を置き、25日間室温にて暗所でインキュベートします。
   5. 24時間4℃で暗所でスクロース凍結防止剤（0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中の30％（w / v）のスクロース）の40 mLを含む50mLのコニカルチューブにそれを置くことによって脳をCryoprotect。
      注：以下のオプションの3つのステップが、長期保存のために、この段階で脳を凍結するために、主プロトコルの代替として使用することができます。
   6. ドライアイスで予冷された200 mLのイソペンタン中にそれを浸漬することにより、脳全体をフリーズします。
   7. -80℃で暗所で50 mLコニカルチューブとストアに凍結脳を置きます。
   8. 準備が進行する場合、24時間4℃で暗所でスクロース凍結防止剤の40 mLを含む50mLのコニカルチューブにそれを配置することにより脳を解凍。
2. 脳セクショニング
   1. スクロースおよびブロックから脳を削除しますカミソリの刃を使用して、小脳を切除し、脳の残りの尾側端部に平坦な縁部を残すことによってセクショニングのためにそれをKです。
   2. 熱寒天培地（3％（w / v）の水で）それが溶融し、その融点よりわずかになるまで冷ますれるまで。
   3. その尾側端面ダウンと小型の使い捨て量る皿に脳を置き、脳をカバーするために溶融寒天の十分な量を追加します。
   4. 寒天が固化した後、約2出る過剰寒天をトリミング - 脳を囲む4ミリメートルを、エチルシアノアクリレート接着剤の少量を使用して尾側端面ダウンとビブラトームのステージに脳を接着。
   5. 400のスライス厚で脳および脳セクションをカバーするためにスクロース凍結防止剤の十分な量とビブラトームのステージ領域を埋める - 86ヘルツの振動周波数を使用して（検査すべき脳の領域に依存する）は500μmと0.125ミリメートル/秒のブレード前進速度。
   6. 小さなペイントブラシを使用して市販のメッシュ底インサートを含む0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中の6％（w / v）のスクロース10mLで予め充填された6ウェル組織培養プレートのウェルに、場所脳切片を。
   7. 4°CO / Nで暗所でセクションをインキュベートします。
3. 脳切片を開発
   1. メッシュ底インサートを使用して、0.1 Mリン酸緩衝液、pH7.4中の新しいウェルの2％の5 mLを含む（w / v）のパラホルムアルデヒド（PBD）に脳切片を転送します。 15分間RTで暗所に低速で移動しロッカー上でインキュベートします。
   2. 5mLの水を含む新しいウェルにそれらを転送することにより、二回のセクションを洗ってください。 5分間RTで暗所中速で移動しロッカーに洗います。
   3. 2.7％（v / v）の水酸化アンモニウムの5 mLを含む新しいウェルに転送部。 15分間RTで暗所に低速で移動しロッカー上でインキュベートします。
   4. 5mLの水を含む新しいウェルにそれらを転送することにより、二回のセクションを洗ってください。ウォッシュO5分間RTで暗所で適度な速度で移動ロッカーナ。
   5. 元の購入濃度から水10倍に希釈したウェル固定液Aの5 mLを含む新しいに転送部（ 材料表を参照）。 25分間RTで暗所に低速で移動しロッカー上でインキュベートします。
   6. 5mLの水を含む新しいウェルにそれらを転送することにより、二回のセクションを洗ってください。 5分間RTで暗所中速で移動しロッカーに洗います。
4. 脳切片をマウント
   1. 小さなペイントブラシを使用して、顕微鏡スライド上に切片をマウント。過剰の水を除去し、ピンセット、小さな組織を使用した寒天。脱水を進める前に、すべての寒天が削除されていることを確認してください。
   2. 約45分（400枚のμmの切片）または90分（500枚のμmの切片）を室温で空気乾燥させるセクションを可能にします。
      注：乾燥のタイミングと適切なレベルは重要であり、そしてそれぞれにおいて決定される必要があるかもしれません実験室周囲温度および湿度レベルに応じ。あまりにも短い乾燥時間は、その後の脱水工程の間に、スライドの脱落セクションにつながり、そしてあまりにも長い乾燥時間が割れセクションにつながります。セクションは、まだ乾燥の適切なレベルで光沢のように見えるだろう。
   3. 示されるように、コプリン染色ジャーにスライドを配置することにより、クレシルバイオレットで染色切片。
      注：このオプションのステップは、クレシルバイオレットと神経細胞核を染色するためには、凍結されていなかったセクションのために使用することができます。私たちは、クレシルバイオレットでのインキュベーションの前のセクションをクリアして再水和することも、セクション全体の背景を染色し、低につながることを発見しました。
      1. 5分間のエージェントをクリアするに置きます。一回繰り返します。
      2. 5分間、100％エタノールに入れます。一回繰り返します。
      3. 水中の95％エタノール、水で、次いで75％エタノール、2分間、水中で、次いで50％エタノール中場所。
      4. 5分間水に置きます。
      5. 0.5％（w / v）のCRE内の場所7分間水にSYLバイオレット。
      6. 2分間水に置きます。一回繰り返します。
   4. 示されるように、コプリン染色ジャーにスライドを配置することによって切片を脱水。
      1. 水中50％エタノール、水で、次いで75％エタノール、2分間、水で、次いで95％エタノール中の場所。
      2. 5分間、100％エタノールに入れます。一回繰り返します。
      3. 5分間のエージェントをクリアするに置きます。一回繰り返します。
         注：これらの脱水とクリア時間は、この原稿で説明したように、マウスの脳を処理するのに十分です。しかし、我々は最後のクリアステップは15分の合計まで延長する必要があるかもしれないことを、ラットおよびcowbirdを含む他の種のために観察しました。
   5. 無水マウンティング培地を用いてカバースリップセクション。
   6. スライドは、少なくとも5日間RTで暗所で水平に乾燥することができます。

太い脳切片内の2イメージングステンドニューロン

1. 画像スタックをキャプチャ
   1. 顕微鏡の電球、カメラ、およびステージコントローラをオンにします。
   2. 顕微鏡ソフトウェア（ 例えば 、Neurolucida）を開きます。
   3. 顕微鏡ステージ上にスライドを置きます。
   4. 例えば1.25×0.4 NA PlanAPO又は4X 0.16 NAのような低倍率の対物レンズを用いて脳切片の2D広視野画像をキャプチャ
      1. 画像をフォーカスと露出時間やホワイトバランスなどのカメラの設定を調整します。
      2. セクションの任意の場所を左クリックして基準点を作成します。
      3. 画像取得ウィンドウ内の「単一の画像を取得」を選択することにより、画像をキャプチャします。
   5. 10×0.3 NA UPlan FL N対物レンズを使用して、関心のニューロン（単数または複数）を含む領域の中間解像度画像スタックを取り込みます。
      1. 画像の焦点、露光及びホワイトバランスなどのカメラ設定を調整します。
      2. セクションAの頂部に焦点を合わせることによって画像スタックの上限および下限を設定しますND画像取得ウィンドウ内の次の「スタックの最上部」に「設定」、及び、セクションの底に焦点画像取得ウインドウ内の「スタックの底部」の次の「設定」を選択する選択。
      3. 画像取得ウインドウ内の「画像間の距離」次へ「を5μm」を入力することにより、5ミクロンまでのステップ距離を設定します。
      4. 画像取得ウインドウ内の「画像スタックを取得する」を選択することにより、画像スタックを取り込みます。
      5. すべての画像スタックは、X軸とY軸に少なくとも10％重なることを確認し、関心のある領域全体をキャプチャするために上記の手順を繰り返します。
   6. 30X 1.05 NAシリコーン油浸対物レンズを使用して、関心のニューロンを含む領域の高解像度画像スタックをキャプチャします。
      1. スライドにシリコーン浸オイルの4滴とスライドの上に目的を置いて、目的とOIとの間の接触を作るために確保 - 3を適用します。リットル。
      2. 画像の焦点、露光及びホワイトバランスなどのカメラ設定を調整します。
      3. セクションの上部に集束及び画像取得ウィンドウ内の次に「スタックの最上位」を「設定」を選択することにより、画像スタックの上下の境界を設定し、区間及び選択「セット」の底部に焦点画像取得ウィンドウ内の「スタックの一番下」の隣にあります。
      4. 画像取得ウインドウ内の「画像間の距離」次へ「を1μm」を入力することによって、1ミクロンまでのステップ距離を設定します。
      5. 画像取得ウインドウ内の「画像スタックを取得する」を選択することにより、画像スタックを取り込みます。
      6. すべての画像スタックは、X軸とY軸に少なくとも10％重なることを確認し、関心のある領域全体をキャプチャするために上記の手順を繰り返します。
   7. データファイルを保存し、外部処理のためのTIFF形式のすべての画像ファイルを保存します。
2. Z-投影画像とイメージのモンタージュを作成します
   1. ImageJの中のZ-投影画像を作成します
      1. バイオフォーマットプラグインがインストールされているオープンImageJソフトウェア。
      2. 「プラグイン」を選択 - >「バイオフォーマット」 - >「バイオフォーマットのインポーター」。
      3. オープンする画像スタックファイルを選択します。
      4. ファイルを開くと、「イメージ」を選択することで、RGBの形式を変更 - >「タイプ」 - >「RGB色」。
      5. "イメージ" を選択することで、Z-投影を作成する - > "スタック" - > "Zプロジェクト..."。
      6. TIFFファイルとして、二次元Z投影画像を保存します。
   2. 関心の領域全体の2次元画像モンタージュを作成します。
      1. （ 例えば 、Adobe Photoshopの）ソフトウェアを開きます。
      2. > "自動化" - - > "Photomergeの" "ファイル" を選択します。
      3. 選択して「参照」し、すべてのIMAGを追加ESファイルがマージされます。
      4. 「一緒に画像をブレンド」が選択されていることを確認し、「OK」を選択します。
      5. TIFFファイルとして関心の領域全体の結果のモンタージュ画像を保存します。

結果

500μmの厚さの脳切片 - このゴルジコックス染色プロトコルと、その2つの任意の変異体を説明400内の個々のニューロンを可視化するために使用することができます。 10×対物レンズ及びZ軸に5μmの手順を使用してキャプチャ二次元Z-突起の代表画像のモンタージュは、 図1に示されている：A1 -前帯状皮質領域1と含む冠状脳切片の大面積のためにC1二次運動野^18。セクションは、500μmので切断しました。 図1B1のセクションの軟膜表面に沿った皮質層1に見られるようにクレシルバイオレット染色を含むプロトコル変異体は、例えば、皮質細胞層の同定を可能にすることに留意されたいです。また、ノート染色した切片の同様の外観を全新鮮な組織（ 図1A1）とのプロトコルの変形を使用して、メインのプロトコルを使用して脳は長期保存（ 図1C1）用の...

ディスカッション

私たちは、厚い脳切片内の神経細胞を可視化するために、ここで2つの有用な変種と一緒にゴルジコックスの染色プロトコルを記述します。代表的な結果に示すように、長い800μmの作動距離を持つ高解像度の対物レンズの使用は、500μmので切断脳切片の深さを通して全体ニューロンの信頼性の可視化が可能になります。比較的厚い脳切片のこの研究では、任意のタイプの染色されたニューロンは完全に長く複雑先端樹状突起の木と錐体ニューロンのために特に重要であるスライス、中に含まれている確率が高くなります。例えば、げっ歯類の脳の冠状切片では、これは吻側または尾側方向に遠く延びるニューロンを含めることを可能にし、切片ステップ真正面脳を遮断する場合にも、エラーの余地を増加させます。我々は唯一の前頭面で脳切片化を記載しているが、このプロトコルは、他のPLに切片のために適合させることができます完全に単一のセクション内のラベルされたニューロンを含むために必要とされるanes。採用切片の平面は、調査中のニューロン個体群の形態学的特性に依存します。 C3 - A3：高倍率の対物レンズは、例えば図2の顕微鏡写真を生成...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
重クロム酸カリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	P188-100	危険な
クロム酸カリウム	フィッシャー・サイエンティフィ	P220-100	危険な
塩化水銀	ッシャー・サイエンティフィ	S25423	危険な
ワットマン・グレード1 濾紙	フィッシャー・サイエンティフィック	1001-185
イソフルラン	カナダの製薬パートナーズ
20 mLシンチレーションバイアル	フィッシャーサイエンティフィック	03-337-4
ショ糖	バイオショップカナダ	SUC700.1
リン酸ナトリウム 一塩基性	シグマ アルドリッチ	S5011-500G
リン酸二塩基性	シグマアルドリッチ	S9390-500G
50 mL コニカルチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	12-565-271
イソペンタン	フィッシャー・サイエンティフィ	AC126470010	別名 2-メチルブタン; 危険な
寒天	シグマ アルドリッチ	A1296-100G
小型計量皿	フィッシャー・サイエンティフィック	02-202-100
ビブラトーム	ライカ	VT1000 S
6ウェル組織培養プレート	フィッシャー・サイエンティフィック	08-772-1b
メッシュ底組織培養インサート	フィッシャーサイエンティフィック	07-200-214
パラホルマデルヒド(PFA)、16%	電子顕微鏡 科学	15710-S	危険な
水酸化アンモニウム	フィッシャーサイエンティフィック	A669S-500	危険な
コダック固定剤 A	シグマ アルドリッチ	P7542
スーパーフロストプラススライド	フィッシャーサイエンティフィック	12-550-15
CitroSolvの清算剤	フィッシャー・サイエンティフィック	22-143-975
無水エチルアルコール	商業アルコール	N/A
クレシルバイオレット	シグマ・アルドリッチ	C1791
パーマウント	フィッシャー・サイエンティフィック	SP15-100
直立顕微鏡	オリンパス	BX53モデル
カラーカメラ、12ビット	MBF Biosciences	DV-47d	QImaging part 01-MBF-2000R-F-CLR-12
3D 電動顕微鏡ステージ、コントローラー、およびエノダー	MBF Biosciences	N/A	MBF Biosciences
4X 顕微鏡対物レンズ	オリンパス	4x 0.16 N.A. UplanSApo
10X 顕微鏡対物レンズ	オリンパス	10x 0.3 N.A. UPlan FL N
30倍顕微鏡対物レンズ	リンパス	30x 1.05 NA UPlanSApo
60倍顕微鏡対物レンズ	オリンパス	60x 1.42 N.A. PlanAPO N
シリコーン浸漬油	オリンパス	Z-81114
ニューロルシダソフトウェア	MBF Biosciences	バージョン10
ImageJソフトウェア	米国国立衛生研究所	現在のバージョン	OME Bio-Formatsプラグインがインストールされた
Photoshopソフトウェア	アドビ	バージョンCS6