方法論記事

研究保護および腫瘍細胞の侵襲性をモデルとして脊髄海馬スライス培養

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DOI：

10.3791/55359

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2017年8月27日

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Martin Luther University Halle-Wittenberg, 2Department of Anatomy, University of Otago

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

切片海馬スライス培養 (一部は、OHSC) は、体内の状況を非常によくシミュレートする生体外モデルを表します。ここで述べる vibratome ベース新規物質の神経電位または腫瘍細胞の生物学的挙動の評価で使用するための高品質のスライスを取得するためのプロトコルをスライスを改善します。

要約

切片海馬スライスの文化 (一部は、OHSC) でニューロンとグリア細胞の形態学的および機能的な特性がよく保存されています。このモデルは、神経保護に関する研究、神経細胞、神経回路、または浸潤に関する電気生理学的実験を伴う研究問い合わせへの対応に適しています。海馬のアーキテクチャと海馬回路における神経細胞の活動がよく保存されている一部は、OHSC、にもかかわらずスライス手順自体初期病変とグリア瘢痕の形成につながる。など、小さな分子の拡散挙動と機械的性質、瘢痕形成はおそらく変更します。スライスは、動物の外科手術、各種脳由来細胞、アストロ サイト、ミクログリア、神経生理学的および病理学的下すなわち間相互作用の脳損傷後の時間依存プロセスの監視を許可します。条件。このモデルの相反する側面血流および血液の免疫細胞の不在であります。神経障害の進行、中に血液が重要な役割を果たすから免疫細胞の移行。それらの細胞はスライスで行方不明、文化の本質的なプロセスが外部に干渉しないで観察可能性があります。また、一部は、OHSC 媒体外部環境の組成物は、正確に制御されます。このメソッドのさらなる利点は、標準製剤と比較して犠牲にされた動物の数が少ないです。いくつか一部は、OHSC は 1 頭の動物に複数の治療法を同時研究を可能 1 つの動物から入手できます。これらの理由の一部は、OHSC は組織の損傷後や腫瘍の侵入の間に新しい保護治療の効果を分析する適しています。

提示プロトコルの一部は、OHSC 再現性の高い生成することができます準備方法を記述するここで、神経保護や腫瘍浸潤の研究のような実験的研究のさまざまな使用することができますスライスをよく保存します。

概要

一部は、OHSC 神経細胞、アストロ サイト、ミクログリア1の生理学的および病理学的性質の研究によ特徴付けられた生体外モデルであります。細胞外の環境をコントロールし、様々 な刺激の後細胞と形態学的変化を監視する簡単です。後準備2,3海馬ニューロンの組織とその接続がよく保存されています。いくつかの利点の一部は、OHSC は、動物の外科手術することがなく脳損傷およびがんの浸潤の監視を許可します。一部は、OHSC 6 〜 8 は、単一の齧歯動物の脳から入手できます。一部は、OHSC したがって大幅動物の数を減らすし、同じ動物では複数の薬物濃度、遺伝子操作または異なる病変モデルをテストできるようにするのに役立ちます。スライス ベースのアッセイでは、実験条件を正確に制御できます。また、二次被害のような病理学の条件の時間依存の開発はタイムラプス イメージングによる簡単に監視できます。

Stoppiniらによって最初に確立された特定のプロトコルに4、準備手順が記載されている、適切なスライスの選択の重要な形態学的なランドマークが強調表示されます。生後 7-9 ラットやマウス生後 4-5 の準備をお勧めします。これらの期間は、一部は、OHSC は、機械的外傷、神経回路の再編成の可能性が高い堅牢な抵抗性を示します。対照的に、萌芽期または成人ラットから準備急速に構造変更し栽培中の脊髄の形態を失う、したがって基礎研究5,6で長期的なプロセスを学ぶには適して,7,8,9,10,11. 一部は、OHSC の生存率のもう一つの重要なポイントは、拡散およびこうして栄養供給が限られた12,13,14スライス自体の厚さ。

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プロトコル

によってヨーロッパ コミュニティ評議会指令 2010年/63/EU 欧州議会を承認済みとして倫理ポリシーおよび神経科学研究の動物の使用に関する方針に従って動物実験を行ったと科学的な目的に使用される動物の保護に関する欧州連合理事会の

。

1 器具文化メディア準備

  1. の一部は、OHSC 準備のため楽器の次のセットを使用して、: 2 つの小さなはさみ、2 つピンセット、繊細なティップを持つ 1 つのピンセット (サイズ 11、15 のサイズの 1 つの 2 つ)、3 つのブレード。3 メス ホルダー、ラウンド フィルター ペーパー (直径: 35 mm)、寒天、1 つのかみそりの刃、パスツール ピペット、未変更の状態の 1 つであり、1 つ変更パスツール ピペット チップなし。( 図 1) 使用前にオートクレーブのすべての材料を滅菌します
    2. 。
  2. 寒天 5 g の重量を量るし、100 ml の蒸留水に溶かします。滅菌オートクレーブ 210.8 kPa 121.7 ° C で 20 分のためのソリューション。滅菌ガラス ピペットを使用して 60 mm ペトリ皿で 3 mL 液体寒天液を配布、5 h を固めるは、汚染を避けるため、さらに使用するまで 4 ° C で保存しプラスチック パラフィン フィルムでカバーすること。寒天ブロックがスライスのプロシージャの間に脳を安定させるために必要な
    3. 。
  3. メディア
    1. 準備中 (pH 7.35)、200 mL で 198 mL 最小必須培地 (MEM)、2 mL L グルタミン ソリューション (最終濃度 2 mM)。メディアの準備の日にソリューションを準備し、4 で保存 ° C
    2. 準備 49 mL MEM、25 mL ・ ハンクスから成る培養液 100 mL ' バランスのとれた塩溶液 (HBSS)、25 mL (v/v) 通常の馬血清 (NHS)、L-グルタミンの解決の 1 mL (最終濃度 2 mM)、100 μ g インスリン、血糖値 120 mg 10 mg ストレプトマイシン、10,000 U ペニシリンと 800 μ g ビタミン C 既に報告されています。ミディアム (37 ° C) を暖かい、pH 7.4 で滅菌フィルター (0.2 μ m 孔サイズ) に pH 値を調整します。媒体を変更する前にすべての 2 日目 (ウォーミング アップ、pH 調整等) 手順を繰り返します。1 週間で最もメディアを使用 4 で保存する場合 ° C
  4. 脳を格納する準備の中で 1 つの 35 mm のペトリ皿を埋めます。作業領域の冷却パックに組織を収集するため 2 空のシャーレを配置します
    5. 。

2。準備と、Vibratome とスライス

  1. 使用脳 7-9 日古いラットからまたは 4-5 日 Stoppini ら によると一部は、OHSC 準備のため古いマウスします 。4 動物の斬首後、は、はさみで、頭蓋骨から皮膚を削除する。
    2. 。
  2. は後頭に導入して高級シザーの刃と尾側吻側 (奥) (フロント) 軸に沿って切断して頭蓋骨を開きます。2 つ作るは、それぞれ左と右耳に向かってハサミを指すので、最初の 1 つに垂直をカット (" T 切開 ").
  3. は、脳を傷つけないように注意を払って、高級ピンセットで慎重に頭蓋骨を開きます。前頭葉と小脳の最も吻側部をカットするメス (ブレード サイズ 11) を使用します
    4. 。
  4. はヘラの手段で脳を削除し、準備中 ( 図 2) でいっぱいペトリ皿に慎重に配置します。試料ホルダーに脳を置き、医療シアノアクリ レート系接着剤で固定します。機械的な安定を確保するために、寒天の部分を使用します
    5. 。
  5. 350 μ m で水平方向に組織を解剖スライド式 vibratome を使用して厚い一部は、OHSC
    6. 。
  6. は、光学双眼顕微鏡を使用してスライスを評価します。低品質の一部は、OHSC をすぐに破棄します。海馬の中央部から分離されたそのままの細胞構築とそれらのスライスのみを取ることが重要です (図 3 および図 4 を参照)、背側と腹側海馬と
    7. 。
  7. 別の海馬領域と (丸刃サイズ 15; メスによる嗅 図 3)。貫通経路と嗅皮質を保持する必要があります
    8. 。
  8. 一部は、OHSC 6 ~ 8 はそれぞれの脳から取得されます。2-3 スライスを 1 つのセルの文化挿入 (細孔サイズ 0.4 μ m) に転送し、ウェルあたり 1 mL の培養液を含む 6 ウェル培養皿の 1 つもです
    9. 。
  9. 5% (v/v) CO 2 と完全に加湿雰囲気で 35 ° C で 6 よく料理を孵化させなさい、細胞培養培地は 2 番目毎日変更します
    。 注: は、6 日 体外 (div) にあなたの実験を行います。6 日目でスライスのプロシージャに関連付けられている炎症反応が消えてしまいます。再びミクログリア細胞の表示区分された形態をこの段階で、シナプスが成熟している
    10. 。

3。組織品質の評価

  1. 固定、ラベリングと可視化の一部は、OHSC 変性ニューロン
    1. 実験を実行した後で 5 μ G/ml propidium ヨウ化 (PI)、固定する前に 2 時間、一部は、OHSC を孵化させなさい。変性神経細胞の核を染色する順序
      。 注意: PI は疑わしい発癌物質、常に手袋などの個人保護用具 (PPE) を着用します
      2. 。
    2. 0.1 M リン酸緩衝液 (7.4) と、一部は、OHSC を洗う、パラホルムアルデヒド (PFA) 24 時間のための 4% (v/v) 溶液で固定
      注意: PFA は有害と疑われる発がん性物質です。ヒューム フードの下で動作し、PPE を着用します
      3. 。
    3. 1 ml の PBS の挿入で、一部は、OHSC を洗うし、リガー ブラシを使用して、スライスを細胞膜から分離します
      4. 。
    4. 染付 IB 4 24 ウェル プレート ( 図 5) で、一部は、OHSC のラベルします
      5. 。
  2. 蛍光を用いた腫瘍侵入実験の伝導標識単一細胞
    1. の実験開始前に 24 h 蛍光色素 Carboxyfluorescein アセテート染色による腫瘍細胞にラベルを付けるエステル (CFDA SE).
    2. デタッチ ノイバウアー チャンバーを用いた腫瘍細胞を数えると
      3. 。
    3. 懸濁液の 10 μ L が目的のセル数 (通常 50,000 または 100,000 細胞) を含むような培地で細胞を再懸濁します
      4. 。
    4. 3 日間侵入する細胞ができ、スライス培養に細胞懸濁液の 10 μ L を適用します
      5. 。
    5. 実験の最後に、4% (v/v) PFA、24 時間を使用してスライス培養を修正し、細胞構築を可視化する別の 24 h の PI と共培養のラベルします
      。 注意: PFA は有害と疑われる発がん性物質です。ヒューム フードの下で動作し、PPE を着用します
      6. 。
    6. メディアをマウントを使用してさらに分析のカバー スリップの上に共培養をマウントします
      7. 。

4。一部は、OHSC 実験の評価

共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) で、一部は、OHSC を分析します。円周率の検出ラベル、ニューロンの変性または細胞構築をラベル PI 使用波長 λ の単色光 = 543 nm、発光帯の波長 λ のためのフィルターを渡す = 585 615 nm。腫瘍細胞または IB 4 ミクログリアというラベルの付いた、CFDA、励起波長 λ を使用して = 488 nm。両方の実験の種類は、2 μ m の光学的スライス厚と z スタックを記録し、評価に使用します

。

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結果

神経保護の研究:神経損傷、PI 肯定的な核と IB4 (DG) 歯状回の顆粒細胞層 (GCL) のすべての 3 番目の光学セクションにおけるミクログリアに数えられた正の数を確認します。腫瘍の侵入実験のためスタックの最大強度 z 投影は侵略と異なる侵入パターン (図 6) を視覚化する手段として腫瘍細胞によって覆われる領域を計算するため使用されました。

未処理のコントロールの一部は、OHSC (CTL) ニューロンに色濃く残った。DG の GCL のほとんどない PI 肯定的な神経核 (図 5 a) が観察された.分子層におけるミクログリア細胞の大半が分岐しました。DG、のみの GCL の非常に少数の IB4陽性ミクログリア細胞 (

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ディスカッション

この議定書では、一部は、OHSC の準備について説明します。このモデルは、組み込み機能と脳の反応の生理学的および病理学的刺激の適用後テストできます。ほかに電気生理学的パラメーターの解析では、一部は、OHSC は破壊することができます、あらゆる細胞に損傷の影響を決定できます。さまざまな物質と示したプロセスやマクロファージとリンパ球の不在で癒しの詳細な説明と治療が可能です。

The most 成功の準備と培養が重要なステップ: 1) 無菌条件下での作業、2) メディアの準備、正しく温度と pH を考慮した、3) の一部は、OHSC 処理中に必要な手先の器用さを開発します。

一部は、OHSC の特性

神経細胞の不変の形態のための体内の組織のようなスライス切片と呼びます。一部は、OHSC は錐体・ コルニュ ammonis (CA2、CA1、CA3) と DG 顆粒細胞から成る地層属三角骨と地層...

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開示事項

著者がある何も開示するには

謝辞

著者は、優れた技術的な援助のためのビデオ録画とハリッド Ghadban 彼女を扶養するクリスティン Auste を感謝したいです。ウルシュラ Grabiec は、ルーの Programm FKZ 29/18 によって支えられました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6ウェルFalcon35-3046
寒天Fluka5040
AutoclavSystecDX-45
CFDA サーモフィッシャーV12883
共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)LSM700カールツァイス
イーグル&急性;s ミニマル・エッセンシャル・メディウム Invitrogen32360-034
フルオレセイン標識グリフォニア(バンデイレア) Simplicifolia レクチン IベクターラボFL-1101
グルコースメルク1083371000
グルタミンInvitrogen25030-024
ハンク&急性;S Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+)Invitrogen24020-133
Hank´S Balanced Salt Solution (Without Ca2+  and Mg2+)Invitrogen14170-138
InsulinSigma AldrichI5500
L-アスコルビン酸Sigma AldrichA5960
L-GlutaminInvitrogen25030-024
LN229Cell-Lines-Service300363
医療用シアノアクリレート接着剤(ヒストアクリル接着剤)B.Braun1050052
Millicell Culture InsertsMilliporePICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acidSigma AldrichM3262
Normal Horse SeumInvitrogen26050-088
Penicillin StreptomycinInvitrogen15140-122
ペトリ皿(すべてのサイズ)Greiner627160/664160/628160
PFARoth0335.1有毒
ヨウ化プロピジウム (PI)Sigma Aldrich81845-25MG有毒
U138ATCCHTB-14
ビブラートームライカ ライカ VT 1200
なな

参考文献

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