電気刺激を使用してBiowires中のヒト幹細胞由来の心筋細胞の成熟

サマリー

心臓biowireプラットフォームは、電気刺激と三次元細胞培養を組み合わせることによって、ヒト胚および誘導多能性幹細胞由来の心筋細胞（HPSC-CM）を成熟するために使用されるインビトロの方法です。この原稿は、心臓biowireプラットフォームの詳細な設定を提示します。

要約

ヒト多能性幹細胞由来の心筋細胞（HPSC-CMS）は、有望な細胞源となっているため、創薬、疾患のモデリング、組織工学、再生医療を含む心臓研究におけるそれらの潜在的なアプリケーションの調査を奨励しています。しかし、既存のプロトコルにより生成される細胞は、天然成体心室心筋細胞と比較して未成熟の範囲を表示します。多くの努力がこれまで達成のみ中等度の成熟に、HPSC-CMSを成熟する試みがなされてきました。したがって、biowire呼ば操作システムは、in vitroでのより成熟した状態にHPSC-CMSをリードする物理的および電気的の両方の手がかりを提供することによって考案されています。システムは、私が徐々に増加する周波数と電場刺激にさらされる整列心臓組織（biowire）にアセンブルする剛性テンプレート縫合糸に沿ってゲル型コラーゲンにHPSC-CMSを播種するために微細加工プラットフォームを使用します。非刺激対照と比較して、biowired心筋細胞は、構造的および電気生理学的成熟の強化度を示す刺激しました。このような変化は、刺激速度に依存します。本稿では詳細にbiowiresの設計と作成について説明します。

概要

セルベースの治療が最も有望なの一つであり、心臓修復/再生を実現するための戦略を検討しました。これは、心臓組織工学と生体材料^1、2の共同送達によって助けられています。ほとんどの利用可能な細胞源は、損傷、病気の、または高齢者の心³上の彼らの潜在的に有益な効果のための動物モデルで研究されています。具体的には、多大な努力は、ヒト多能性幹細胞を使用する試みがなされている（HPSC）は、心筋（HPSC-CM）、心臓組織工学のための潜在的に無制限の自己細胞源由来しました。 HPSC-CMSは、いくつかの確立されたプロトコル^{4、 図5、 図6を}用いて製造することができます。しかし、得られた細胞は^、成体心室心筋⁷に比べ未熟特性の範囲は、胎児様表現型を表示します ^8。これは、創薬研究における成人の心臓疾患モデル⁹の開発における成人の心臓組織のモデルとしてHPSC-CMのアプリケーションに障害となり得ます。

表現型の未熟さのこの制限を克服するためには、新しいアプローチが積極的に心筋細胞の成熟を促進するために研究されてきました。初期の研究は、環状機械¹⁰又は電気的刺激¹¹を介して新生児ラット心筋細胞における効果的なプロ成熟特性を明らかにしました。ゲルの圧縮および環状機械的刺激はまた、電気生理学およびカルシウムハンドリング性の最小の増強とのhpSC-CMの成熟^12、13、のいくつかの側面を改善することが示されました。したがって、「生物学的ワイヤ」（biowire）と呼ばれるプラットフォームシステムは、構造的な手がかりと電界の両方を提供することによって考案されたstimulatioHPSC-CMS ¹⁴の成熟を強化するためのn。このシステムは、電場刺激を受けやすい整列心臓組織を作成するための微細加工プラットフォームを使用しています。これはHPSC-CMの構造的および電気生理学的成熟度を向上させるために使用することができます。ここで、我々は、このようなbiowiresを作るの詳細を説明します。

プロトコル

1.マスターデザインと製作

注：デバイス製造にソフトリソグラフィを使用してください。ポリジメチルシロキサン（PDMS）成形用の2層SU-8マスターを作成します。

1. 設計と製図ソフトウェアを使用してデバイスを設計します（ 図1A 、左）。マスターの各レイヤーを個別に描画します。マスタ^15の 2つのレイヤに対応する2つのフォトマスク（20,000 dpi）にデバイスデザインを印刷します。デバイスパターンを透明に設定し、周囲の領域を暗く設定します。マスクはリソグラフィー（他の¹⁵に記載されているように）によってデバイスパターンをSU-8上に光学的に転写するためのテンプレートとして役立つ。
2. 約4mLのSU-8 50を4インチシリコンウェハの中心に分配する。 2000回転/分（RPM）で30秒回転させることにより、スピンコータを使用してSU-8 50をウェハ上に均一に塗布する。ウェーハを95℃のホットプレート上で10分間焼く。ウェハを紫外線（UV）liに暴露する量200mJ / cm ²でGHT。
3. 30秒間2500rpmでウェハとスピンの中心上にSU-8 2050の約4ミリリットルを注ぎます。 15分間95℃のホットプレート上で焼きます。室温（RT）に冷却します。
4. 繰り返しステップ1.3をさらに2回。
5. 第1層目の透明フォトマスクで被覆されたウェハを覆います。第一の層を作るために270ミリジュール/ cm ²のUV光にウェハを露出します。 15分間95℃のホットプレート上で焼きます。
6. 二回ステップ1.3を繰り返して、SU-8 2050年の第二の層を作ります。
7. マスクアライナを用いて第1の層上のフィーチャに第二層マスクを整列させます。次いで、240ミリジュール/ cm 2のUV光にさらします。 15分間95℃で焼きます。
   注：露光時間が必要とされる全UV線量と使用前の日に測定されたUV光出力強度によって決定されます。
8. プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート（PGMEA）にそれを浸漬し、オービタルシェーカー上で30分間、200RPMで振盪することによってウェハを開発。
9. 場所ウェーハの中心に：マスターペトリ皿へと慎重には、PDMSの混合物（重量で1〜10の割合で、架橋剤を塩基）を注ぎます。すべての機能を網羅し、気泡を避けます。
10. 2時間70℃のオーブンで加熱。 PDMSのbiowireテンプレート（右図1A）のエッジの周りに切断する鋭利な刃を使用。マスターからPDMSの皮をむきます。ブレードとデバイスをトリム。 20分間121℃で滅菌ポーチと蒸気オートクレーブ中でPDMSのbiowireテンプレートを置きます。
11. 安全キャビネット（BSC）では、ペトリ皿にPDMSのbiowireテンプレートを配置します。チャネルの両端の溝の中に着座することによりPDMSマイクロウェルのチャネル（ 図1B-I）の中央に無菌外科用絹縫合糸（6-0）の部分を保持し、マウントするピンセットを使用。

電気刺激商工会議所の2創出

1. 2cmのX：長方形のポリカーボネート片（長さ×幅×厚さのペアを作ります0.85 X 0.35センチメートルCM）および電気刺激室（ 図2）のフレームとしてそれらを使用します。
2. 2センチメートル離れポリカーボネートフレームピースの中心線に沿ってドリル2つの幅3mmの穴。
3. 長さ1.5cm炭素棒の2枚をカット。端から3mm程度の炭素棒を介して1mmの広い穴をドリル。カーボンロッド孔から白金線を通し、カーボンロッドの周りを包むことによって、ワイヤを締め付けます。電気刺激とそれ以降の接続のための白金線の他端にクリップを取り付けます。
4. ポリカーボネート枠片に炭素棒を挿入します。 6ウェルプレートのウェルに炭素棒に組み付けフレームを置き。
5. ウェルにPDMSの2ミリリットルを注ぎます。近隣にPDMS表面レベルを維持するが、炭素棒の底部に到達していないがPDMSポリカーボネートフレームの底部を水没。 2時間70℃のオーブンで加熱。
6. 6のうち、電気刺激室を取ります型ウェルプレートおよび20分間121℃で蒸気滅菌のために滅菌袋に入れ。

HPSC-CMの3酵素的解離

1. 確立されたプロトコル^4を使用して心筋細胞に分化するようにHPSCを誘導します。
   注：簡単に述べると、骨形成タンパク質4、塩基性線維芽細胞成長因子、アクチビンA、血管内皮増殖因子、およびDickkopfホモログ1 ⁴と順次補充を通じて幹プロ培地中で確立された胚様体（EB）プロトコルを介して心筋細胞を生成します。 biowiresを作るために分化の日20-34からのEBを使用してください。
2. P1,000ピペットチップを用いて低付着プレートからのEBを収集し、コニカルチューブに移します。 125×gで、室温で5分間の遠心分離によってペレット。上清を捨て、予め温めでペレットを再懸濁し、37℃のコラゲナーゼタイプI、1％デオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）を含有します。 2時間37℃でインキュベート消化のために。
3. 予め温めの5 mLを加え、37℃、125×gで、室温で5分間培地および遠心分離を洗います。上清を捨てます。トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液2mLでペレットを再懸濁し、5分間37℃でインキュベートします。
4. 3％を含有する停止培地1mL（v / v）のDNアーゼIを追加
5. 5 mLの注射器に20 G（1.5 mm）の針を取り付け、それを介して3-5回EB懸濁液を渡します。
6. 5分間280×gでの洗浄媒体および遠心分離機の7ミリリットルを加えます。上清を捨てます。イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）中にペレットを再懸濁し、氷上で保存します。血球計算盤で細胞数を決定します。 5分間280×gで遠心分離することにより、0.5×10 ⁶個の細胞ペレットを取ります。上清を取り除きます。
7. 滅菌チューブにそれらを混合する前に、氷上でプレクール全てゲル成分。以下コラーゲンゲル成分（最終濃度）を混ぜる：2.1 mg / mlとラット尾コラーゲンI型、24.9 mMグルコース、23.8ミリモルのNaHCO _3、14.3 mMのNaOHを、10mMのHEPES、および1×M199培地で10％の細胞外マトリックス。最後に、コラーゲンおよび細胞外マトリックスを追加します。ピペッティングにより混和します。
8. コラーゲンゲルの3.5μLを用いて0.5×10 ⁶細胞を再懸濁し、よく混合します。
9. 0.5センチメートル長チャンネル（ 図1B-II）中の細胞懸濁液の4μLを追加するP10ピペットチップを使用します。必要に応じて滅菌ピンセットを用いて縫合糸の位置を調整します。
10. ゲルに触れないように確認しながら、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いてペトリ皿の底を覆います。 37℃で30分間インキュベートします。
11. 細胞（ 図1B-III）をカバーするのに十分な、（ 例えば、Proまたは細胞メーカーが推奨する培地幹細胞）の培養培地の12 mLのPBSに置き換えます。 1週間37℃のインキュベーターで培養。一日おきにメディアを変更します。

Biowire栽培4.電気刺激

1. にBSCは、電気刺激チャンバを収容する6ウェルプレートの各ウェルに2mlのPBSを加えます。優しくウェルにオートクレーブし、電気刺激装置を配置するために滅菌ピンセットを使用してください。井戸からPBSを捨ててください。
2. 予め温めた培地5mlで炭素棒を覆います。電気刺激チャンバ内biowiresをマウントし、滅菌ピンセットを使用して、炭素棒（ 図2）に直交して配向します。
3. 6ウェルプレートの上部に蓋を置くが、電気刺激装置に接続するプレートの外側に到達するのに十分な白金線を残します。 37℃で細胞培養インキュベーター中で6ウェルプレートを配置し、電気刺激に白金線を接続します。
4. 二相性パルス繰り返し、1 msのパルス持続時間、3 V / cmで、毎秒1つのパルス（PPS）：電気的な次の設定を有する刺激装置を用いてbiowiresを刺激します。次の値にPPSを24時間毎に上げる：1.83、2.66、3.49、40.82、5.15、および6変更中隔日。
5. 10倍の倍率で顕微鏡下で、電気刺激に応答した心筋細胞の収縮性を観察します。
   注：刺激の1週間後、biowiresが成熟になり（結果のセクションを参照してください）。

結果

biowiresにおける縫合糸の使用のための合理は、一つの軸に整列し、心臓の繊維の形状を模倣する3D構築物の形成のためのテンプレートとして機能します。私たちは、biowireにおける文化の7日後に、細胞は、縫合糸（ 図3A）の周囲にゲルを改造することを示しています。細胞が整列し、心臓組織（ 図3）を形成するために、縫合糸の軸に沿って組み立てられました。前培養の7日後、biowires 7電場刺激の日と心筋の構造的および機能的成熟と互換性がさらに示される特性に供しました。

biowiresにおけるヒトPSC-CMは心収縮タンパク質の強い発現、筋節αアクチニン、およびアクチン（ 図4A）を示しました。我々は、筋原繊維狭窄のHPSC-CMの収縮装置及びアラインメントのサルコメアバンディングを観察し縫合糸の軸に沿っ。これは成人の心臓（ 図4...

ディスカッション

この原稿はHPSC-CMの成熟を改善するために、設計プラットフォーム、biowireのセットアップと実装について説明します。デバイスは、標準的な微細加工設備で行うことができ、そしてbiowiresは、共通の細胞培養技術及び電気刺激を用いて製造することができます。

我々の知る限りでは、biowiresに似一切報告されている方法はありません。この戦略は、より高い刺激レートのランプアップレジメン（3ヘルツ対6ヘルツ）に供biowiresで得られた大きな成熟レベルによって証明されるように改善された成熟特性は、電気刺激療法に依存していたことがわかります。 biowiresにおける心筋細胞はあまり自動性と高いhERG電流を示し、 私がしたEBに比べ_K1 20日（EBd20）または40-44日（EBd44）のために栽培しました。 EBd44心筋細胞を10日間培養したLに対しEBd20心筋細胞は、biowiresへの組み込みの前に細胞の特性を表現しましたbiowire培養時間よりonger、さらにEB形式で培養中のより長い時間と、心筋細胞はbiowiresに...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
L-アスコルビン酸	Sigma	A-4544	hPSC-CM 培養培地コンポーネント
AutoCAD	Autodesk, Inc		デバイス
を設計するソフトウェア カーボンロッド、Ø 3 mm			電気刺激装置チャンバーコンポーネント
コラーゲン、1型、ラットテール	BD Biosciences 354249		コラーゲンゲル:24.9 mM グルコース、23.8 mM NaHCO3、14.3 mM NaOH、10 mM HEPES に 2.1 mg/mL ラットテールコラーゲン I 型、10 % の成長因子還元マトリゲルを含む 1x M199 培地中。
コラゲナーゼI型	Sigma	C0130	Ca2+および Mg2+.0.22 μ で滅菌します。mをろ過し、12mLアリコートを作ります。-20°Cで保管してください。
デオキシリボヌクレアーゼI(DNase I)	EMD Millipore	260913-25MU	DNase Iを水に1 mg/mLストック溶液で調製します。滅菌済みでろ過し、0.5 mLのアリコートを&minusで保存します。20度;C
ドリル&ドリルビット(Ø 1 mm and 2 mm)	ドレメル		ポリカーボネートフレームの穴あけ
電気刺激装置	Grass	s88x
ウシ胎児血清(FBS)	株式会社WISENT	080-450
D-(+)-グルコース	Sigma	G5767	コラーゲンゲル成分
L-グルタミン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25030081
H2O	MilliQ		18.2 MΩ&ミッドドット;25°Cのcm。C、超高純度、すべてのソリューションを作るために
HEPES	Sigma	H4034	コラーゲンゲル成分
ホットプレート	トーリーパインズ	HS40
イスコーブの修正ダルベッコの媒体(IMDM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12440053
マスクアライナー	EVG	EVG 620
マトリゲル、成長因子低下	コーニング	354230	コラーゲンゲル成分
培地 199 (M199)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11825015	コラーゲンゲル成分
モノチオグリセロール (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM 培地成分
オービタルシェーカー	VWR	89032-088
ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15070063
Ca2+およびMg2+	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14040133
プレート(6ウェル)	Corning	353046
プレート(6ウェル)、低アタッチメント	Corning	3471
Platinum wires、0.2 mm			電気刺激装置チャンバー成分
ポリジメチルシロキサン(PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(PGMEA)	Doe &インガルス(株)		ウェーハポーチを開発するには
、ピールオープン	コンバーター92308	蒸気滅菌用
シリコンウェーハ、4インチ	UniversityWafer株式会社。
重曹(NaHCO3)	Sigma	S5761	コラーゲンゲル成分
水酸化ナトリウム	Sigma	S8045	コラーゲンゲル成分
スプリンコーター	スペシャルティ・コーティング・システムズ	G3P-8
StemPro-34 培地	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	10639011	hPSC-CM培地。50 mLを作るには、1.3 mLのサプリメント、500 μ100×のL;L-グルタミン、250 μ30 mg / mLトランスフェリンのL、500 μ5 mg / mLアスコルビン酸のl、150 μL of 26 μl /2 mL モノチオグリセロール (MTG)、および 500 μL(1%)ペニシリン/ストレプトマイシン。.
ストップメディア			洗浄媒体:FBS (1:1)
SU-8 50	マイクロケム株式会社		フォトレジスト、マスターコンポーネント
SU-8 2050	マイクロケム株式会社		フォトレジスト、マスターコンポーネント
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM 培地成分
トリプシン/EDTA、0.25%	サーモフィッシャーサイエンティフィック	25200056	hPSC-CM 培地成分
ウォッシュ培地			1% ペニシリン/ストレプトマイシン含有 IMDM