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方法論記事

マウス精母細胞から減数分裂期染色体の準備をスプレッドします。

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DOI:

10.3791/55378

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2017年11月22日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Drexel University College of Medicine, 2Department of Obstetrics & Gynecology, Drexel University College of Medicine

この記事について

サマリー

減数分裂は、DNA 複製の単一の円形および染色体の 2 つの連続したラウンドを経て、配偶子が形成される過程です。哺乳類の減数分裂は、減数分裂期染色体のスプレッドを準備する技術を活用して調べることができます。ここでは、表面拡散マウス精母細胞から核を準備する方法を示します。

要約

哺乳類の減数分裂は、生殖細胞の発生し勉強でき、特徴と動的過程です。メソッドを使用してスライドの表面に核を拡散 (ドロップの高さから) ではなく 1997 年に最初に記述されたマウス精母細胞に最適化手法を示します。広く用いられる前期 I. 精のサブステージを受けている高品質の核の茄多が増すので、哺乳類の減数分裂を研究する研究室で尿細管はまずにうねり精母細胞を低張液に配置されます。精母細胞は、細胞懸濁液を作成するショ糖液中に放出され、核に固定液に浸したガラス スライド上に広がっています。免疫染色、続いて減数分裂のプロセスに密接に関連蛋白質の多様性を調べることができます。たとえば、減数分裂、同族体の染色体軸/コアを一緒に接続する三者構造のタンパク質を簡単に視覚化できます。減数分裂組み換え蛋白質の相同組み換えによる DNA 二重鎖切断の修復に関与しているには前期の進行を評価する immunostained することができます私。ここで我々 の説明し、サンプルの詳細少年や成人男性マウスから精母細胞の減数分裂を哺乳類の研究に広く用いられる手法です。

概要

マウスは、哺乳類における減数分裂を勉強するモデル生物として広く使用されます。通常の発達プロセスと減数分裂の間に発生する欠陥の両方を評価できます。タイムラインと減数分裂の制御に重要なプロセスに関与する特定の蛋白質の多数と同様に、私は、サブステージ、前期中に発生する顕著な特徴の進行は、野生型と変異マウスの両方で特徴付けられます。減数分裂 (ヘンデルと Schimenti1レビュー) 詳細に勉強中に発生するいくつかの専門にされたプロセス。DNA 二重鎖切断 (DSB) の形成と修復、再結合、減数分裂形成と染色体分配が含まれます。

減数分裂のプロセスを学習の重要な側面は、視覚的および光学的により良い解決される含んでいる相同染色体を区別し、私は 5 のサブステージから成る I. 前期前期のサブステージを識別する核を調べる能力減数分裂 (SC) の形成を含む特定の機能が特徴です。SC は、ペアリングできるようにする三者タンパク質足場と同族体の DNA 二重鎖切断修復です。Leptonema、中に同族体揃える SC の軸要素が定められています。Zygonema 中に、減数分裂にアタッチする中心的な要素とは、同族体のペア間のペアリングおよび物理的な接続 (シナプス) を促進します。Pachynema、中に同族体のシナプスが完全になるし、DNA のクロス オーバーが相同組換えを介して DNA 二重鎖切断の修復から形成されています。SC は、desynapse が彼らのセントロメアおよび DNA のクロス オーバーのサイトで接続されたまま同族体を許可する diplonema、中に逆アセンブルします。最後に、移動中に同族体 recondense、中期への移行は、1を発生します。

歴史的には、前期の初期段階からの特にそれらいくつかの核をもたらした減数分裂期の染色質の表面拡散私2。その結果、これらのメソッドは、(睾丸、卵巣) の組織からの細胞の分離、拡散の減数分裂クロマチンの手法と評価2,3,の高品質減数分裂核の収量を改善するために変更されました。4します。 さらに、このメソッドが核保持に有用であることが証明、公開タバコプロトプ テクニック5,6,7で示されるように、クロマチンが減数分裂核タンパク質をバインドします。したがって、メソッドは当初ピーターズ2で記述し、前期の leptotene、zygotene、pachytene、diplotene、および移動のサブステージを受けている同族体を含む多くの独立したバースト精母細胞核の利回りを示す私。

表面拡散核 (クロマチンのスペクトラム解析とも呼ばれます) の準備の技術、広く減数分裂生殖、細胞生物学の分野での研究に使用されます。表面拡散核を含むスライドは興味の蛋白質に抗体と immunostained をその後することができますまたは銀染色に服従し、顕微鏡で解析。メソッドは、雌マウス2の変更が記載されているが、男性と女性の両方のマウスと似ています。精細管を overmince ことが重要です。免疫染色の同族体を後にその核必要がありますも広がりも、関連付けられているタンパク質が顕微鏡で見えます。表面拡散核をわずか数時間でいずれかの immunostained すぐに準備または融解と免疫染色の前に 3 週間の最大-80 ° C で保存できます。ただし、最適な結果がすぐにまたは表面拡散核の準備の 2 週間以内に免疫染色を実行する場合いくつかの蛋白質の得最高。スライドは、興味の蛋白質に抗体を用いた標準的なプロトコルと immunostained をすることができます二次抗体を蛍光共役タンパク質や色素、培養で後蛍光顕微鏡8のイメージを作成します。生後 15-21 では、野生型 6-10 スライドを生成する精巣のペアあたり十分な組織と古いマウス (大人も含む) を行えば、さらにスライド。しかし、野生型マウス 6 週間以上も得られませんより後減数分裂細胞 (すなわち細胞) の免疫染色を次のスライド。さらに、前期のすべてサブステージ私観察できる少年と大人のマウス。生後 10 15 からで男性の精巣より多くの leptotene と zygotene の細胞を得られます。マウス生後 14 に 15 より古いより多くの pachytene と diplotene の核になります。

ここで我々 の説明し、サンプル マウス精母細胞から表面拡散核の準備の広く使われている方法です。

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プロトコル

マウスを含むすべてのメソッドは高い倫理や福祉の基準を利用し、機関動物ケアとドレクセル大学医学部利用委員会によって承認されました。

1. ソリューションおよび必要な機器の準備

  1. 50 mL の超純水研究室グレード水、pH 8.2 8.4 (表 1) に低張性抽出バッファー (HEB) を準備します。新鮮な氷の上各時間を維持し、スプレッド; を準備する 2 時間以内使用ソリューションします。これを減らすとそれぞれ, PMSF と DTT の活動を阻害するプロテアーゼを最適化するために必要です。マウス精巣のペアごとに HEB の 10 mL を使用します。
  2. グレード水スクロースの 0.342 g を 10 mL の超純水の検査に追加することにより 100 mM ショ糖液 (たび新鮮な) を準備します。8.2 に pH を合わせなさい
  3. 固定液を準備 (1% パラホルムアルデヒド (PFA)、0.15% トリトン X-100、pH 9.2 1 N の HCl と 1 N NaOH を) 新鮮な毎月とストア部屋の温度で、それは光から保護します。16% 市販 PFA 開始在庫作業在庫として使用するため 1x PBS で 4% に希釈し、-20 ° C で 4% 因数を保存
    1. 固定液を準備する 4 %pfa 溶液 10 mL と 10% の 600 μ L を追加 30 mL の 1x PBS にトリトン X-100 ミックスも、1 N の HCl と 1 N NaOH 9.2 に pH を調整します。(4 週間以上) の部屋の温度でアルミ箔に包まれた 50 mL の円錐管に固定液を格納します。
  4. 写真 Flo 200 洗浄溶液 (スライドは、最後の 30 分を乾燥、) 間の準備: 0.4% 写真 Flo 200/PBS (80 mL の 1x PBS の中に写真 Flo 200 320 μ L) と 0.4% 写真 Flo 200/dH2O (超高純度研究所グレード水 40 ml に写真 Flo 200 160 μ L)。40 ml ソリューションの 50 mL Coplin jar を使用して、一度に 10 個以下のスライドを洗浄します。
  5. 次の楽器の準備: (皮膚を切開) に手術用はさみの 1 ペア ファインチップ外科はさみ (腹膜を切開) に、1 組 2 組 (それぞれの精巣を解剖) をまっすぐファインチップ鉗子の (それぞれの精巣を切開) に 1 ストレート エッジかみそりの刃、(それぞれの精巣を固定し、, 精細管内を絞り出す) にヒント鉗子の 2 組、50 mL Coplin jar、テフロン印刷 3 リング スライド、サイズ 11 刃、加湿チャンバー、100 × 15 mm ペトリ皿、ファインチップ永久的なマーカーや鉛筆で 1 メスとプラットフォーム回転シェーカー。
    1. 場所プレミアム中性 precleaned 使用するまで固定液でいっぱい 50 mL Coplin jar に直立曇らされた最後ガラス スライドです。
      注: スライドはその後エタノール、蛍光の in situハイブリダイゼーションなどを必要とする手続きに使用する場合は、鉛筆は最寄り。

2. 精母細胞核拡散

  1. 制度のガイドライン (例えば頚部転位 CO2窒息の有無) によると男性マウスを安楽死させます。
  2. 使用 P10 - P20 男性精子; の最初の波で減数分裂の細胞を評価するには我々 は日常的に P15 を使用 - P17 男性成人の精巣は、前期 i すべてのサブステージからセルを取得するセル前期から私が、彼らはまたより postmeiotic の細胞などの細胞が得られます。
  3. 収穫し、重量 (ペアの重量を記録) 精巣;湿潤を保つために冷たい HEB の数滴を含むシャーレに置き、それら。
  4. 鉗子先端が曲線状で皿の底に対して精巣を保持して精巣のカプセルを小さな垂直正中線切開にストレート エッジかみそりの刃を使用します。1 つの鉗子で、皿の底に対して精巣を押したまま、精巣の精細管を軽く圧迫するのに湾曲した先端の鉗子やストレート エッジかみそりの刃の 2 番目のセットを使用します。
    1. 冷たいなして、チューブにカプセルのピースを置くことを避けるために世話の 10 ml、15 mL の円錐管に細管を配置します。2 番目の精巣でこれらの手順を繰り返します。
  5. なして精巣のサイズによっては、30-60 分間氷の上を含む円錐管でカプセル化解除される精細管を孵化させなさい。ペア 30 mg の重量を量る精巣の精細管をインキュベート以下、30 分、60 分の 30-45 分と大きい精巣の 31 に 50 mg の重量を量る精巣のペアから尿細管。単一の精巣の時間を変更しないでください。
    注: 最適な培養時間は実験者、使用する試薬、分析されてマウスの経験によって異なります。
  6. なして精細に培養が、一方ラベル番号、スライド番号、および日付のマウスと precleaned スライドの曇らされた端にマーカーや鉛筆を使用します。その後固定液を含む Coplin jar に事前にクリーンアップされたスライドを配置します。
  7. 次の孵化、きれいなペトリ皿に約 3 mm の直径の塊に別の尿細管尿細管となしてを注ぐ。各束をもたらす 2 つのスライドとスライドが得られた数は精巣のサイズによって異なります。
    注: 我々 は野生型、subfertile Chtf18から 6 スライド 8 スライドを取得-(これは減数分裂と有糸分裂生殖細胞8の減らされた数のためにより小さい) P16 精巣は null。100 mg 以上の重量を量る 1 成人の精巣は 16 スライドを生成するために期待されます。
  8. 場所 23 μ テフロンの一つの指輪に 100 mM ショ糖プリント、3 スライド ・ リング、リングに精細管の 1 つの塊を追加します。 使用して鉗子先端に塊を保持するソリューションが曇りになるまで優しくサイズ 11 かみそりの刃と尿細管をミンチします。
    これが断片化された染色体に起因するので、注: を行う overmince ないです。断片化された染色体が突然変異体の表現型を示すものもかもしれないことに注意してください。
  9. 残骸を取除く、ショ糖液の別 23 μ l 添加し、マイクロ ピペットを使用して優しくピペットの混合物を上下に数回に懸濁液で細胞を分離に役立ちます。
  10. Coplin jar を含む固定液に浸漬スライドを削除し、その 1 つの寛大な液滴にスライドの下で収集 jar をかけてスライドを傾けます。
    1. ピペット 20 μ L プレミアム定着性の液滴にテフロン印刷 3 リング スライドのリングからショ糖細胞懸濁液のつや消し、スライド ガラスとピペット 2 - 上下停止 3 回。
      これにスクロース細胞懸濁液の 20 μ L 添加 (2.11 下記参照) 混合物を広めるときに、スライド全体にカバレッジをできるように、特定注:、定着性の液滴はボリュームで十分に大きいはずです。
  11. スライドの長さに沿って細胞懸濁液を普及する液滴の反対側にスライドをゆっくりと傾けます。スライドをゆっくりと傾けるそれを完全にカバーするスライドの幅に沿って細胞懸濁液を広めるに戻る。セルが互いに重複スライドよりも一度それ以外の同じ領域上の懸濁液を拡散しないでください。
  12. すぐに加湿チャンバー スライドをフラットにし、精細管のすべての塊まで 2.8 を 2.11 手順はスライドを作るに使用されているを繰り返します。乾燥過程で引き裂くとセルの重複を避けるために加湿チャンバーを移動することが重要です。
  13. 彼らはゆっくりと完全に乾燥、2.5 時間室温で覆われた加湿チャンバー内インキュベートするスライドを許可します。湿度が高いとここでゆっくり乾燥 chromatin の十分な広がりを確保するため重要です。さらに 30 分完全に風乾するスライドを許可し、チャンバーのカバーを取り外します。
  14. 0.4% 写真 Flo 200/1 × PBS 溶液 Coplin jar にスライド (に戻るまたはジグザグ パターンで) とスライドの 2 回、各 5 分を洗って、シェーカーを回転プラットフォーム上 jar、Coplin を優しく攪拌により。各洗浄のため新鮮なソリューションを使用して、各洗浄のため別の jar ファイルに別のマウスからスライドを維持します。
  15. 洗浄は攪拌しながら一度 5 分 0.4% 写真 Flo 200/dH2O ソリューションを含む Coplin jar に滑る。
  16. Coplin から削除スライドは、jar (最後の洗浄)、慎重にエッジと余分な液体を削除するスライドの底を一掃し、乾燥する角度、ほぼ直立位置にスライドを配置します。このテクニックの上手な人実験者は処理し、1 日で 4 または 5 のマウスから表面拡散核を準備できます。
  17. 一度乾燥 (15-20 分)、免疫組織染色法や 3 週間の最大の光から保護する密閉スライド ボックスには-80 ° C でストアにすぐにスライドを処理 (評価される; ターゲット蛋白質によって最適な結果がある場合取得します。ステンド グラス、同じ日または 2 週間以内)。
    1. -80 ° C で保存されている場合は、室温に来るし、汚れる前に 5 分間 X PBS またはブロック 1 を含む Coplin jar で洗うスライドを許可します。
      注: 多くの異なる蛍光染色プロトコルは良い結果を提供します。免疫染色プロトコル8バーコウィッツらするを参照してください。

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結果

多数面の広がりそのまま同族体を含む核を提供するためにこのメソッドの機能は 3 つの主な要因に依存: 1) 十分に得るために低張性バッファー (すなわち HEB) で精細管の適切な培養時間膨らんだ状態バーストがから崩壊しない核は延長なし、2 で潜伏) micropipetting なく固まっている、核と 3 の分けられた懸濁液を取得するセルのショ糖粒) 各固定液を傾斜被覆では一度に 1 つの方向にスライド前後はないです。準備が整うと、表面拡散核興味の蛋白質に蛍光に分類された抗体と immunostained をすることができ、撮像顕微鏡 (代表例を図 1および図 2に。図 1 (A) に均等に immunostained、なして長すぎる (B) 培養により現われる同族体ボロボロを含む核も広がっている野生型 pachytene 核の例を示します、不完全重複の (C)、核と核を含む精細管 (D) の"...

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ディスカッション

広がり、良い品質精母細胞核の高い数字を得るためには、このプロトコルの最も重要な手順なして、適切な精細管のミンチで精細管の適当な培養時間は含まし、技術を採用ショ糖細胞懸濁液を固結被覆スライドに します。我々 は生後 15 大人なしてに 45 分の比較的高齢者Chtf18から精巣中に至る野生型男性の精巣の精細管を孵化させなさい-null マウスはわずか 30 分インキュベート、精巣が半分のサイズは、含まれているため著しく少ない生殖細胞8。我々 の経験、 Chtf18の潜伏で-細胞、不十分な解決の同族体の結果の整合性が損なわれます 30 分より長いために精巣を null。精細管だけが曇りショ糖細胞懸濁液を得るためみじん切りにして、各スライドは (2.10 参照) を拡散する前に定着剤の寛大な液滴を含める必要があります。スライドは、前後ない、同時に 1 つの方向に傾いています。メソッドは最適ですけど、それに減数分裂を勉強することは前期のサブステージに主に限られた私。ただし、premeiotic S 期、観察することができるし、されている I および II 中期核...

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開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

著者は、アビゲイル ・ ハリス ・の技術的な支援を認めます。彼らはまたマウス精母細胞から表面拡散核の準備のプロトコルを最適化するを助けるためポーラ ・ コーエン、キム ・ ホロウェイを認めます。著者は、カレン シンドラーによって原稿の批判的読解を感謝しています。

この作品は NIH R01 GM106262 K.M.B. に支えられ

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Photo-Flo 200Kodak1464510
16% パラホルムアルデヒド (ホルムアルデヒド水溶液)Electron Microscopy SciencesRT 157101X PBS で 16% 溶液を 4% ワーキングストックに希釈し、アリコートを -20 °C で凍結します。C
テフロンは3リングスライド電子顕微鏡科学63418-11
プレミアム未充電のつや消し端ガラススライドいくつかの商業ブランドチルまたはイソプロピルアルコールでスライドをきれいにし、使用前に乾燥を滴下することができます。 スライドのその後の使用に応じて、油性マーカーまたは鉛筆でつや消し端にスライドにラベルを付けます
外科用ハサミ(鋭く、鈍い先端)ファインサイエンスツール14001-12類似したタイプの異なるブランドが機能します
細い先端の外科用ハサミ(鋭い先端)ファインサイエンスツール14058-11同様のタイプの異なるブランドが機能します
ストレートファインチップ鉗子ファインサイエンスツール11050-10同様のタイプの異なるブランドが機能します
湾曲した中先端鉗子フィッシャー16100110同様のタイプの異なるブランドが機能します
メスのハンドルファインサイエンスツール10003-12同様のタイプの異なるブランドが機能します
マウス抗SYCP3Abcam ab976721:300で使用
抗セントロメアタンパク質(ヒトCREST患者血清に由来)抗体 組み込まれ15-234-00011:50で使用
加湿チャンバー私たちはNuncスクエア培養皿500 cm2 /ウェルを湿らせた紙で使用しますタオル
落射蛍光法付き広視野顕微鏡ライカマイクロシステム任意の標準モデル
コプリンジャーいくつかの商業ブランド容量50 ml、直径40 mm(1.6インチ)、スライド10個を保持(背中合わせ)
ペトリ皿いくつかの商業ブランド直径100 x 15 mm、ポリスチレン滅菌未処理
エた

参考文献

  1. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
  2. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  3. Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
  4. Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
  5. Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
  6. Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
  7. Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
  8. Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996(2012).
  9. Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
  10. Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
  11. McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
  12. Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
  13. Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
  14. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
  15. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).

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